丁寧，趙銘佳，張瑤楠，韓寶生，劉美玲*

(1.國(guó)家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所 男性生殖健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081；2.唐山市婦幼保健院生殖遺傳科，唐山 063000；3.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院，北京 100730)

不孕不育癥是全球性的公共衛(wèi)生問題，在育齡人群中的發(fā)病率約為15%，在所有不孕不育因素中男性因素約占50%[1]。男性不育癥有很多分類，根據(jù)病因主要分為：(1)下丘腦垂體功能障礙；(2)睪丸因素；(3)導(dǎo)管阻塞；(4)難以分類的一些其他因素。無精子癥是男性不育中最為嚴(yán)重的一種，根據(jù)有無梗阻，主要分為梗阻性無精子癥(OA)和非梗阻性無精子癥(NOA)。NOA的發(fā)生機(jī)制尚不明確，約10%的不育男性和近60%的無精子患者為NOA[2]。弱精子癥是男性不育癥的另一常見原因。弱精子癥定義為精子濃度>15×106/ml而精子前向運(yùn)動(dòng)(PR)<32%，這阻礙了精子運(yùn)動(dòng)和穿透卵母細(xì)胞，影響受精，最終導(dǎo)致不育。目前，男性不育的診斷主要依據(jù)WHO推薦的精液參數(shù)和睪丸活檢診斷，但這些指標(biāo)的敏感性和特異性均不十分理想，活檢取材有一定的侵入性，因此探討男性不育的發(fā)病機(jī)制和發(fā)現(xiàn)潛在的無創(chuàng)性分子診斷標(biāo)志物具有重要的臨床意義。

微小RNAs(miRNAs)是長(zhǎng)度為19～25 nt的非編碼RNAs，通過與靶基因mRNA的3′UTR非翻譯區(qū)結(jié)合，使靶基因mRNA被降解或翻譯過程被抑制[3-4]，繼而在轉(zhuǎn)錄后水平上發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。miRNAs參與多種生命活動(dòng)，其在哺乳動(dòng)物精子發(fā)生過程中也起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，睪丸中存在高豐度miRNAs，在精子發(fā)生和成熟的各個(gè)階段均起著重要的調(diào)控作用，并且miRNAs的表達(dá)或功能異常與男性不育相關(guān)[5-6]。文獻(xiàn)報(bào)道，miR-106b可能參與生殖細(xì)胞分化及減數(shù)分裂后雄性生殖細(xì)胞功能發(fā)育及成熟[3]。與正常男性相比，少精子癥和弱精子癥患者精子的miRNA表達(dá)譜存在多個(gè)差異表達(dá)的miRNAs[7]。本課題組前期研究結(jié)果提示，miR-106b-5p具有抑制生精細(xì)胞凋亡、促進(jìn)生精細(xì)胞增殖的作用[8]。另有研究發(fā)現(xiàn)，miR-202-3p在小鼠睪丸中呈現(xiàn)組織特異性表達(dá)，尤其在A型精原細(xì)胞中的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于在粗線期精母細(xì)胞和圓形精子細(xì)胞，且miR-202-3p在精子發(fā)生過程中對(duì)精原干細(xì)胞維持和自我更新有重要作用[8-9，10]。此外，本課題組利用 Illumina HiSeq X10高通量測(cè)序分析NOA患者精漿miRNAs表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)，NOA患者精漿miR-106b-5p和miR-202-3p與正常生育者比較有顯著差異[11]。因此，為了研究精漿miR-106b-5p和miR-202-3p是否對(duì)男性不育具有診斷價(jià)值，本研究擬采用實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)精液參數(shù)正常男性、NOA患者和弱精子癥患者精漿中miR-106b-5p和miR-202-3p的表達(dá)情況，并繪制受試者工作特征曲線(ROC)，初步探討miR-106b-5p和miR-202-3p對(duì)NOA的診斷價(jià)值。

資料與方法

一、研究對(duì)象

選取2018年12月至2020年10月于唐山市婦幼保健院就診的男性不育癥患者和精液參數(shù)正常的志愿者為研究對(duì)象。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡23～44歲；(2)依照WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)[12]確診為NOA或弱精子癥；(3)有詳細(xì)的病史采集和生殖?？茩z查；(4)正常生育男性為男性生殖專科檢查正常且近3年育有健康后代的男性。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)存在引起男性不育的其他因素如隱睪、尿道下裂、精索靜脈曲張、染色體異常、性腺發(fā)育不全等；(2)采樣期間服用過藥物、酗酒、吸煙等。

共納入317例研究對(duì)象。根據(jù)精液檢查參數(shù)和臨床資料不同分為3組：精子濃度>15×106/ml且PR<32%的患者為弱精子癥組(n=106)，NOA癥患者為NOA組(n=92)，同期精液檢查參數(shù)正常男性為對(duì)照組(n=119)。本研究通過國(guó)家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所及唐山市婦幼保健院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者均自愿簽署知情同意書。

