張 宇，黃國弟，莫永龍，羅世杏，趙 英，唐玉娟，陸祖雙，單 彬，榮 濤

(廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院/廣西亞熱帶作物研究所，南寧，530001)

杧果MangiferaindicaL.多分布于干熱河谷地區(qū)以及南北回歸線之間，是藥食兩用型植物[1-2]。杧果產(chǎn)業(yè)發(fā)展依賴于杧果新品種的推陳出新，杧果新品種的產(chǎn)生依靠于多樣性的杧果種質(zhì)資源[3-7]。利用CDDP[8]、ISSR[9-10]、SRAP[11-12]、SCoT[13]、SSR[14]、AFLP[15]等分子標記技術(shù)對杧果品種進行遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析，可為杧果產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供參考[16]。但每一種分子標記技術(shù)都存在局限性，所得到的結(jié)果往往帶有片面性。利用DNA保守序列多態(tài)性(CDDP)結(jié)合相關(guān)序列擴增多態(tài)性(SRAP)對杧果品種進行遺傳多樣性分析，目前鮮見相關(guān)報道；前者是目的性標記，針對植物DNA的保守序列用單引物擴增目標分子的標記技術(shù)，后者是隨機性標記，采用雙引物對開放閱讀框(ORFs)進行擴增，檢測其多態(tài)性[17-20]。為避免單一分子標記以及同類型分子標記對試驗結(jié)果造成偏差，筆者采用CDDP結(jié)合SRAP分子標記的方法對全球主要栽培杧果品種進行遺傳多樣性分析，為進一步拓寬杧果分子輔助育種以及種質(zhì)鑒定提供數(shù)據(jù)信息支持。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

供試材料來自廣西亞熱帶作物研究所杧果種質(zhì)資源圃(見表1)。供試材料處理、模板獲取參考張宇等[21]的方法。引物由華大基因生物工程(深圳)股份有限公司合成(見表2)。

表1 35個供試杧果品種

表2 CDDP和SRAP引物信息

1.2 CDDP-PCR與SRAP-PCR擴增及其產(chǎn)物檢測

CDDP-PCR、SAP-PCR擴增反應(yīng)程序和體系各組分用量參考張宇等[8，11]的方法。

1.3 數(shù)據(jù)信息分析

計算擴增條帶數(shù)(TNB)、多態(tài)性條帶數(shù)(NPB)，多態(tài)性條帶比率(polymorphism rate，PPB)、有效等位基因(effective allele number，Ne)數(shù)量、Nei’s基因多樣度(Nei’s gene diversity，H)、Shannon信息指數(shù)(Shannon information index，I)和多態(tài)性信息含量(Polymorphism information content，PIC)等遺傳多樣性指標；聚類分析和主成分分析分別參考王麗媛等[22]和高源等[23]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 杧果CDDP與SRAP的PCR擴增

查閱相關(guān)文獻，選用表2中引物與供試材料DNA模板錨定，分別選取12條和12對CDDP和SRAP引物對35個杧果品種進行多態(tài)性分析。結(jié)果顯示，SRAP和CDDP擴增總條帶數(shù)分別為243條和263條，多態(tài)性條帶數(shù)分別為230條和250條，多態(tài)性條帶比率分別為94.61%和95.45%，平均多態(tài)性信息指數(shù)分別為0.59和0.60。說明CDDP標記所產(chǎn)生的總條帶數(shù)、多態(tài)性條帶數(shù)和多態(tài)性條帶比率均高于SRAP標記。此外，兩種標記的遺傳多樣性參數(shù)也有所差異，除平均有效等位基因數(shù)，SRAP標記為1.62略高于CDDP標記的1.59外，Nei’s基因多樣性指數(shù)、Shannon’s信息指數(shù)和多態(tài)性信息含量，CDDP標記均高于SRAP標記。推斷CDDP標記檢測多態(tài)性的能力和標記效率高于SRAP標記。

表3 35個杧果品種SRAP和CDDP標記遺傳多樣性參數(shù)

盡管本研究中CDDP標記和SRAP標記分別只選取了12條和12對，引物的數(shù)量與已報道的CDDP和SRAP標記引物不算多，且供試材料僅為35個杧果品種;但均能擴增出條帶清晰，層次分明，完整性好，數(shù)目多的電泳條帶，可以較理想地顯示出杧果的遺傳多樣性(見圖1)，且上述兩種標記結(jié)合分析杧果種質(zhì)親緣關(guān)系鮮見報道。

