孫 鶯，王玉梅，尉 鵬，楊平榮，謝親建，郭小雨

1 甘肅省藥品檢驗研究院，甘肅 蘭州 730000；2 國家藥監(jiān)局中藥材及飲片質(zhì)量控制研究重點實驗室；3 武警甘肅省總隊醫(yī)院；4 西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院

中藥飲片是指依據(jù)我國傳統(tǒng)的中醫(yī)藥理論，將中草藥進行加工炮制可，直接應(yīng)用于中醫(yī)臨床或制劑生產(chǎn)應(yīng)用的處方藥品［1］。它是一種特殊的藥品類型，介于農(nóng)產(chǎn)品和藥品之間，它的品質(zhì)直接影響藥物臨床使用的安全性和效果［2-4］。微生物污染是飲片外源性污染的主要形式之一，也是影響人體健康的重要途徑［5］，不只對飲片本身和它加工所得的中成藥產(chǎn)物的質(zhì)量優(yōu)劣和使用安全產(chǎn)生影響［6-8］，并且被微生物污染過的藥品物理、化學(xué)性質(zhì)也可能會產(chǎn)生變化，從而使藥品有效性下降，甚至被微生物和酶降解的產(chǎn)品，使用后輕者會出現(xiàn)不良反應(yīng)，重者或出現(xiàn)生命危險［9］。

迄今為止，《歐洲藥典》（European pharmacopoeia，EP）、《美國藥典》（United States pharmacopoeia，USP）、日本藥局方（Japanese pharmaceutical agency，JPA）［10］都收載了植物藥或天然藥的微生物檢查方法和微生物限度標準，如需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)及控制菌的檢查。在現(xiàn)行的2015 版《中華人民共和國藥典》［11］（以下簡稱《中國藥典》），增加了針對研粉口服用貴細飲片、直接口服及泡服飲片中控制菌沙門菌和耐膽鹽革蘭陰性菌的限度要求，但還沒有對需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的限度要求。

研究近年文獻，我們可以看到我國當前較高的中藥飲片的微生物負載量，而且各種中藥飲片的微生物污染量差別很大，迫切需要解決衛(wèi)生方面的質(zhì)量安全問題［12-17］。

甘肅是全國中藥材資源大省，素有“千年藥鄉(xiāng)”之稱，特別是道地藥材種植形成一定規(guī)模。本研究以兩類甘肅道地藥材當歸、黨參中藥飲片為研究對象，考察其微生物污染狀況，初步掌握微生物污染負載水平，為中藥飲片微生物污染風險評估和微生物標準的制定提供數(shù)據(jù)支持，從而推動中藥飲片產(chǎn)業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展。

1 材料與儀器

1.1 中藥飲片本研究所用甘肅省市售當歸中藥飲片共31 批樣品，來源于甘肅、安徽、河北、陜西的26 個不同廠家。市售黨參中藥飲片共30 批樣品，來源于河北、陜西、甘肅、安徽的23 個不同廠家。

1.2 試劑pH 7.0 氯化鈉蛋白胨緩沖液（批號：20191102）；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（tryptone agar medium for soybean，TSA）（批號：20190930）；胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（tryptone liquid medium for soybean，TSB）（批號：20191212）；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（sabouraud dextrose agar，SDA）（批號：20190912）；紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（amaranth bile salt glucose agar medium）（批 號：20190930）；腸道增菌液體培養(yǎng)基（Intestinal bacterial augmentation liquid medium）（批號：20191130）；RV 沙門菌增菌液體培養(yǎng)基（RV Liquid medium for salmonella augmentation）（批 號：20191102）；木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基（Xylose lysine deoxycholate AGAR medium，XLD）（批號：20181124）；三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基（triple sugar iron agar medium，TSI）（批號：20190930）。以上試劑均購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器SW-CJ-2D 型超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；ClassⅡBSC 型生物安全柜（濟南鑫貝西生物技術(shù)有限公司）；BPMJ-250F 型生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；Veriti 型PCR儀（美國賽默飛科技公司）。

2 實驗方法

參照《中國藥典》2015 年版中“非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查微生物計數(shù)法”（通則1105）和“非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查控制菌檢查法”（通則1106）進行檢查［14］。

2.1 供試品溶液的制備稱取10 g樣品，加入到100 mLpH 7.0 氯化鈉蛋白胨緩沖液中，振蕩，制成1∶10的供試品溶液。

2.2 需氧菌總數(shù)(TAMC）計數(shù)取“2.1”項下1∶10供試液，用pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液10倍稀釋至1×10-5，采用平皿法計數(shù)，1 mL/皿，平行制備2 個平皿，傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，33℃培養(yǎng)5天。

2.3 霉菌和酵母菌總數(shù)(TYMC)的測定取“2.1”項下1∶10 供試液，用pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液10倍梯度稀釋至1×10-4，采用平皿法計數(shù)，1 mL/皿，平行制備2個平皿，傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，23℃培養(yǎng)7天。