二、研究方法

1.樣品采集：所有受試者均禁欲3～5 d，手淫法取精，留于無菌的取精杯中，37℃溫育 30 min，液化后于唐山市婦幼保健院實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行精液常規(guī)檢查。精液1 500g離心10～15 min去除精子細(xì)胞，取上清以11 000 g離心5 min得到精漿，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.qRT-PCR檢測(cè)：采用改良精漿提取法提取各組精漿miRNA[13]。用特異性莖環(huán)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA，加入SYBR Premix ExTaq(Takara，日本)，進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件：95℃ 0.5 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，以DEPC處理的ddH2O作為陰性對(duì)照，以U6為內(nèi)參，miR-106b-5p、miR-202-3p及內(nèi)參U6的引物均購自蘇州吉瑪有限公司，各引物擴(kuò)增序列見表1。

表1 qRT-PCR引物擴(kuò)增序列

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、研究對(duì)象的一般資料比較

3組研究對(duì)象的平均年齡及體質(zhì)量指數(shù)(BMI)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；NOA組與弱精子癥組患者的不育年限比較亦無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

表2 研究對(duì)象的一般資料比較(-±s)

二、3組研究對(duì)象精漿中miR-106b-5p和miR-202-3p的表達(dá)水平

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，NOA組miR-106b-5p的表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組及弱精子癥組(P<0.05)，弱精子癥組miR-106b-5p的表達(dá)水平略高于對(duì)照組，但差異尚無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；NOA組miR-202-3p的表達(dá)水平亦顯著低于對(duì)照組及弱精子癥組(P<0.05)，弱精子癥組miR-202-3p的表達(dá)水平略低于對(duì)照組，但差異尚無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖1)。

A：miR-106b-5p的相對(duì)表達(dá)量比較；B：miR-202-3p的相對(duì)表達(dá)量比較。注：與NOA組比較，*P<0.05。圖1 qRT-PCR檢測(cè)精漿miR-106b-5p和miR-202-3p的表達(dá)情況

三、精漿miR-106b-5p和miR-202-3p對(duì)NOA的診斷價(jià)值

由前述可知，精漿miR-106b-5p和miR-202-3p在NOA組的表達(dá)水平存在顯著差異，推測(cè)二者可能對(duì)NOA有一定的診斷價(jià)值。繪制ROC曲線進(jìn)行分析后結(jié)果顯示，miR-106b-5p的AUC為0.750[95%CI(0.665，0.835)，P<0.000 1]；miR-202-3p的AUC為0.873[95%CI(0.810，0.936)，P<0.000 1]；miR-106b-5p診斷NOA的靈敏度和特異度分別為72.1%和61.2%，miR-202-3p診斷NOA的靈敏度和特異度分別為88.6%和82.9%(圖2，表3)。

圖2 ROC曲線分析

表3 精漿miR-106b-5p和miR-202-3p診斷NOA的靈敏度和特異性

討 論

男性不育作為困擾許多育齡夫婦的難題，給患者帶來巨大心理壓力，且男性不育已成為一個(gè)嚴(yán)重的健康問題[1]。無精子癥是男性不育中最為嚴(yán)重的類型，其中NOA的發(fā)病機(jī)制相對(duì)復(fù)雜，且大部分NOA患者病因及發(fā)病機(jī)制尚不明確，臨床上稱之為特發(fā)性無精子癥[12]。弱精子癥是男性不育癥的另一常見原因，其由于精子的運(yùn)動(dòng)性差或活力低，阻礙了精子運(yùn)動(dòng)和穿透卵母細(xì)胞，最終導(dǎo)致不育。目前，睪丸活檢病理學(xué)診斷是明確睪丸生精功能的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但這些診斷程序伴有一定的侵襲性并可能引起一些并發(fā)癥。因此，研究男性不育的病因及致病機(jī)理，尋求潛在的無創(chuàng)性分子標(biāo)志物成為臨床研究的主要挑戰(zhàn)。

