張良，杜蕾

（1.武漢市第一醫(yī)院，湖北 武漢 430000；2.武漢市中醫(yī)醫(yī)院，湖北 武漢 430000）

基底細胞癌（Basal cell carcinoma，BCC）是一種常發(fā)生在表皮或皮膚附屬器的皮膚惡性腫瘤[1]。中藥甘草是豆科植物甘草屬的干燥根及根莖。甘草有清熱解毒，祛痰化濕的效果，其機制涉及甘草的抗炎、解毒、調(diào)節(jié)免疫功能、抗氧化等作用[2]。甘草的活性成分主要為黃酮類和三萜類化合物[3]，已有研究證實其中異甘草素通過靶向miR-301b/LRIG1 信號抑制人類黑色素瘤生長[4]。但甘草及其活性成分對治療BCC 的相關(guān)機制還未研究。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從系統(tǒng)生物學(xué)的角度和生物網(wǎng)絡(luò)平衡的角度更全面闡釋疾病的的發(fā)生機制[5-8]。因此，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析甘草治療BCC 的潛在作用靶點和相關(guān)機制，并為指導(dǎo)評價甘草在治療BCC 中的臨床應(yīng)用價值提供證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 甘草的活性成分及靶點篩選 從中醫(yī)藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫分析平臺（TCMSP，https：//old.tcmspe.com/tcmsp.php）獲取甘草化學(xué)活性成分，根據(jù)藥物動力學(xué)（Absorption，distribution，metabolism and elimination，ADME）篩選，脂水分配系數(shù)（ALogP）＜5，Caco-2 滲透性≥-0.4，口服生物學(xué)吸收性（Oral bioavailability，OB）≥30%，類藥性（Drug-like ，DL）≥0.18。同時收集這些成分的作用靶點。

1.2 BCC 相關(guān)基因 使用“basal cell carcinoma”作為搜索詞，筆者合并了5 個數(shù)據(jù)庫中的疾病目標(biāo)，即GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/），OMIM（https：//omim.org/），TTD（https：//db.idrblab.org/ttd/），PharmGKB（https：//www.pharmgkb.org/）和Drugbank（https：//www.drugbank.ca）。

1.3 甘草活性成分作用靶點的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用Cytoscape 3.8.0 軟件構(gòu)建甘草活性成分-疾病靶標(biāo)的可視化網(wǎng)絡(luò)。韋恩分析（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）獲得藥物靶點與疾病靶點的重疊靶點，并構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)（https：//string-db.org/）。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點的拓撲特征，利用CytoNCA 以點度中心性（DC）、接近中心性（CC）和中介中心性（BC），≥中位數(shù)進行2 次篩選，獲得蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的核心靶點（Hubs）。

1.4 基因本體（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析 R 平臺上使用clusterProfiler 軟件包對甘草作用于BCC 的靶點進行GO 和KEGG功能富集分析。

1.5 分子對接 從PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載化學(xué)活性成分的2D 結(jié)構(gòu)，使用ChemBio 3D 軟件通過最小化能量來計算獲得3D結(jié)構(gòu)。從RCSB 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中獲得了蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)（http：//www.rcsb.org/pdb）。AutoDock Vina 對接軟件（版本1.5.6）進行分子對接模擬及分析，Py－MOL 軟件繪圖。

2 結(jié)果

2.1 甘草的活性化學(xué)成分及靶點 TCMSP 平臺獲取的甘草中的化學(xué)成分，以ADME 進行篩選，獲得81 個有效的活性化合物，見表1，以及相對應(yīng)的199個作用靶點。

表1 甘草中有效的活性化合物

2.2 BCC 相關(guān)基因及相關(guān)的甘草作用靶點 為了獲得疾病相關(guān)基因，筆者使用“基底細胞癌（Basal cell carcinoma，BCC）”作為搜索詞，在GeneCards，DrugBank，OMIM，PharmGKB 和TTD 中共檢索到7 196 個BCC 相關(guān)基因，見圖1A。

韋恩分析獲取189 個藥物靶點和疾病靶點的交集基因，作為甘草治療BCC 的潛在靶點進行后續(xù)分析，見圖1B。

圖1 BCC 相關(guān)基因和甘草作用靶點的韋恩分析

2.3 甘草活性成分與疾病相關(guān)靶點調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 甘草活性成分和疾病靶點網(wǎng)絡(luò)圖由268 個節(jié)點（與疾病基因交集后獲得79 個活性成分及189 個靶點）和1 292 個邊組成。網(wǎng)絡(luò)中與節(jié)點相連的邊數(shù)以連接度（Degree）表示，連接度越高，代表該節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中起主導(dǎo)作用。通過網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)分析，結(jié)果顯示槲皮素、山奈酚、柚皮素和甘草查爾酮甲在網(wǎng)絡(luò)中的連接度高，表明其是治療BCC 的主要活性成分，見圖2。

