周連仲 劉 沖 蘇 玢 王明輝

天津市第四中心醫(yī)院 南開大學(xué)附屬第四中心醫(yī)院 天津市耳鼻咽喉頭頸外科醫(yī)院 1 耳鼻咽喉頭頸外科 2 麻醉科 300140

軟骨調(diào)節(jié)素(ChM)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種軟骨源性生長因子，分為ChM-Ⅰ、ChM-Ⅱ、ChM-Ⅲ三種，其中ChM-Ⅰ是ChM家族中效應(yīng)最強(qiáng)的一種軟骨特異性生長因子，它不僅是一種軟骨細(xì)胞生長刺激因子，而且是一種血管內(nèi)皮細(xì)胞生長抑制劑。Hiraki 等[1]發(fā)現(xiàn)ChM-Ⅰ在體外抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和管狀形態(tài)的形成，證明ChM-Ⅰ可維持軟骨的無血管特征。其抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和管狀形態(tài)的形成的作用已得到了實(shí)驗(yàn)的證明，對(duì)這一作用的產(chǎn)生機(jī)制也有相關(guān)的報(bào)道。 Hayami T等將人軟骨肉瘤OUMS-27細(xì)胞植入裸鼠，在腫瘤組織中檢測到大量的軟骨基質(zhì)[2]，植入30d后，發(fā)現(xiàn)腫瘤具有誘導(dǎo)血管形成的作用。局部應(yīng)用重組的人ChM-Ⅰ后，幾乎完全阻斷血管長入和腫瘤生長。在體內(nèi)ChM-Ⅰ同樣抑制了HT-29結(jié)腸腺癌的生長。 李琪等人[3]用人重組的ChM-Ⅰ 蛋白治療骨肉瘤也得到了同樣的結(jié)果。提示在實(shí)體腫瘤的治療過程中，ChM-Ⅰ抑制血管形成起了關(guān)鍵的作用。Mera H等人通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了ChM-Ⅰ除了有間接抑瘤作用外，還可直接的抑制腫瘤細(xì)胞的生長[4]。其直接抑瘤作用是通過抑制STAT的轉(zhuǎn)錄這一信號(hào)途徑來實(shí)現(xiàn)的。這一發(fā)現(xiàn)為腫瘤治療提供新的方向。本實(shí)驗(yàn)擬構(gòu)建pcDNA3.1(+)/ChM-Ⅰ 表達(dá)質(zhì)粒，為研究ChM-Ⅰ的生物學(xué)作用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 SD大鼠、XL1-Blue感受態(tài)菌、TaKaRa RNA PCR Kit (AMV)Ver.3.0試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒(碧云天)、1%瓊脂糖凝膠等。

1.2 方法

1.2.1 大鼠ChM-Ⅰ目的基因的獲取。取大鼠軟骨組織，通過液氮研磨，Trizol法提取大鼠軟骨組織總RNA,溶于60μl的DEPC水中, -80℃保存。具體步驟如下：取100mg的大鼠軟骨組織，通過液氮研磨，徹底勻漿；轉(zhuǎn)入1.5ml EP管，加入1ml Trizol，顛倒混勻10次，室溫靜置5min；EP管內(nèi)加入200μl氯仿(總體積的1/5)充分混勻15s，待乳化后靜置15min；4℃12 000r/min離心15min；吸取上層水相至新的1.5ml EP管中，加等體積的異丙醇，充分混勻后，4℃過夜；4℃12 000r/min離心10min，棄上清，加預(yù)冷的75%乙醇1ml，4℃12 000r/min離心5min，倒置EP管于濾紙上，盡量除盡上清，室溫超凈臺(tái)內(nèi)干燥5min；加入適量的DEPC水，指彈助溶，取2μl放入小的EP管進(jìn)行檢測濃度及純度定量，余-80℃保存；以大鼠軟骨組織總RNA作為模板， Oligo dT作為引物，用逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV于42℃逆轉(zhuǎn)錄40min；設(shè)計(jì)大鼠ChM-Ⅰ基因特異性的引物，在兩條引物上分別設(shè)計(jì)了限制性酶切位點(diǎn)(HINDⅢ和NOTI)以便定向克隆。上游引物為：5’GCAGACAAGCTTATGACAGAGAACTCGGACA 3’下游引物為:5’GCAGACGCGGCCGCTTACACCATGCCCAAGATG 3’；以RT產(chǎn)物為模板，加入上下游引物。用TaKaRa RNA PCR Kit (AMV)Ver.3.0試劑盒進(jìn)行PCR，具體步驟參見試劑盒說明書；用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增的結(jié)果。

