◎ 尚潔昊，常程程，丁梓雪，孟憲剛

（蘭州交通大學(xué)，甘肅 蘭州 730000）

蘭州處于我國西北地區(qū)，多民族聚居，飲食結(jié)構(gòu)多元化，甘肅又是我國的養(yǎng)殖業(yè)大省，每年有20多萬噸羊肉被本地消費(fèi)[1]。羊肉制品中，烤羊肉是深受人們喜歡的品類?？狙蛉獯菍⑿迈r的羊肉除去筋膜，將血水洗凈，切成小塊，經(jīng)過調(diào)味料腌漬后串烤而成。由于烤羊肉串即食的特征，使國內(nèi)對烤羊肉串的防腐保鮮研究較少，這也限制了烤羊肉串的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展?？狙蛉鈱儆诘蜏厝庵破?，低溫肉制品是一類在標(biāo)準(zhǔn)大氣壓下通過熏、煮、烤和蒸等烹飪工藝處理后，使肉制品的中心部位的溫度達(dá)到75～85 ℃的新型肉類制品[2]。低溫肉制品保持了肉本身的組織與結(jié)構(gòu)和其天然的成分，正是這種肉制品的特性，使它成為我國肉制品未來進(jìn)步的方向和趨勢。但由于低溫肉制品的加工場所開放、滅菌不完全，致使低溫肉制品非常容易發(fā)生腐敗，產(chǎn)品貨架期短，必須采用冷鏈的方式運(yùn)輸和保存，在很大程度上限制了低溫肉制品的發(fā)展[3]。如何在最大程度上抑制或消除腐敗微生物生長繁殖，抑制肉制品當(dāng)中的各種酶對脂肪酸敗、蛋白質(zhì)的氧化分解，保持肉制品的原有滋味與營養(yǎng)成分，是低溫肉制品保鮮的主要目標(biāo)。

肉制品之所以發(fā)生腐敗變質(zhì)，主要是由微生物造成的，致使肉本身的顏色發(fā)生變化并出現(xiàn)異味，影響肉制品的食用。還有些微生物會(huì)把肉中的蛋白質(zhì)逐漸分解成其他化合物，產(chǎn)生氣味，進(jìn)一步促使肉制品的腐敗變質(zhì)[4]。目前，國內(nèi)外一些研究人員針對低溫肉制品品質(zhì)低、產(chǎn)品保水能力低、保油能力低、色澤不持久和產(chǎn)品貨架期短等問題，進(jìn)行了腐敗菌分布、生長衰退規(guī)律及優(yōu)勢腐敗菌的分離鑒定。劉彩云等人[5]發(fā)現(xiàn)魏斯氏菌和佐氏庫特氏菌這兩種菌是導(dǎo)致市售鹵牛肉腐敗的優(yōu)勢菌。宋相宇等人[6]采用高通量測序技術(shù)，探究了不同包裝及儲(chǔ)存溫度對于白切雞中微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)白切雞優(yōu)勢菌屬都是假單胞菌屬。

由于低溫肉制品殺菌工藝和儲(chǔ)藏條件與新鮮胴體、高溫肉制品有很大不同，本研究試從市售烤羊肉中分離出導(dǎo)致烤羊肉腐敗的微生物，并對腐敗菌進(jìn)行鑒定，以確定導(dǎo)致市售燒烤羊肉腐敗的主要微生物，意在為烤羊肉制品的儲(chǔ)存、延長貨架期等問題的解決提供借鑒，也能更好地將當(dāng)?shù)靥厣目救庵破吠茝V銷售至全國，拓展銷路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蘭州市安寧區(qū)某烤肉店烤制的羊肉串。

FA2004N電子分析天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）、DHP-9012電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、SW-CJ-2G型雙人凈化工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）、LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）、SHA-B雙功能水浴恒溫振蕩器（常州天瑞儀器有限公司）、TGL-16G離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）和T100PCR儀（伯樂）。

1.2 培養(yǎng)基

LB固體培養(yǎng)基：酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1 L。

察氏固體培養(yǎng)基：硝酸鈉3 g，磷酸氫二鉀1 g，硫酸鎂0.5 g，氯化鉀0.5 g，硫酸亞鐵0.01 g，蔗糖30 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L。

高氏固體培養(yǎng)基：淀粉20 g，硝酸鉀1 g，磷酸氫二鉀0.5 g，氯化鈉0.5 g，硫酸鎂0.5 g，硫酸亞鐵0.01 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

樣品采集于蘭州市安寧區(qū)某燒烤店，將烤制完成的羊肉用真空包裝袋真空包裝，并標(biāo)記樣品名稱，放置常溫保存。

1.3.2 燒烤肉制品污染微生物的培養(yǎng)

在超凈工作臺(tái)上，取5 g肉樣剪碎，放進(jìn)含有45 mL無菌生理鹽水的錐形瓶內(nèi)。通過充分振蕩制成的1∶10均勻稀釋液。按照腐敗情況進(jìn)行梯度稀釋，稀釋為10-1～10-6。將稀釋后的溶液吸取200 μL，分別加到1.2中3種固體培養(yǎng)基中，進(jìn)行涂布，之后放在恒溫培養(yǎng)箱32 ℃，培養(yǎng)48 h。