圖2 甘草活性成分和疾病靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)圖（DDN）

從靶點角度分析，38 個化合物靶向PTGS2，37個靶向 ESR1，32 個靶向 AR，31 個靶向HSP90AB1，30 個靶向PPARG，表示這幾個靶點最容易受甘草的調(diào)控。

3.4 甘草作用BCC 的靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分析 從String 數(shù)據(jù)庫中獲得189 個甘草作用BCC 的靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)，可信度>0.9，并刪除和其他靶點無相關(guān)的節(jié)點，利用Cytoscape 軟件進行可視化分析。網(wǎng)絡(luò)包括166 個節(jié)點和714 個邊，見圖3A，利用CytoNCA插件，通過2 次中位數(shù)篩選，獲得15 個Hubs，分別為 MAPK1/3/8/14、AKT1、ESR1、EGFR、TP53、RB1、RELA、STAT3、FOS、JUN、CCND1 和MYC，其相互作用關(guān)系見圖3B。

圖3 藥物作用靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)

3.5 藥物作用BCC 靶點的GO 富集和KEGG 富集分析 為了更好地理解189 個交集靶基因的生物學(xué)功能，利用R 平臺的clusterProfiler 軟件包進行GO 和KEGG 功能富集分析。圖4 分別顯示了生物過程（BP）、細胞成分（CC）和分子功能（MF）中的前10 個相關(guān)功能。結(jié)果表明，甘草的靶點主要參與細胞對氧化應(yīng)激、化學(xué)應(yīng)激、藥物和脂多糖等反應(yīng)的生物學(xué)過程；細胞成分主要為膜結(jié)構(gòu)組成部分、激酶組成等；分子功能方面涉及核受體活性配體的激活，轉(zhuǎn)錄分子結(jié)合，磷酸酶結(jié)合，泛素樣蛋白激酶結(jié)合、藥物結(jié)合、類固醇結(jié)合等。

圖4 交集基因的GO 富集分析

KEGG 功能富集結(jié)果顯示，交集基因參與170條信號通路，圖5 展示了排名前20 個通路，包括癌癥相關(guān)信號通路（化學(xué)致癌-受體激活，化學(xué)致癌-活性氧，前列腺癌，胰腺癌等），感染相關(guān)的信號通路（乙型肝炎，丙型肝炎等），此外還有免疫調(diào)節(jié)相關(guān)信號通路[白細胞介素-17（IL-17）信號通路，腫瘤壞死因子（TNF）信號通路，輔助性T 細胞17（Th17）細胞分化]。圖6 顯示的是化學(xué)致癌-受體激活信號通路，其中紅色節(jié)點為甘草調(diào)控BCC 的作用靶點。

圖5 交集基因的KEGG 富集分析

圖6 交集基因在化學(xué)致癌-受體激活信號通路上的分布

3.6 分子對接分析Hubs 與甘草活性成分的相互作用 為了驗證甘草的調(diào)控機制，筆者選擇了交集靶點PPI 分析中的Hubs，通過分子對接進行驗證其與重要的活性成分的相互作用。AutoDock 分析獲得結(jié)合自由能，結(jié)合自由能越低，結(jié)合構(gòu)象越穩(wěn)定，分子間有較強的結(jié)合活性（＜-5 kcal/mol）。MAPK1、MAPK3、STAT3、AKT1、JUN 和CCND 與甘草中重要的活性成分之間的結(jié)合自由能均較低，見表2。

表2 Hubs 與甘草活性成分的結(jié)合自由能

筆者對Hubs 和活性成分相互作用的最近構(gòu)象進行可視化分析。槲皮素、柚皮素和甘草查爾酮甲均可以很容易地進入并結(jié)合MAPK1 的活性口袋，并與相鄰氨基酸有多個氫鍵，表示結(jié)合構(gòu)象的穩(wěn)定，見圖7。

圖7 分子對接結(jié)果可視化

3 討論

BCC 是最常見的皮膚惡性腫瘤，手術(shù)治療是基底細胞癌的首選方案，但對于轉(zhuǎn)移基底細胞癌或晚期基底細胞癌需要使用藥物治療。中藥及其生物活性成分在癌癥治療中的應(yīng)用已有相當(dāng)長的一段時間，并且有多靶點藥理作用和較少的不良反應(yīng)的特點。甘草是治療BCC 重要的中草藥，出現(xiàn)在治療的經(jīng)驗方劑中，甘草活性成分復(fù)雜，已有研究表明甘草的活性成分對腫瘤有治療作用包括甘草苷，甘草素、光甘草定，異甘草素，甘草查而酮等[3]，但甘草抗腫瘤的具體作用機制不清。因此本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)系統(tǒng)性探索甘草治療基底細胞癌的機制，促進甘草在臨床上的應(yīng)用。