注：上圖為ABP1-1引物的PCR擴增，下圖為Me1和Em1引物的PCR擴增。M為marker，1～35表示不同杧果品種，詳見表1。圖1 35個杧果品種CDDP-PCR和SRAP-PCR

2.2 聚類分析

利用UPGMA軟件對35個杧果品種進行聚類分析，CDDP標記的遺傳相似系數(shù)分布在0.64～0.96，平均遺傳相似系數(shù)為0.80。在遺傳相似系數(shù)為0.709 5處，35個杧果品種分為A、B、C 3大類，A類為杉林1號、紅象牙、農(nóng)院紅杧、黃象牙、呂宋、柳州呂宋、臺農(nóng)1號、凱特、愛文、圣心、R2E2、紅凱特、肯特、熱農(nóng)1號、肯辛頓、金煌和臺牙，B類為貴妃、玉文、鳳凰杧、帕拉英達、金穗、水英達、農(nóng)院8號、秋杧、紫花和沅江象牙，C類為桂香杧、串杧、桂熱杧10號、桂熱杧23號、桂熱杧82號、桂熱杧71號、水仙杧和秋杧。在相似遺傳系數(shù)為0.763 5處，A類又可分為A1、A2和A3，共計3類，A1類為杉林1號、紅象牙、農(nóng)院紅杧、黃象牙、呂宋、柳州呂宋和臺農(nóng)1號，A2類為凱特、愛文、圣心、R2E2、紅凱特、肯特和熱農(nóng)1號，A3類為肯辛頓、金煌和臺牙。在相似遺傳系數(shù)為0.776 9處，B類又可分為B1和B2，共計2類，B1類為貴妃、玉文、鳳凰杧、帕拉英達、金穗和水英達，B2類為農(nóng)院8號、秋杧、紫花和沅江象牙。在相似遺傳系數(shù)為0.818 5處，C類又可分為C1和C2，共計2類，C1類為桂香杧、串杧和桂熱杧10號，C2類為桂熱杧23號、桂熱杧82號、桂熱杧71號、水仙杧和秋杧。

聚類分析可知，SRAP標記的遺傳相似系數(shù)分布在0.64～0.92，平均遺傳相似系數(shù)為0.78。在遺傳相似系數(shù)為0.694 7處，35個杧果品種分為A、B、C 3大類，A類為呂宋、黃象牙、愛文、農(nóng)院紅杧、紅象牙、黃象牙、臺農(nóng)1號、杉林1號、柳州呂宋、凱特、R2E2、熱農(nóng)1號、肯辛頓、肯特、玉文、臺牙和貴妃，B類為農(nóng)院8號、球杧和鳳凰杧，C類為圣心、紅凱特、金煌、帕拉英達、桂香杧、紫花、沅江象牙、串杧、水英達、金穗、桂熱杧82號、桂熱杧71號、桂熱杧23號、秋杧、水仙杧。在相似遺傳系數(shù)為0.761 9處，A類又可分為A1、A2、A3和A4，共計4類，A1類為呂宋、黃象牙、愛文、農(nóng)院紅杧、紅象牙、黃象牙、臺農(nóng)1號、杉林1號和柳州呂宋，A2類為凱特、R2E2和熱農(nóng)1號，A3類為肯辛頓、肯特和玉文，A4類為臺牙和貴妃。在相似遺傳系數(shù)為0.806 7處，B類又可分為B1和B2，共計2類，B1類為農(nóng)院8號，B2類為球杧和鳳凰杧。在相似遺傳系數(shù)為0.746 9處，C類又可分為C1、C2和C3，共計3類，C1類為圣心、紅凱特和金煌，C2類為帕拉英達、桂香杧、紫花、沅江象牙、串杧、水英達、金穗和桂熱杧82號，C3類為桂熱杧71號、桂熱杧23號、秋杧和水仙杧。