在778份樣本中，共檢出10份HPV18陽性，檢出率1.3%（10/778），其中4份為多重感染。HPV18感染者年齡最小31歲，最大58歲，中位年齡40歲。

1.3.3 燒烤肉制品的污染微生物的分離與純化

將3種培養(yǎng)基上生長的微生物菌落挑出單菌落，反復(fù)劃線進(jìn)行純化。觀察記錄菌株的形態(tài)、邊緣、顏色和透明度、菌體是否隆起等生物學(xué)性狀。

1.3.4 DNA的提取

模板的獲取：在超凈工作臺(tái)中，用接種環(huán)分別挑取單菌落到0.2 mL離心管中，加入10 μL無菌水，標(biāo)記，96 ℃煮沸10 min，迅速放于-20 ℃冷凍5 min（循環(huán)3次），4 000 r·min-1離心1 min，吸取2 μL上清液作為DNA模板。

PCR參數(shù)：94 ℃預(yù)變性5 min；主循環(huán)94 ℃變性0.5 min；55 ℃退火1.5 min；72 ℃延伸1.5 min；循環(huán)30次；72 ℃終延伸10 min；4 ℃保存。

引物為16S rDNA通用引物27F和1492R，以菌體的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系如表1。

表1 PCR反應(yīng)體系表（25 uL）

1.3.5 16S rDNA測序

將擴(kuò)增出菌株的DNA片段送到生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。

將測序獲得16S rDNA序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行BLAST比對分析，后選取近似菌種序列采用MAGE 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 腐敗菌株的菌落特征

經(jīng)過梯度稀釋涂布和多次劃線培養(yǎng)，在LB瓊脂培養(yǎng)基上篩選得到3株菌株，分別命名為Y1、Y2、Y3號菌。LB瓊脂培養(yǎng)基上菌落形態(tài)見表2。

表2 LB瓊脂培養(yǎng)基上菌落形態(tài)表

2.2 腐敗菌的革蘭氏染色鑒定結(jié)果

革蘭氏染色是細(xì)菌學(xué)中廣為采用鑒別細(xì)菌的一種方法，根據(jù)細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分的不同，通過染色結(jié)果可使細(xì)菌分為兩大類，即G+與G-[7]。在分離純化試驗(yàn)中，在腐敗的燒烤羊肉中分離純化出3株菌，采用革蘭氏染色法將這3個(gè)菌株進(jìn)行革蘭氏染色，用100倍油鏡觀察。菌體染色結(jié)果均為革蘭氏陽性菌。Y1、Y2呈桿狀，Y3呈短桿狀，橢圓、兩端鈍圓。

2.3 腐敗菌的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

由圖1可知Y1為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、Y2為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、Y3為暹羅芽孢桿菌（Bacillus siamensis）。

圖1 基于16S rDNA序列同源性的菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹圖

3 結(jié)論與討論

以往研究證實(shí)，影響低溫肉制品貨架期的關(guān)鍵因素是腐敗菌的生長繁殖[8]。低溫肉制品由于制作過程溫度低，殺菌不完全，導(dǎo)致肉制品中會(huì)殘有細(xì)菌芽胞、真菌孢子和部分耐熱細(xì)菌等微生物，在日后的貯存和銷售過程中，存留的微生物在肉中經(jīng)過短暫的修養(yǎng)、復(fù)蘇后將會(huì)再次進(jìn)行生長繁殖，最后會(huì)引起肉制品的感官品質(zhì)下降、導(dǎo)致其腐敗變質(zhì)，影響了肉制品貨架期[9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在市場出售的燒烤羊肉制品中，芽孢桿菌是導(dǎo)致烤羊肉腐敗的主要腐敗菌。燒烤肉制品在制作過程中，高溫處理雖能夠殺死一部分不耐熱的微生物，但有些細(xì)菌的芽孢仍能在高溫處理下存活下來。當(dāng)然也存在一些由于烤制不徹底而殘留在肉制品內(nèi)部的微生物。因此，導(dǎo)致燒烤羊肉制品腐敗的優(yōu)勢菌大多為芽孢桿菌，這一結(jié)果與其他學(xué)者在傳統(tǒng)菜肴中分離鑒定出的優(yōu)勢腐敗菌一致[10-11]。

本研究對常溫條件下市售烤制羊肉中的腐敗菌進(jìn)行分離純化，并通過菌落形態(tài)學(xué)觀察和16S rDNA分子鑒定等方法，對肉中的腐敗菌進(jìn)行了分離鑒定。結(jié)果表明，在烤羊肉上分離得到Y(jié)1、Y2、Y3 3株菌，分別是地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、暹羅芽孢桿菌。這些腐敗菌主要是由會(huì)產(chǎn)生芽孢的芽孢桿菌組成的，是引起燒烤羊肉腐敗的主要菌株，同時(shí)也是影響產(chǎn)品貨架期的先決條件。本研究為燒烤羊肉制品加工、貯藏過程中有針對性地控制微生物污染提供借鑒和參考，并且為下一步防腐保鮮提供可用的方法，也為延長燒烤羊肉制品的貨架期提供了理論根據(jù)。