鐘曉勇，李 成，王 芳，陳 斌，梁 暉，阮 甦

福建中醫(yī)藥大學附屬人民醫(yī)院，福建 福州 350004

腦卒中是目前國內(nèi)外引起死亡的首要因素［1］。卒中后往往會引發(fā)持續(xù)性的神經(jīng)功能障礙，已經(jīng)成為影響國人健康和生活質(zhì)量的重要疾病，也為社會造成巨大的經(jīng)濟負擔。然而，目前卒中的臨床治療手段仍非常有限［2］。針刺是臨床治療缺血性卒中的有效補充手段，在急性期、恢復期、后遺癥及康復期均有顯著效果［3-4］。本課題前期研究表明，電針百會、神庭具有抗凋亡、抗氧化、促進生存因子表達等生物學作用，可以多通路、多靶點改善腦卒中模型大鼠的神經(jīng)功能及認知功能障礙［5-9］，但其具體作用機制仍需進一步闡明。

近期線粒體自噬在缺血性卒中后的神經(jīng)保護作用機制受到越來越多關注。線粒體自噬作為一種選擇性自噬，在清除受損線粒體、保護受損神經(jīng)細胞方面起著重要的作用。研究表明，腦缺血再灌注過程可激活線粒體自噬，清除損傷的線粒體，進而減少線粒體依賴的細胞凋亡［10-11］。此外，通過進一步促進線粒體自噬可減輕缺血引起的神經(jīng)損傷［12］，被認為是治療缺血性卒中的新靶點。近期WU 等［13］研究表明，逆轉(zhuǎn)BNIP3L 降解促進線粒體自噬在缺血性腦損傷中發(fā)揮著重要的神經(jīng)保護作用。已有研究表明電針可通過調(diào)節(jié)自噬對腦缺血再灌注大鼠產(chǎn)生神經(jīng)保護作用［14-16］，但目前尚未有線粒體自噬相關的作用機制研究。因此，本研究擬從電針調(diào)控BNIP3L 介導的線粒體自噬、減輕腦缺血再灌注損傷和細胞凋亡為研究切入點，為電針改善卒中后神經(jīng)功能障礙的作用機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物及分組造模

1.1.1 動物 選擇SPF 級雄性sprague-dawley（SD）大鼠60 只，體質(zhì)量（300±20）g，由上海斯萊克實驗動物責任有限公司提供［生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2017-0005］，恒溫恒濕，12 h 明暗光照交替，晝夜循環(huán)，飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學動物實驗中心。福建中醫(yī)藥大學動物實驗中心動物飼養(yǎng)環(huán)境許可證：SYXK（閩）2019-0007。

1.1.2 分組與造模 采用隨機數(shù)字表法將60 只大鼠隨機分為假手術(shù)組15只和手術(shù)組45只。所有大鼠術(shù)前禁食12 h 后，采用線栓法制備大鼠大腦中動脈線栓阻塞法（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型。具體方法參考Zea Longa 方法［17］：應用10%水合氯醛按0.35 g/kg 腹腔注射麻醉大鼠，麻醉后固定于定位儀上，切開右側(cè)頸部皮膚，分離并在根部結(jié)扎頸外動脈，從右側(cè)頸總動脈分叉下方約3～4 mm處剪一“V”形小口，將3 cm尼龍線插入，當有阻力時停止插入，此時尼龍線進入頸內(nèi)動脈約為18 mm，待缺血90 min 后拔出線栓再灌注，固定尼龍線并縫合皮膚。成功后2 h采用Zea Longa法［17］進行神經(jīng)功能缺損評分。評分標準：0 分，無神經(jīng)損傷癥狀；1 分，不能完全伸展對側(cè)前爪；2 分，外側(cè)（右）轉(zhuǎn)圈；3 分，向?qū)?cè)傾倒；4 分，不能自發(fā)行走，意識喪失，分值越高，損傷越嚴重。將1～3 分的大鼠納入正式實驗，0 分和4 分均認為模型不成功。假手術(shù)組將正常SD大鼠，麻醉后固定于定位儀上，切開右側(cè)頸部皮膚，只分離、暴露血管，不結(jié)扎，不插入尼龍線，縫合皮膚。手術(shù)組造模成功率約為70%，本次實驗共30 只大鼠造模成功，考慮均衡原則，進一步將造模成功手術(shù)組大鼠隨機分為模型組、電針組和電針＋3-MA 組，每組10 只。動物處理方法按照中華人民共和國科技部頒發(fā)的《關于善待實驗動物的指導性意見》執(zhí)行，并經(jīng)福建中醫(yī)藥大學醫(yī)學倫理委員會審定。

