張哲哲，齊 超，張曉玲，張孟田，劉紅曼(.廊坊市人民醫(yī)院麻醉科，河北 廊坊 065099；.廊坊市人民醫(yī)院消化科，河北 廊坊 065099)

隨著人們生活、飲食習(xí)慣的改變以及生態(tài)環(huán)境的破壞，結(jié)腸癌的發(fā)病概率逐年升高，篩選安全有效的抗結(jié)腸癌治療方案具有重要意義[1-2]。Rho家族成員大多數(shù)為三磷酸鳥苷酶，可參與惡性腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲等多種細(xì)胞功能活動[3-4]。其中，Ras同源基因家族成員A(RhoA)在肌動蛋白的重組中起重要作用，發(fā)揮支持細(xì)胞遷移活動的功能[5-6]。Rho家族下游重要的效應(yīng)分子之一為Rho相關(guān)卷曲螺旋蛋白激酶1(ROCK1)，研究結(jié)果表明，在多種惡性腫瘤中均存在RhoA和ROCK1蛋白表達(dá)的上調(diào)，促進(jìn)了腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移，影響患者預(yù)后[7-8]。右美托咪定在臨床上常用作鎮(zhèn)靜藥和輔助用藥，右美托咪定輔助麻醉治療可有效改善胃癌根治術(shù)患者的應(yīng)激反應(yīng)、炎癥因子水平[9]。目前，關(guān)于右美托咪定對結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的作用鮮有報道。本研究通過構(gòu)建結(jié)腸癌大鼠模型，使用不同劑量的右美托咪定對其進(jìn)行治療，探討右美托咪定對結(jié)腸癌大鼠的作用及其機(jī)制，為預(yù)防和治療結(jié)腸癌提供新的藥物靶點和研究思路。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF級SD大鼠(雌雄各半)，10～12周齡，體重200～240 g，購自斯貝福(北京)生物科技有限公司；動物生產(chǎn)許可證號為SCXK(京)2019-0010，動物質(zhì)量合格證號為HGB701216；飼養(yǎng)環(huán)境：溫度為(24±2) ℃，相對濕度為50%，自由攝水、攝食，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2 儀器

Wellwash型酶標(biāo)儀(上海沃元科技公司)；2009A型顯微鏡(哈爾濱康邦黑背景光學(xué)儀器有限公司)；SYS-DYCX-C型凝膠成像系統(tǒng)(遼寧賽亞斯科技有限公司)。

1.3 藥品與試劑

1,2-二甲肼(DMH)(上海物競化工科技有限公司，批號為579-73-5)；鹽酸右美托咪定注射液(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，規(guī)格為2 mL∶200 μg，批號為20201106)；大鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素1β(IL-1β)酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒，蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒，兔抗鼠RhoA、ROCK1、β-actin抗體，羊抗兔二抗(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號分別為ML-19037、ML-20674、ML-10843、ML-30179、ML-30255、ML-11327和ML-10559)。

2 方法

2.1 動物模型的制備

參照文獻(xiàn)[10]中的方法，通過DMH誘導(dǎo)結(jié)腸癌，預(yù)實驗成功制備結(jié)腸癌大鼠模型。造模周期為12周，每周于造模大鼠頸背部進(jìn)行1次皮下注射DMH溶液(溶劑為0.9%氯化鈉溶液)，劑量為25 mg/kg。未造模大鼠在同一位置同一時間點注射等體積溶劑。

2.2 實驗分組及給藥

取24只成模大鼠，隨機(jī)分為4組(每組6只)，即模型組、右美托咪定低劑量組、右美托咪定中劑量組及右美托咪定高劑量組。另取6只未造模大鼠作為正常組。右美托咪定低、中及高劑量組大鼠分別給予右美托咪定25、50及100 μg/kg腹腔注射，每周注射1次，連續(xù)4周[11]。正常組和模型組給予等體積0.9%氯化鈉溶液腹腔注射。各組大鼠注射體積均為10 mL/kg。

2.3 大鼠一般狀況觀察

給藥的4周內(nèi)，觀察大鼠的一般狀況，包括體重、精神狀態(tài)、肛門和大便情況。

2.4 酶聯(lián)免疫吸附法檢測大鼠血清炎癥因子水平

給藥周期結(jié)束后，采用3%戊巴比妥鈉腹腔麻醉大鼠，腹主動脈采血，血液收集于離心管并室溫(25 ℃)靜置30 min，隨后在3 000 r/min下離心10 min(離心半徑為8 cm)，收集上層血清，根據(jù)試劑盒說明書檢測大鼠血清中TNF-α和IL-1β水平。