1.2.2 大鼠ChM-Ⅰ PCR產(chǎn)物與pcDNA3.1(+)質(zhì)粒的連接、鑒定。 PCR產(chǎn)物純化：使用碧云天PCR產(chǎn)物純化試劑盒，步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行，最終洗脫體積40μl；純化后PCR產(chǎn)物及pcDNA3.1(+)質(zhì)粒酶切；酶切產(chǎn)物上樣至1% 瓊脂糖凝膠，電泳至適當(dāng)位置后，紫外燈下切膠回收；回收線性化的載體片段；回收后的膠塊采用DNA凝膠回收試劑盒(碧云天)，步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行，最終洗脫體積40μl；對(duì)回收后的PCR片段及pcDNA3.1(+)質(zhì)粒定量后，進(jìn)行DNA連接反應(yīng)；取10μl連接產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化XL1-Blue感受態(tài)菌，轉(zhuǎn)化后菌鋪至LB-Ampr+平板，37℃溫箱孵育過夜；挑取平板上長出的單克隆至LB-Ampr+液體培養(yǎng)基，37℃，200r/min，振蕩培養(yǎng)15h，提取細(xì)菌培養(yǎng)物中的質(zhì)粒。步驟按照小量提取質(zhì)粒的方法進(jìn)行(質(zhì)粒提取純化試劑盒，碧云天)；進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并送天津塞爾生物科技有限公司進(jìn)行測序。

2 結(jié)果

2.1 大鼠ChM-Ⅰ目的基因凝膠電泳結(jié)果 將通過大鼠軟骨組織獲得的ChM-Ⅰ PCR產(chǎn)物，在1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，分離得到ChM-Ⅰ目的片段 。在1 100bp處可看到較清晰的條帶，與設(shè)計(jì)的引物應(yīng)得到的產(chǎn)物相符。見圖1。

圖1 ChM-Ⅰ目的基因凝膠電泳圖譜

2.2 陽性克隆的酶切鑒定 挑取的三個(gè)陽性克隆，在LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，雙酶切質(zhì)粒，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切產(chǎn)物，結(jié)果顯示三個(gè)陽性克隆株的細(xì)菌提取的質(zhì)粒均已連接目的基因。見圖2。

圖2 重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物凝膠電泳圖譜

2.3 陽性克隆的測序鑒定 重組質(zhì)粒送至天津賽爾生物技術(shù)公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果顯示序列無誤，且讀碼框正確。見圖3。

圖3 重組質(zhì)粒中插入片段ChM-Ⅰ的測序結(jié)果

3 討論

腫瘤生長及轉(zhuǎn)移依賴于新生血管的形成，以便為腫瘤的生長提供必要的營養(yǎng)成分，同時(shí)也帶走腫瘤代謝產(chǎn)物。腫瘤血管形成是一個(gè)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過程，需要多種微環(huán)境的相互作用，其中包括腫瘤周圍間質(zhì)成分和內(nèi)皮細(xì)胞的移位、增殖、重塑及吻合，且受多種因子調(diào)節(jié)。