1.2 主要器材和試劑

LC3B、BNIP3L、SQSTM1、β-actin抗體（美國Cell Signaling Technology 公司）；TUNEL 試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；三甲基腺嘌呤（3-MA）（美國Sigma 公司），Pannoramic 掃描儀（匈牙利，3Dhistech）；華佗牌電針儀（SDZ-Ⅱ，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）；Gel DOC 2000 凝膠成像系統(tǒng)、APC 300電泳儀、水平電泳槽（美國BioRad公司）。

1.3 干預方法

①假手術(shù)組：飼養(yǎng)于普通籠中，只同等條件抓取，無電針刺激。②模型組：造模后飼養(yǎng)于普通籠，只同等條件抓取，無電針刺激。③電針組：電針大鼠百會、神庭，參照《實驗針灸學》［18］及華興邦制定的實驗動物穴位圖譜［19］。用華佗牌0.3 mm×13 mm毫針，30°斜刺入0.2 cm，隨后用華佗牌電針儀（SDZ-Ⅱ）通電干預。設置波形模式為疏密波，其中疏波4 Hz，密波20 Hz，輸出電壓2 V，輸出電流0.5 mA，以針體輕輕抖動為判斷電針得氣標準。電針干預于造模后24 h開始，每次治療時間為20 min，每天同一時間治療1 次，連續(xù)7 d。④電針＋3-MA組：在復灌注開始時，大鼠側(cè)腦室注射7.5 μg 3-MA，3-MA 在生理鹽水中加熱藥液至60～70 ℃充分溶解，降至常溫后注射（參考WEN 等［20］的方法），連續(xù)7 d。電針干預方法及治療參數(shù)同電針組。

1.4 取材及指標檢測

1.4.1 取材 干預7 d 后取材，各組大鼠在1%戊巴比妥的麻醉下行開顱，大腦組織取出后迅速置于-80 ℃冰箱保存或固定后制成石蠟標本保存，用于后續(xù)指標檢測。

1.4.2 神經(jīng)功能評分 造模后第1天、第3天、第5天、第7 天再次采用Zea Longa 法進行神經(jīng)功能評分（具體步驟詳見上述），評估神經(jīng)功能改善情況。

1.4.3 HE 染色 取各組大鼠梗死區(qū)域腦組織及梗死側(cè)海馬組織固定于10%福爾馬林中4～6 h，石蠟包埋，連續(xù)切片，厚4 μm，常規(guī)蘇木素伊紅（HE）染色，光鏡下觀察各組病理形態(tài)學改變。

1.4.4 Western blot 檢測LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達水平 取50 μg 左側(cè)大腦皮質(zhì)區(qū)腦組織，加入RIPA裂解液超聲下充分裂解后，采用Bradford 法蛋白質(zhì)定量，用15%聚丙烯酰胺凝膠電泳，考馬斯亮藍染色標記蛋白質(zhì)分子量標準，然后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，于封閉液中進行封閉，經(jīng)封閉洗滌后加入相應的單抗，4 ℃過夜孵育，洗滌，然后分別與生物素標記的IgG、辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素工作液（S-A/HRP）常溫孵育，DAB 顯色液顯色，蒸餾水清洗終止反應，圖像掃描。目的蛋白的表達量用內(nèi)參校正后的各組蛋白的灰度值與假手術(shù)組蛋白的灰度值比較。

1.4.5 組織免疫熒光檢測 將石蠟組織切片后，脫蠟，梯度脫水，滴加封閉血清，在濕盒中37 ℃封閉30 min。滴加第1 種一抗（BNIP3L）置濕盒中4 ℃孵育過夜，再用PBS 3 min×5次洗去一抗，用濾紙擦去標本外的PBS。滴加對應的HRP 標記二抗室溫置濕盒中避光孵育1 h，PBS 3 min×3 次洗去二抗，再加入CY3-TSA 孵育10 min。微波抗原修復后加入第2種一抗（SQSTM1），按上述步驟加入HRP和FICTTSA。最后滴加DAPI 避光孵育2 min 復染細胞核。用PBS 1 min×3次洗去DAPI，用濾紙擦去標本外的PBS。最后用含甘油封片，并在熒光顯微鏡下立即觀察。

1.4.6 電針對各組大鼠凋亡率的影響 將石蠟包埋的腦組織切片后，按常規(guī)方法進行脫蠟及水化，PBS漂洗2 次，加入蛋白酶K 工作液，37 ℃孵育30 min，隨后依次加入TdT 酶反應液、HRP 工作液、DAB 工作液進行標記和顯色反應。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料符合正態(tài)分布的以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析檢驗，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。方差不齊的情況下用Tamhane'sT2方法進行事后檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 電針對MCAO模型大鼠的神經(jīng)功能改善作用