精漿miRNAs含量豐富，來源于生殖系統(tǒng)中不同組織及細(xì)胞，具有一定的特異性，其通過與蛋白相結(jié)合保持性質(zhì)的相對(duì)穩(wěn)定，因此，選擇miRNAs作為診斷男性不育的無創(chuàng)性分子靶標(biāo)，具有很好的優(yōu)勢(shì)及前景。精子在睪丸中產(chǎn)生，從精原干細(xì)胞(SSCs)經(jīng)過有絲分裂、減數(shù)分裂直到形成成熟精子，這一復(fù)雜過程除了受激素和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，非編碼RNA(ncRNAs)也在精子發(fā)生中發(fā)揮作用，其中miRNAs是人類和動(dòng)物睪丸發(fā)育及精子發(fā)生過程中的關(guān)鍵介質(zhì)[14-16]。有研究發(fā)現(xiàn)，條件性敲除小鼠睪丸生精細(xì)胞中的Drosha和Dicer后，小鼠表現(xiàn)為少精子或無精子癥，提示miRNAs參與調(diào)節(jié)精子發(fā)生[16]。還有研究發(fā)現(xiàn)，與正常男性精子的miRNA譜相比，弱精子癥患者有27種miRNAs表達(dá)下調(diào)，50種miRNAs表達(dá)上調(diào)；少精子癥患者有44種miRNA表達(dá)下調(diào)，42種miRNAs表達(dá)上調(diào)[17]。Abu-Halima等[18]研究發(fā)現(xiàn)，生精障礙(低生育力和NOA)患者精漿hsa-miR-34b、hsa-miR-34c-5p和hsa-miR-122與男性不育顯著相關(guān)。盧新喆等[19]研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)方玄駒聯(lián)膠囊聯(lián)合常規(guī)西醫(yī)治療弱精子癥，通過調(diào)節(jié)精漿miR-106b、抗苗勒管激素(AMH)水平，能有效增強(qiáng)精子活力，提高精子頂體完整率，療效較好。吳彩云等[20]利用Solexa測(cè)序技術(shù)分別檢測(cè)弱精子癥、NOA患者和正常生育男性的精漿miRNAs表達(dá)發(fā)現(xiàn)，弱精子癥組精漿miR-106b表達(dá)水平顯著高于正常生育組，而NOA組miR-106b表達(dá)水平顯著低于正常生育組(P<0.05)。本研究結(jié)果顯示，NOA組精漿miR-106b-5p的表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組和弱精子癥組(P<0.05)，弱精子癥組精漿miR-106b-5p表達(dá)水平略高于對(duì)照組，但無顯著性差異(P>0.05)；與吳彩云等[20]的研究結(jié)果不完全一致，這可能與納入病例間的個(gè)體差異有關(guān)，今后需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行驗(yàn)證。miR-202-3p位于10q26染色體易碎位點(diǎn)，其調(diào)控多種腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和凋亡，如胃癌、乳腺癌、宮頸磷狀細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌等[21]。有報(bào)道顯示，miR-202-3p在成年男性睪丸組織中高表達(dá)[11]，在精子發(fā)生過程中發(fā)揮著重要的生理功能[9]。此外，在男性生殖系統(tǒng)中，miR-202-3p通過抑制細(xì)胞周期因子和RNA結(jié)合蛋白來維持小鼠SSCs[21]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NOA組患者miR-202-3p的表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組和弱精子癥組(P<0.05)，而弱精子癥組miR-202-3p的表達(dá)水平與對(duì)照組比較無顯著性差異(P>0.05)。有研究表明，精漿中miRNAs主要來源于精子細(xì)胞的釋放[20]，這或許可以解釋本研究中NOA患者精漿中miR-106b-5p和miR-202-3p含量均顯著降低，而弱精子癥患者精漿中miR-106b-5p和miR-202-3p表達(dá)量卻無顯著變化的現(xiàn)象。

為了探討精漿miR-106b-5p和miR-202-3p對(duì)NOA的診斷價(jià)值，進(jìn)一步繪制ROC曲線顯示，miR-106b-5p和miR-202-3p的ROC-AUC分別為0.750和0.873，二者的ROC-AUC均大于0.7，提示精漿miR-106b-5p和miR-202-3p對(duì)NOA的診斷價(jià)值較好。

本研究納入的病例數(shù)較少，今后應(yīng)擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證本研究結(jié)果的可靠性。其次，應(yīng)進(jìn)一步深入研究miR-106b-5p和miR-202-3p在精子發(fā)生過程中的具體分子調(diào)控機(jī)制，以期為無精子癥的診斷和治療提供理論參考。

綜上所述，不同類型的不育癥患者精漿中miR-106b-5p和miR-202-3p表達(dá)具有顯著差異，且ROC曲線結(jié)果顯示，精漿miR-106b-5p和miR-202-3p有望成為無創(chuàng)性NOA臨床診斷的標(biāo)志物，但尚需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證本結(jié)論。miRNAs在精子發(fā)生中起到重要的調(diào)控作用，可以為不孕不育的研究和治療提供嶄新的思路；另外，對(duì)一些在睪丸組織中特異性表達(dá)的miRNAs及其作用機(jī)制進(jìn)行深入研究，可以為避孕研究提供生物學(xué)基礎(chǔ)。目前，對(duì)于miRNAs在男性生殖健康領(lǐng)域中的調(diào)控機(jī)制仍然有很多未解之謎，但是隨著研究的不斷展開深入，miRNAs可能成為男性生殖系統(tǒng)疾病診斷和預(yù)后分析的新的生物學(xué)標(biāo)志物。