在TCMSP 數(shù)據(jù)庫顯示甘草有280 個化合物成分，通過ADME 篩選能在體內(nèi)發(fā)揮作用的成分[8]，通過與疾病相關(guān)基因交集，最后獲得能影響B(tài)CC 相關(guān)基因的79 個有效活性成分，及189 個靶標(biāo)。筆者的結(jié)果提示甘草中槲皮素，山奈酚、柚皮素和甘草查爾酮甲是主要發(fā)揮治療BCC 作用的活性成分。已有研究證實槲皮素通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT/mTOR 和MAPK/ERK1/2 通路促進細胞活力喪失、凋亡和自噬，從而發(fā)揮抗癌作用[9]。山奈酚有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等活性，并已應(yīng)用于癌癥化療，其作用機制包括使細胞周期停滯在G2/M 期、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)標(biāo)志物的下調(diào)和影響PI3K/ PKB 信號通路[10]。柚皮素聯(lián)合柚皮苷可以克服癌癥中不同防御機制導(dǎo)致的多藥耐藥性，通過多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)揮廣譜抗腫瘤作用[11]。甘草查爾酮甲通過調(diào)節(jié)癌細胞的代謝過程發(fā)揮抗腫瘤作用和/或作為化學(xué)增敏劑[12]。這些研究提示甘草的多成分協(xié)同發(fā)揮抗癌作用。

甘草的作用靶點和BCC 靶點交集基因的KEGG 功能富集結(jié)果證明了甘草參與多種癌癥相關(guān)信號通路的調(diào)節(jié)。同時通過對藥物靶點和疾病靶點的交集靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)分析，鑒定了15 個甘草治療BCC 的Hubs。其中AKT1、FOS、JUN、RELA、CCND1、EGFR、MAPK1、MAPK3、MAPK8、STAT3、TP53、MYC 參與癌癥代謝通路（癌癥中的代謝途徑）影響持續(xù)性血管新生、細胞凋亡、增殖、細胞周期、分化阻滯等生物學(xué)過程，發(fā)揮治療腫瘤的作用。MAPK 家族參與調(diào)節(jié)多種細胞過程，包括細胞增殖、分化、存活、凋亡和炎性反應(yīng)，其中MAPK8 通路的失調(diào)與多種免疫疾病和癌癥有關(guān)[13]。EGFR 是許多上皮惡性腫瘤的預(yù)后生物標(biāo)志物，激活不同信號通路的重要啟動子，導(dǎo)致細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[14-15]。CCND1 參與調(diào)控細胞周期，BCC 中的PTCH1 突變可導(dǎo)致CCND1 的mRNA 水平的降低[16]。TP 53 基因的失活參與細胞周期停滯和程序性細胞死亡的活化[17]。已在50%的人類癌癥（包括所有皮膚癌）中檢測到失活的TP 53 基因改變。STAT3 在人類非黑色素瘤皮膚癌（NMSC）中的表達增加[18]，是IL-6/JAK/STAT3 通路的關(guān)鍵組成部分。因此，甘草能主要通過抑制細胞的增殖遷移，并調(diào)控細胞凋亡發(fā)揮看腫瘤的作用。本研究中的分子對接結(jié)果也顯示作為多種與細胞增殖相關(guān)的信號通路的關(guān)鍵因子MAPK1可與甘草中重要的3 個活性成分槲皮素，柚皮素和甘草查爾酮甲相結(jié)合。

BCC 是一種免疫原性腫瘤[19]，以密集的淋巴細胞浸潤為特征[20]。本研究發(fā)現(xiàn)甘草的靶點參與免疫相關(guān)信號通路，如IL-17 信號通路，TNF 信號通路，Th17 細胞分化。IL-17 是一種促炎細胞因子，在癌癥發(fā)病機制中起重要作用，研究發(fā)現(xiàn)BCC 患者血清中IL-17 水平升高[21]。最近的一項研究表明IL-23/Th17 相關(guān)細胞因子在BCC 中的潛在作用[22]。Hubs中的AKT1，RELA，F(xiàn)OS，MAPK3/8/14 還參與炎性調(diào)控通路如Toll 樣受體信號通路，為甘草的抗炎作用提供證據(jù)。其中MAPK8 作為免疫細胞分化和激活的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，已有研究表明其參與多種免疫反應(yīng)，MAPK8 激活促進發(fā)育中胸腺細胞的凋亡并調(diào)節(jié)T 細胞分化和存活[23]。因此，甘草可以通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境的免疫反應(yīng)，發(fā)揮抑制腫瘤發(fā)展的作用。

綜上，本研究以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，系統(tǒng)研究甘草對治療BCC 的潛在活性成分，關(guān)鍵因子，影響的信號通路及相應(yīng)的作用機制。并結(jié)合分子對接分析方法，驗證了甘草對關(guān)鍵基因的作用。結(jié)果表明甘草可以通過抑制腫瘤細胞增殖遷移，影響細胞凋亡，調(diào)控腫瘤微環(huán)境的免疫細胞亞群的功能，從而發(fā)揮抗BCC 作用。