造模2 h 后Zea Longa 法進行神經(jīng)功能缺損評分。圖1 可見造模2 h 后手術(shù)組大鼠神經(jīng)功能評分均顯著升高，評分均在1～3 分之間，提示手術(shù)造模成功。假手術(shù)組大鼠未表現(xiàn)出神經(jīng)功能缺損癥狀，評分均為0。造模干預后第1 天、第3 天、第5 天、第7 天再次進行神經(jīng)功能評分。在第7 天模型組及電針＋3-MA 組大鼠神經(jīng)功能評分仍顯著升高，與假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。而電針組大鼠在電針干預后神經(jīng)功能評分顯著降低，與模型組及電針＋3-MA 組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖1 4組大鼠神經(jīng)功能評分比較Figure 1 Comparison of neurological function scores in four groups

2.2 電針對MCAO 模型大鼠腦皮質(zhì)區(qū)病理形態(tài)的影響

假手術(shù)組可見神經(jīng)元胞體較大，多角形（多個突起），核著色淺，胞質(zhì)可見特征性結(jié)構(gòu)尼氏體；模型組神經(jīng)元皺縮，胞質(zhì)結(jié)構(gòu)不清，胞漿嗜依紅染色增強，尼氏體邊聚或消失，核固縮，有的胞體變形縮小，呈三角形，細胞周圍間隙增寬；電針組可以在一定程度上減輕缺血再灌注所致的病理損傷，而電針＋3-MA組則會阻斷電針的治療作用。見圖2。

圖2 4組大鼠腦皮質(zhì)區(qū)HE染色結(jié)果（×100）Figure 2 HE staining results of cerebral cortex of rats in four groups(×100)

2.3 電針對MCAO 模型大鼠皮層組織中自噬水平的影響

我們進一步采用LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ檢測了4 組大鼠皮質(zhì)中自噬激活水平，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ增加代表自噬激活。Western blot 結(jié)果表明，模型組大鼠LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平降低，與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；電針組的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平顯著升高，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。電針＋3-MA 組中使用自噬抑制劑3-MA 可以逆轉(zhuǎn)電針對LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達上調(diào)作用，且與電針組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖3。

圖3 電針對MCAO模型大鼠皮層組織中自噬水平的影響Figure 3 Effects of electroacupuncture on autophagy level in cortical tissue of MCAO model rats

2.4 電針對4 組大鼠皮質(zhì)區(qū)線粒體自噬水平的影響

線粒體自噬相關蛋白BNIP3L 和SQSTM1 表達和共定位的結(jié)果表明，模型組中皮質(zhì)梗死區(qū)域線粒體自噬水平缺失，表現(xiàn)為紅色熒光和綠色熒光強度弱；電針干預可以激活梗死區(qū)域神經(jīng)細胞的線粒體自噬，表現(xiàn)為紅色熒光和綠色熒光的表達增高及共定位增強（橘黃色）；應用3-MA 抑制劑干預后，電針干預對上述線粒體自噬激活的作用被逆轉(zhuǎn)。見圖4。

圖4 電針對MCAO 模型大鼠皮層組織中線粒體自噬水平的影響（×400）Figure 4 Effects of electroacupuncture on mitophagy level in cortical tissue of MCAO model rats(×400)

2.5 電針對4組大鼠皮質(zhì)區(qū)細胞凋亡率的影響

采用TUNEL 法檢測了各組大鼠皮質(zhì)中細胞凋亡水平，模型組大鼠凋亡率升高，與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而電針組的凋亡率降低，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；電針＋3-MA 組中使用自噬抑制劑3-MA 可以逆轉(zhuǎn)電針降低凋亡水平的作用，且與電針組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖5。

圖5 電針對4組大鼠皮質(zhì)區(qū)細胞凋亡率的影響（×400）Figure 4 Effect of electroacupuncture on apoptosis index of cortical region of rats in four groups(×400)