聚類分析可知，CDDP+SRAP標記的遺傳相似系數(shù)分布在0.62～0.94，平均遺傳相似系數(shù)為0.78。在遺傳相似系數(shù)為0.685 0處，35個杧果品種分為A、B、C、D、E 5大類，A類為紅象牙、杉林1號、農(nóng)院紅杧、黃象牙、柳州呂宋、呂宋和臺農(nóng)1號，B類為愛文、凱特、圣心、紅凱特、肯特、R2E2和肯辛頓，C類為熱農(nóng)1號、金煌和玉文，D類為臺牙、貴妃、鳳凰杧、農(nóng)院8號、球杧、帕拉英達、水英達、金穗、紫花、串杧、沅江象牙、桂香杧、桂熱杧10號和桂熱杧82號，E類為桂熱杧23號、桂熱杧71號、秋杧和水仙杧。在相似遺傳系數(shù)為0.734 8處，A類又可分為A1和A2，共計2類，A1類為紅象牙、杉林1號和農(nóng)院紅杧，A2類為黃象牙、柳州呂宋、呂宋和臺農(nóng)1號。在相似遺傳系數(shù)為0.730 6處，B類又可分為B1和B2，共計2類，B1類為愛文、凱特、圣心、紅凱特和肯特，B2類為R2E2和肯辛頓。在相似遺傳系數(shù)為0.827 9處，C類又可分為C1和C2，共計2類，C1類為熱農(nóng)1號和金煌，C2類為玉文。在相似遺傳系數(shù)為0.756 1處，D類又可分為D1、D2和D3，共計3類，D1類為臺牙、貴妃、鳳凰杧、農(nóng)院8號和球杧，D2類為帕拉英達、水英達和金穗，D3類為紫花、串杧、沅江象牙、桂香杧、桂熱杧10號和桂熱杧82號。在相似遺傳系數(shù)為0.785 9處，E類又可分為E1和E2，共計2類，E1類為桂熱杧23號，E2類為桂熱杧71號、秋杧和水仙杧。

本研究對CDDP標記、SRAP標記以及CDDP+SRAP標記對杧果品種遺傳多樣性進行聚類分析，不同標記聚類分析結(jié)果不同，CDDP+SRAP標記聚類分析結(jié)果較單獨標記聚類分析更細化，但基于分子標記技術(shù)的聚類分析結(jié)果與杧果原產(chǎn)地?zé)o相關(guān)性。

注：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分別為CDDP標記、SRAP標記以及CDDP+SRAP標記聚類分析。編號1～35表示不同杧果品種，詳見表1。圖3同。圖2 35個杧果品種CDDP和SRAP聚類

2.3 主成分分析

基于CDDP+SRAP標記對35個杧果品種的遺傳多樣性分析結(jié)果繪制主成分分析平面PCA圖(見圖3)。圖3中編號分布疏密代表品種之間的遺傳關(guān)系，對比聚類分析結(jié)果，其親緣關(guān)系有相似之處，也有很大不同。聚類分析表明紅象牙、杉林1號、農(nóng)院紅杧、黃象牙、柳州呂宋、呂宋和臺農(nóng)一號聚為一類，顯示出較其他供試品種較近的親緣關(guān)系；但主成分分析表明，紅象牙、杉林1號和農(nóng)院紅杧親緣關(guān)系較近，黃象牙、柳州呂宋、呂宋和臺農(nóng)一號親緣關(guān)系較近，而二部分之間的親緣關(guān)系較遠。聚類分析結(jié)果表明，愛文、凱特、圣心、紅凱特、肯特、R2E2和肯辛頓聚類為一類，顯示出較其他供試品種較近的親緣關(guān)系；但主成分分析表明，愛文與臺牙、貴妃和鳳凰杧的親緣關(guān)系緊密，凱特與熱農(nóng)1號之間的親緣關(guān)系緊密，紅凱特和肯特與球杧、帕拉英達的親緣關(guān)系緊密。聚類分析不能較好地區(qū)分出原產(chǎn)地一致的杧果品種，但主成分分析可以將一些來源地不一致的杧果品種區(qū)分出來。這很有可能是因為不同的分析方法采用的分析軟件不同、考量的區(qū)分因素不同;即使存在相同的考量因素，但是側(cè)重點不同，因此導(dǎo)致分析結(jié)果不同。對比兩種遺傳多樣性的分析方法可知，主成分分析可以更加直觀立體地表明杧果品種之間的遺傳疏離、遠近關(guān)系，即能體現(xiàn)聚為一類品種之間的親密關(guān)系，也可以反應(yīng)不同類別之間的離散程度。