2.5 解剖觀察腫瘤情況

給藥周期結(jié)束后，術(shù)前12 h將大鼠禁食，以3%戊巴比妥鈉腹腔麻醉并處死，剖開腹部后分離腸道及周圍淋巴結(jié)，切取全部結(jié)腸，仔細(xì)解剖并觀察，以無菌0.9%氯化鈉溶液輕柔沖洗，尋找腫瘤組織。取正常組大鼠部分正常結(jié)腸組織和其余各組大鼠部分結(jié)腸癌組織浸泡于4%多聚甲醛中固定24 h用于后續(xù)病理學(xué)觀察，另取正常組大鼠部分正常結(jié)腸組織和其余各組大鼠部分結(jié)腸癌組織經(jīng)液氮迅速冷凍后保存于-80 ℃用于蛋白質(zhì)印跡法分析。

2.6 HE染色觀察病理學(xué)變化

取“2.5”項下固定好的大鼠正常結(jié)腸組織和結(jié)腸癌組織，以PBS沖洗干凈，通過梯度乙醇脫水，再浸入二甲苯中進(jìn)行透明，將其包埋于融化的石蠟中，待完全凝固后，修整蠟塊并在切片機(jī)上進(jìn)行切片，厚度為5 μm，撈片后進(jìn)行65 ℃烤片。將石蠟切片通過二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，蘇木精染液染色，清水沖洗后，再經(jīng)1%鹽酸酒精分化處理，浸于伊紅染液中染色，水洗后經(jīng)梯度乙醇脫水，并通過二甲苯透明，最終使用中性樹膠封片。在顯微鏡下觀察并拍照。

2.7 蛋白質(zhì)印跡法檢測正常結(jié)腸組織和結(jié)腸癌組織中RhoA和ROCK1蛋白表達(dá)

取“2.5”項下凍存的大鼠正常結(jié)腸組織和結(jié)腸癌組織各100 mg，剪切為組織碎片，移至離心管中并加入RIPA裂解液，制備組織勻漿，并且冰浴裂解30 min，在4 ℃條件下進(jìn)行12 000 r/min離心10 min(離心半徑為10 cm)，收集上清液，分裝后于-20 ℃保存。根據(jù)BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書測定蛋白含量。取蛋白50 μg與上樣緩沖液混勻并沸水浴10 min，使蛋白變性，上樣凝膠孔進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后取出凝膠，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，以5%脫脂奶封閉1 h，將膜浸于1∶500稀釋的RhoA、ROCK1和β-actin一抗溶液中，洗滌后浸于1∶2 000稀釋的二抗溶液中，顯色并于凝膠成像系統(tǒng)拍照，以β-actin為內(nèi)參，通過ImageJ軟件分析條帶灰度值。

2.8 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 大鼠一般狀況

正常組大鼠未見異常表現(xiàn)，體重隨時間穩(wěn)定增長。模型組大鼠活動減少，體重增長明顯較正常組緩慢，可觀察到肛門處出現(xiàn)紅腫潰破的情況，大便稀溏并伴有毛發(fā)脫落癥狀。右美托咪定治療后，大鼠精神狀態(tài)得到改善，肛門紅腫、大便稀溏的情況有所緩解，體重明顯高于模型組。

3.2 右美托咪定對結(jié)腸癌大鼠血清TNF-α和IL-1β水平的影響

相較于正常組，模型組大鼠血清TNF-α和IL-1β水平顯著升高；相較于模型組，右美托咪定低、中及高劑量組大鼠血清TNF-α和IL-1β水平依次降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 右美托咪定對結(jié)腸癌大鼠血清TNF-α和IL-1β水平的影響Tab 1 Effects of dexmedetomidine on levels of serum TNF-α and IL-1β in colon cancer rats pg/mL)

3.3 解剖觀察腫瘤情況

正常組大鼠結(jié)腸未見異常；模型組大鼠腸黏膜褶皺明顯較正常組粗大，腸壁伴有出血、糜爛，距離肛門2～8 cm處的結(jié)腸上可見突出腫瘤組織，數(shù)目不一，為實質(zhì)性，呈橢圓形，向周圍組織浸潤；右美托咪定低、中及高劑量組大鼠腸壁糜爛出血情況明顯較模型組減輕，腫瘤組織大小和數(shù)量也有所減少，見圖1。

A.正常組；B.模型組；C.右美托咪定低劑量組；D.右美托咪定中劑量組；E.右美托咪定高劑量組A.normal group; B.model group; C.low dose dexmedetomidine group; D.medium dose dexmedetomidine group; E.high dose dexmedetomidine group圖1 大鼠成瘤情況Fig 1 Tumor formation in rats

3.4 結(jié)腸癌組織病理學(xué)觀察

正常組大鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)正常，腺體排列整齊，無炎癥細(xì)胞浸潤；模型組大鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)異常，黏膜層增厚，腺體組織增生并且排列紊亂，炎癥細(xì)胞浸潤程度嚴(yán)重，可見圓形、橢圓形的腫瘤細(xì)胞，核大畸形、深染，核分裂象增多，惡性腫瘤組織在腸壁中呈浸潤性生長；右美托咪定低、中及高劑量組大鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)相比于模型組較為完整，炎癥細(xì)胞浸潤程度有所降低，見圖2。