3 討 論

腦缺血再灌注損傷是一個復雜的病理生理級聯(lián)反應過程，包括神經(jīng)細胞內(nèi)鈣離子超載、脂質(zhì)過氧化、氧自由基損傷、凋亡基因激活、炎性細胞因子損害等［21］。線粒體作為細胞能量代謝的中心，在這些病理反應進程中起著核心作用。線粒體功能障礙在缺血性腦中風中已被證實是神經(jīng)元死亡的原因之一［22］。研究表明激活線粒體自噬可以及時清除腦缺血再灌注損傷模型大鼠神經(jīng)細胞中損傷的線粒體，減少線粒體依賴的細胞凋亡［10-11］。因此通過調(diào)控線粒體自噬對治療缺血性卒中具有重要的意義。其中BNIP3L 作為一類線粒體自噬受體蛋白，在細胞發(fā)育或病理條件下，可以通過與自噬泡相關蛋白LC3 結(jié)合促進線粒體自噬，在調(diào)控線粒體自噬中發(fā)揮著重要的作用［23］。研究發(fā)現(xiàn)BNIP3L 基因敲除可以顯著抑制腦缺血再灌注誘導的線粒體自噬，并且加重缺血性腦損傷［11］。近期研究表明，通過逆轉(zhuǎn)BNIP3L 降解促進線粒體自噬在缺血性腦損傷中發(fā)揮著重要的神經(jīng)保護作用［13］。這些結(jié)果提示通過調(diào)控BNIP3L 介導的線粒體自噬并且抑制神經(jīng)細胞凋亡是潛在的腦卒中治療干預靶點。前期實驗研究已證實針刺百會、神庭可以多通路、多靶點減輕MCAO 模型大鼠卒中后腦缺血損傷［9，24］，其機制可能與減輕線粒體損傷、保護受損神經(jīng)細胞相關［25］。此外有研究表明電針百會、神庭也可以通過調(diào)控自噬達到保護神經(jīng)細胞的功能［26-27］。但目前尚未有從調(diào)控線粒體自噬及細胞凋亡角度開展相關作用機制研究。因此，本研究以電針調(diào)控BNIP3L介導的線粒體自噬和凋亡為研究切入點，初步闡明電針減輕腦缺血再灌注損傷以及改善卒中后神經(jīng)功能障礙的作用機制。

本研究結(jié)果表明，MCAO 模型大鼠7 d后皮層組織中自噬水平較假手術(shù)組顯著降低，表現(xiàn)為LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白水平降低，提示手術(shù)組大鼠MCAO再灌注7 d 后由于皮層神經(jīng)細胞自噬水平的缺失，導致大鼠清除受損神經(jīng)細胞的能力下降。這與李建榮等［28］研究相似，該研究表明大鼠MCAO 造模后皮層自噬水平呈動態(tài)變化，在7 d 左右自噬水平下降。而電針組電針干預治療可以在一定程度上激活自噬，表現(xiàn)為電針組的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達水平顯著升高。這提示電針可以通過激活自噬，提高神經(jīng)細胞自我清除和保護能力。徐疏影等［14］研究結(jié)果亦提示電針可以通過激活自噬產(chǎn)生保護作用。為進一步闡明電針激活自噬保護受損神經(jīng)細胞的機制，本研究觀察了電針百會、神庭對一類選擇性自噬——線粒體自噬及相關調(diào)控蛋白BNIP3L表達的影響。研究結(jié)果表明電針可以提高線粒體自噬相關蛋白BNIP3L 和SQSTM1 的表達及共定位，表現(xiàn)為組織免疫熒光檢測中電針組大鼠皮質(zhì)組織中紅色熒光和綠色熒光的表達增高及共定位增強（橘黃色）。SQSTM1 是一種重要的選擇性自噬接頭蛋白，也是監(jiān)測自噬水平的重要自噬標志蛋白，其表達增高和線粒體自噬受體蛋白BNIP3L 共定位增強提示線粒體自噬水平提高。該結(jié)果提示電針激活自噬產(chǎn)生神經(jīng)保護作用的機制和其激活線粒體自噬相關，通過激活線粒體自噬，清除受損線粒體，進而減輕線粒體依賴的細胞凋亡，從而達到改善神經(jīng)功能評分和病理改變的目的。TUNEL 檢測結(jié)果、神經(jīng)行為學評分以及病理學結(jié)果均很好地證實了這一點。為驗證電針對線粒體自噬的激活作用以及神經(jīng)保護作用，我們在電針＋3-MA 組中使用自噬抑制劑3-MA 進行反向驗證，結(jié)果表明3-MA 可以逆轉(zhuǎn)上述電針對線粒體自噬的激活和抗凋亡作用，進一步驗證了電針的作用靶點。

綜上，本研究表明電針可以通過調(diào)控BNIP3L介導的線粒體自噬減輕腦缺血再灌注損傷和細胞凋亡，從而達到改善神經(jīng)功能預后的作用。但自噬途徑多樣，電針能否通過調(diào)控其他自噬相關通路產(chǎn)生神經(jīng)保護作用，其具體作用機制仍需進一步闡明。