研究表明[5]，ChM-Ⅰ的抗血管生成特性可以抑制腫瘤的生長、傳播和轉(zhuǎn)移，這表明ChM-Ⅰ功能的喪失可能會(huì)誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生。ChM-Ⅰ已被證明可以抑制體內(nèi)人骨肉瘤細(xì)胞的生長和增殖，并抑制體外人骨肉瘤細(xì)胞的侵襲和遷移。ChM-Ⅰ可增強(qiáng)體外ES (兒童骨惡性腫瘤)細(xì)胞的侵襲性潛力，并可通過調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶9表達(dá)來促進(jìn)體內(nèi)ES肺轉(zhuǎn)移。此外， ChM-Ⅰ在體外和體內(nèi)能抑制內(nèi)皮分化，但在體內(nèi)腫瘤樣本中沒有觀察到血管發(fā)生的差異，這表明ChM-Ⅰ對(duì)血管發(fā)生的調(diào)節(jié)似乎并不能增強(qiáng)ES轉(zhuǎn)移[6]。作為ES惡性腫瘤的一種增強(qiáng)劑，ChM-Ⅰ是一個(gè)值得進(jìn)一步研究的主要治療靶點(diǎn)。臨床研究表明，ChM-Ⅰ-異種T細(xì)胞受體(TCR)轉(zhuǎn)基因T細(xì)胞以骨髓轉(zhuǎn)移為家，并可能導(dǎo)致無移植與宿主病(GvHD)的部分疾病回歸，未來仍需要進(jìn)行臨床研究[7]。研究發(fā)現(xiàn)ChM-Ⅰ在胃癌中的表達(dá)下調(diào)，ChM-Ⅰ似乎是一種潛在的腫瘤抑制劑，這也可能成為胃癌治療和預(yù)后的重要生物標(biāo)志物[8]。ChM-Ⅰ的抗血管生成特性可能會(huì)導(dǎo)致對(duì)腫瘤進(jìn)展的抑制作用。ChM-Ⅰ似乎還能夠通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)水平來抑制乳腺癌細(xì)胞的生長，因此可能對(duì)治療乳腺癌有潛在的臨床應(yīng)用。ChM-Ⅰ在多種內(nèi)分泌腫瘤(MEN)中有所表達(dá)，在多形性腺瘤的發(fā)病機(jī)制研究過程中，也檢測到ChM-Ⅰ的表達(dá)，這表明它有可能參與多形性腺瘤的低血管性和軟骨體的形成。在細(xì)胞水平上，ChM-Ⅰ似乎能夠通過以劑量依賴關(guān)系促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制腫瘤細(xì)胞的生長來表現(xiàn)出雙重作用。低濃度的ChM-Ⅰ似乎可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的生長，而高濃度的ChM-Ⅰ抑制了腫瘤細(xì)胞的生長和遷移，如人宮頸癌(HeLa)細(xì)胞和人神經(jīng)母細(xì)胞瘤(SH-SY5Y)細(xì)胞，并抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)的增殖和血管生成[9]。人重組的ChM-Ⅰ(rhChM-Ⅰ) 蛋白可以阻斷VEGF-A介導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移這一步驟，此步驟是血管形成中的關(guān)鍵的調(diào)控步驟。這一作用與細(xì)胞伸展的阻滯和在VEGF-A刺激下的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的斷裂重組有關(guān)。我們可以通過提高腫瘤周圍間質(zhì)中ChM-Ⅰ的濃度，阻斷VEGF-A介導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移過程，抑制腫瘤血管的生成，進(jìn)而達(dá)到阻止腫瘤細(xì)胞生長、轉(zhuǎn)移，最終起到治療腫瘤的作用。研究表明[10-11]，ChM-Ⅰ可以通過抑制細(xì)胞表面相關(guān)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)-磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B(PI3K-AKT)信號(hào)復(fù)合物的形成，從而誘導(dǎo)人鼻咽癌(NPC)細(xì)胞凋亡。參與ChM-Ⅰ癌癥發(fā)病機(jī)制的細(xì)胞和分子信號(hào)通路基本未知，仍需要進(jìn)一步研究?？偟膩碚f，這些發(fā)現(xiàn)提示ChM-Ⅰ在各種癌癥的發(fā)病機(jī)制中起作用，與ChM-Ⅰ調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞分化和抗血管生成特性有關(guān)。ChM-Ⅰ在癌癥發(fā)病機(jī)制中的作用需要進(jìn)一步的研究，以開發(fā)其作為癌癥治療的新靶點(diǎn)。

在本實(shí)驗(yàn)過程中，大鼠軟骨總RNA的提取是影響實(shí)驗(yàn)成功與否的重要因素，只有得到質(zhì)量佳純度高的軟骨總RNA樣本，才能更好地?cái)U(kuò)增目的基因。提取RNA的方法很多[12]，各有優(yōu)缺點(diǎn)，經(jīng)過比較并結(jié)合本實(shí)驗(yàn)的實(shí)際需要，筆者采用傳統(tǒng)Trizol法來提取大鼠軟骨RNA，此種方法實(shí)驗(yàn)操作相對(duì)簡單，實(shí)驗(yàn)成本較低，使用更為廣泛。通過本次實(shí)驗(yàn)，筆者發(fā)現(xiàn)在對(duì)軟骨進(jìn)行RNA提取時(shí)，應(yīng)該注意以下幾點(diǎn)：(1)軟骨的取材和保存。在取材過程中，我們應(yīng)該對(duì)所有可能與軟骨接觸的物件進(jìn)行去RNA酶處理，以防止RNA的降解，手術(shù)器械必須經(jīng)高溫消毒，170℃，6h的高溫消毒是可靠的，對(duì)所取下的軟骨應(yīng)立即用液氮保存來運(yùn)輸或立即放入-80℃保存。(2)正確的勻漿方法也很重要。本實(shí)驗(yàn)表明，為了分離到相對(duì)高純度的RNA，軟骨一定要在液氮中研磨成粉， 在加入裂解液后，要進(jìn)一步細(xì)細(xì)勻漿，直至2ml的注射器能夠完全吸取勻漿液，軟骨組織勻漿是否徹底也是保證RNA提取成功的關(guān)鍵步驟之一。(3)防止RNA的降解。RNA不穩(wěn)定，在環(huán)境中很容易降，因此在提取RNA時(shí)的操作環(huán)境也應(yīng)保持干潔，盡量保持在超凈臺(tái)中完成實(shí)驗(yàn)，同時(shí)實(shí)驗(yàn)人員需佩戴口罩、帽子等，這樣能夠最大限度地防止RNA的降解。高純度、不降解的軟骨總RNA樣本的獲得，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的成功奠定了基礎(chǔ)。