A.正常組；B.模型組；C.右美托咪定低劑量組；D.右美托咪定中劑量組；E.右美托咪定高劑量組A.normal group; B.model group; C.low dose dexmedetomidine group; D.medium dose dexmedetomidine group; E.high dose dexmedetomidine group圖2 大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)變化(HE染色，×200)Fig 2 Histopathological changes of colon in rats (HE staining, ×200)

3.5 右美托咪定對大鼠結(jié)腸癌組織RhoA和ROCK1蛋白表達(dá)的影響

相較于正常組，模型組大鼠結(jié)腸癌組織RhoA和ROCK1蛋白表達(dá)水平顯著升高；相較于模型組，右美托咪定低、中、高劑量組大鼠結(jié)腸癌組織RhoA和ROCK1蛋白表達(dá)水平依次降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2、圖3。

表2 右美托咪定對大鼠結(jié)腸癌組織RhoA和ROCK1蛋白表達(dá)的影響Tab 2 Effects of dexmedetomidine on the expression of RhoA and ROCK1 proteins in rat colon cancer tissue

圖3 右美托咪定對大鼠結(jié)腸癌組織RhoA和ROCK1蛋白表達(dá)的影響Fig 3 Effects of dexmedetomidine on the expression of RhoA and ROCK1 proteins in rat colon cancer tissue

4 討論

結(jié)腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，雖然腸鏡檢查的普及使得結(jié)腸黏膜早期病變的檢出率大幅度提高，但由于多方面的因素影響，結(jié)腸癌的發(fā)病率和死亡率仍居高不下[12]。為探究結(jié)腸癌的有效治療方案，本研究通過DMH誘導(dǎo)建立結(jié)腸癌大鼠模型用于實驗。結(jié)果顯示，相較于正常組，模型組大鼠體重增長緩慢，肛門處出現(xiàn)紅腫潰破，大便稀溏并伴有毛發(fā)脫落，大體解剖后可見結(jié)腸上存在突出腫瘤組織，HE染色觀察到結(jié)腸組織黏膜層異常增厚，腺體組織增生并且排列紊亂，炎癥細(xì)胞浸潤程度嚴(yán)重，可見圓形、橢圓形的腫瘤細(xì)胞，惡性腫瘤組織在腸壁中呈浸潤性生長。提示結(jié)腸癌大鼠模型構(gòu)建成功，并且能夠較好地模擬人類結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展過程，以此為基礎(chǔ)的后續(xù)實驗具有較高的可信度。

右美托咪定被廣泛應(yīng)用于麻醉領(lǐng)域。邢現(xiàn)良等[13]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，右美托咪定可能通過降低氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，發(fā)揮對器官的保護(hù)作用。馬莉等[14]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，右美托咪定腹腔注射能夠有效降低IL-6和TNF-α濃度，減輕組織水腫和中性粒細(xì)胞浸潤程度，對腹膜組織有抗炎作用。本研究中，右美托咪定低、中及高劑量組大鼠血清TNF-α、IL-1β水平較模型組顯著降低，腸壁糜爛出血情況有不同程度的減輕，結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)相比于模型組較為完整，炎癥細(xì)胞浸潤程度有所降低，呈現(xiàn)出劑量依賴性。提示右美托咪定可減少炎癥因子的產(chǎn)生，對結(jié)腸癌具有一定的治療作用。

RhoA/ROCK1通路參與調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、黏附、遷移和收縮等過程[15-17]。Nishizawa等[18]報道，RhoA突變是彌漫型胃癌的驅(qū)動基因，RhoA與ROCK1信號相互作用，促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞生存和遷移。Sajib等[19]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小鼠和人乳腺癌細(xì)胞中存在RhoA異常激活，通過藥物抑制或敲除來阻斷RhoA信號通路，可影響乳腺癌的跨內(nèi)皮遷移和轉(zhuǎn)移。蔣亦雯等[20]的研究結(jié)果表明，藥物抑制RhoA/ROCK1信號通路能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，但未進(jìn)行體內(nèi)試驗深入探究。本研究中，相較于正常大鼠，結(jié)腸癌大鼠結(jié)腸癌組織RhoA和ROCK1蛋白表達(dá)水平顯著升高；而右美托咪定治療可顯著下調(diào)RhoA和ROCK1蛋白的表達(dá)，且呈劑量依賴性。提示右美托咪定對結(jié)腸癌的治療作用可能是通過抑制RhoA/ROCK1通路實現(xiàn)的。

綜上所述，右美托咪定可能通過抑制RhoA/ROCK1通路，減少炎癥因子的釋放，從而對結(jié)腸癌大鼠起到治療作用。本研究初步探討了右美托咪定的抗結(jié)腸癌效用及其作用機(jī)制，但是右美托咪定對結(jié)腸癌的治療機(jī)制較為復(fù)雜，尚需后續(xù)深入研究。