圖3 35個杧果品種的主成分分析

3 結(jié)論與討論

杧果新品種的選育依賴于杧果豐富的遺傳多樣性[24-26]。杧果高度異花授粉，種子高度雜合，遺傳背景復(fù)雜，傳統(tǒng)的單一分子標記已經(jīng)不能準確地分析其遺傳多樣性，采用多種分子標記結(jié)合的方式從DNA水平反映遺傳變異，對杧果遺傳育種研究具有重要意義。本研究采用CDDP結(jié)合SRAP標記對35個杧果品種進行了遺傳信息數(shù)據(jù)分析、聚類分析和主成分分析。試驗結(jié)果表明，除平均有效等位基因數(shù)，SRAP標記略高于CDDP標記外，多態(tài)性條帶比率、Nei’s基因多樣性指數(shù)、Shannon’s信息指數(shù)和多態(tài)性信息含量均為CDDP標記高于SRAP標記。由此判斷，CDDP標記檢測多態(tài)性的能力和標記效率高于SRAP標記。盡管本研究中只選取了已報道CDDP和SRAP標記引物的小部分，且供試樣本量僅為35個杧果品種，但遺傳信息數(shù)據(jù)表明CDDP標記和SRAP標記均可較理想地顯示出杧果的遺傳多樣性。

對35個杧果品種進行聚類分析和主成分分析反映出的品種間親緣關(guān)系有相似之處，但也有很大不同。采用CDDP標記、SRAP標記以及CDDP結(jié)合SRAP標記分別繪制聚類分析圖，依次在遺傳相似系數(shù)0.694 7、0.709 5和0.685 0處，35個杧果品種分別分為A、B、C三大類，A、B、C三大類，A、B、C、D、E五大類，由此可以判定CDDP結(jié)合SRAP標記較CDDP和SRAP標記可以將供試杧果品種分類更全面細化。3種標記方法又可以分別分為不同的小類，將親緣關(guān)系更緊密的杧果品種聚集在一起。通過聚類分析可知CDDP、SRAP以及CDDP結(jié)合SRAP標記得出聚類分析結(jié)果不相同，如CDDP結(jié)合SRAP和CDDP標記聚類分析可以較好地體現(xiàn)出呂宋杧和柳州呂宋的密切親緣關(guān)系，而SRAP標記雖然也可以將呂宋杧和柳州呂宋聚集在A1類，但遺傳親緣關(guān)系上卻顯得沒有那么密切，可能是由于CDDP和SRAP標記的技術(shù)原理不同造成聚類結(jié)果不同。SRAP引物較為隨機，沒有針對目的基因片段序列進行錨定，隨機性較強；而CDDP標記雖然其引物數(shù)量不多，但其引物設(shè)計是依據(jù)植物材料中特有的功能基因以及基因家族，目的性較強；而CDDP結(jié)合SRAP標記，極大地吸收了兩種標記的優(yōu)點，將隨機性和確定性緊密地結(jié)合在一起，可以較大程度彌補單一標記的不足，提高分析結(jié)果數(shù)據(jù)的可靠性。聚類分析結(jié)果顯示，紫花杧和金穗杧的遺傳相似系數(shù)偏大，很可能是因為CDDP和SRAP標記引物可以較理想地錨定兩者之間的基因差異序列，表現(xiàn)出極為顯著的遺傳特異性，反應(yīng)出二者之間較大的遺傳距離。主成分分析可知，愛文與臺牙、貴妃和鳳凰杧的親緣關(guān)系緊密，凱特與熱農(nóng)1號之間的親緣關(guān)系緊密，紅凱特和肯特與球杧、帕拉英達的親緣關(guān)系緊密。但聚類分析不能顯示出上述品種間的緊密親緣關(guān)系，只能將親緣關(guān)系較為接近的杧果品種聚為一類，且不能顯示出聚為一類的杧果品種間的空間遺傳距離，以及不同聚類品種間的遺傳差異。比較聚類分析圖和主成分圖可知，主成分圖更加立體，直觀地反映杧果品種間的遺傳疏離、遠近、分布情況，而聚類分析圖無法達到前者的顯示效果。這很有可能是由于不同分析方法采用的分析軟件不同、考量的區(qū)分因素不同，即使存在相同的考量因素，但是側(cè)重比例不同?？傮w來說，主成分分析既能體現(xiàn)聚為一類品種之間的親密關(guān)系，也可以反應(yīng)不同類別之間的離散程度。聚類分析不能區(qū)分出原產(chǎn)地一致的杧果品種，但主成分分析可以將一些來源地不一致的杧果品種區(qū)分出來。