實(shí)驗(yàn)中所使用的pcDNA3.1(+)質(zhì)粒是由pcDNA3發(fā)展而來的質(zhì)粒載體，大小約5.4kb，其具有以下特點(diǎn)[13]：分子量相對(duì)較小，能在細(xì)菌內(nèi)穩(wěn)定存在，有較高的拷貝數(shù)；含有抗新霉素基因，其可以啟動(dòng)neo基因表達(dá)3’磷酸轉(zhuǎn)移酶，這種酶能夠分解新霉素和G418，從而使細(xì)胞獲得抗性而能在含有G418的選擇性培養(yǎng)基中生長，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染目的基因的細(xì)胞株；具有多個(gè)限制性內(nèi)切酶的單一酶切位點(diǎn)，便于外源基因的插入。除了具有以上的特點(diǎn)外，其還含有人巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子，使其在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)可以高水平表達(dá)。鑒于以上的優(yōu)點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)采用pcDNA3.1(+)來構(gòu)建pcDNA3.1(+)/ChM-Ⅰ質(zhì)粒。筆者設(shè)計(jì)特異性的ChM-Ⅰ引物時(shí)，分別于上下游引物上添加特異性的酶切位點(diǎn)，以利后續(xù)的連接與鑒定。為不影響引物與目的基因的特異性結(jié)合，在引物上引入酶切位點(diǎn)時(shí)，需要在引物的5’端引入。目的基因和質(zhì)粒進(jìn)行黏性末端鏈接，使其具有方向性，因此在引物中引入酶切位點(diǎn)時(shí)，要注意方向性，以保證目的基因的正確表達(dá)。使用雙酶切法消化融合目的基因片段和pcDNA3.1(+)，使目的基因與載體定向連接。在DNA連接過程中，筆者優(yōu)化了反應(yīng)條件，適量增加目的基因的比例，大大提高了連接效率。將轉(zhuǎn)化后得到的陽性克隆用雙酶切法進(jìn)行鑒定，酶切后釋放出的DNA片段大小與理論值相符，基因測序結(jié)果顯示序列無誤，且讀碼框正確，證明成功構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/ChM-Ⅰ。轉(zhuǎn)化后得到的陽性克隆除可采用酶切的方法進(jìn)行鑒定，還可以采用PCR的方法進(jìn)行鑒定。采用PCR的方法可以使用質(zhì)粒上的通用引物，也可以使用目的基因的特異性引物，PCR方法簡單易行，可以直接使用培養(yǎng)得到的細(xì)菌液做模板，無須進(jìn)行質(zhì)粒小提，效率更高，但可以產(chǎn)生假陰性，如目的基因中CpG含量較高，可能導(dǎo)致PCR擴(kuò)增時(shí)的失敗，從而對(duì)結(jié)果進(jìn)行誤判，產(chǎn)生假陰性。酶切法準(zhǔn)確性更高，但需要先提取質(zhì)粒，再進(jìn)行酶切，步驟相對(duì)煩瑣，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)的需要，筆者選擇使用酶切法進(jìn)行鑒定，以保證更高的準(zhǔn)確性。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建pcDNA3.1/ChM-Ⅰ表達(dá)載體，為后續(xù)建立穩(wěn)定高表達(dá)ChM-Ⅰ的細(xì)胞株，觀察ChM-Ⅰ對(duì)腫瘤組織血管形成的抑制作用和其對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用打下基礎(chǔ)，為腫瘤的靶向治療探索新的途徑及提供新的藥物靶點(diǎn)，進(jìn)一步提高腫瘤患者的生存期及生活質(zhì)量。