2.4 控制菌的檢查

2.4.1 耐膽鹽革蘭陰性菌（bile-tolerant gramnegitive bacteria，BGB） 取“2.1”項下1∶10 供試液，按照2015 年版《中國藥典》四部通則“微生物計數(shù)法”［14］進行耐膽鹽革蘭陰性菌的定量檢查和定性檢查。取1×10-1、1×10-2和1×10-3供試品稀釋液1 mL 分別接種至10 mL 腸道增菌液體培養(yǎng)基中，35℃下培養(yǎng)48 h。取相當于l g樣品的上述預(yù)培養(yǎng)物接種至100 mL 腸道菌增菌液體培養(yǎng)基中，33℃培養(yǎng)24 h 后，劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，33℃培養(yǎng)24 h。

2.4.2 沙門菌 取飲片樣品10 g，接種至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基100 mL 內(nèi)，33℃下培養(yǎng)48 h。取上述培養(yǎng)物0.1 mL 接種至10 mLRV 沙門菌增菌液體培養(yǎng)基中，33℃下培養(yǎng)48 h。取少量RV 沙門菌增菌液體培養(yǎng)物劃線接種于木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上，33℃下培養(yǎng)48 h。

3 結(jié)果

3.1 需氧菌總數(shù)檢測結(jié)果將需氧菌總數(shù)（TAMC）的結(jié)果取對數(shù)（以IgTAMC 表示）。以飲片品種為橫坐標、IgTAMC 值為縱坐標作箱式圖，結(jié)果見表1和圖1。本次試驗所選取的61個批次中藥飲片均檢出需氧菌，IgTAMC 的均值為3.32，最小值為2.05，最大值為6.30。61批飲片樣品的IgTAMC 值均小于7.0，整體水平符合歐洲、日本藥典標準。61 批樣品中只有1 批當歸飲片IgTAMC 值超過6.0，即98.4%的飲片符合歐洲、美國、日本藥典標準。各國藥典與中藥飲片相當?shù)闹参锼幓蛏幍奈⑸锵薅戎狄姳?。當歸飲片的IgTAMC 值為2.60～6.30，表明其污染的TAMC 各批間差異較大，質(zhì)量不穩(wěn)定；黨參飲片的IgTAMC 值為2.05～5.05，表明其污染的TAMC 較當歸低，且各批間差異小。

表1 飲片樣品TAMC和TYMC測定結(jié)果

圖1 中藥飲片樣品中需氧菌總數(shù)計數(shù)結(jié)果

3.2 霉菌和酵母菌總數(shù)檢測結(jié)果酵母菌和霉菌也是中藥飲片中常見的污染菌，部分霉菌會產(chǎn)生有毒代謝物，危害極大。本試驗中兩種飲片共61 批樣品均檢出酵母菌和霉菌，以飲片品種為橫坐標、酵母菌和霉菌總數(shù)的Ig 值為縱坐標作箱式圖，見圖2，由圖可知，61 批次中藥飲片IgTYMC 的均值為1.69，最小值為0.70，最大值為3.23，表明這2 種飲片樣品的TYMC 負載相對較低。31 批當歸中藥飲片，IgTYMC 值為0.70～3.23，IgTYMC 最大值為3.23，IgTYMC 值總體均數(shù)為1.86；30 批黨參中藥飲片樣品，IgTYMC最大值為2.49，IgTYMC值總體均數(shù)1.52。約60%的當歸飲片樣品IgTYMC介于1.50～2.00，約67%的黨參樣品IgTYMC 介于1.25～2.00；所有飲片中，僅當歸中的1 批樣品IgTYMC大于3.00，其余所有飲片樣品IgTYMC均小于3.00。結(jié)果表明61 批當歸和黨參中藥飲片均符合《美國藥典》《歐洲藥典》《日本藥典》限度標準，不同批次樣品之間差別小，質(zhì)量穩(wěn)定，見表2。當歸飲片的霉菌和酵母菌污染程度高于黨參飲片。

圖2 中藥飲片樣品中酵母菌和霉菌總數(shù)計數(shù)結(jié)果

表2 各國藥典與中藥飲片相當?shù)闹参锼幓蛏幍奈⑸锵薅戎?/p>

3.3 控制菌測定結(jié)果

3.3.1 耐膽鹽革蘭陰性菌 61 批中藥飲片中，29 批檢出耐膽鹽革蘭陰性菌，占47.5%，其中當歸24 批，黨參5 批，分別占各自批數(shù)的77.0%和16.7%。不同批次和來源的同種飲片耐膽鹽革蘭陰性菌差別很大，黨參飲片耐膽鹽革蘭陰性菌污染程度較低，明顯低于當歸飲片。

3.3.2 沙門菌檢測 經(jīng)檢驗，61 批飲片中均未檢出沙門菌。

4 討論

甘肅是我國中藥材種植最大省份之一，當歸和黨參又是甘肅的道地大宗中藥材。這兩種根類藥材，因生長在土壤中，較長時間接觸到土壤中的有害元素和各種微生物，容易受到栽種的環(huán)境、肥料的影響，也容易受到外來微生物的污染。為了加強中藥飲片在臨床上使用的安全有效，本研究以市售甘肅道地藥材當歸和黨參中藥飲片為實驗對象，參照《中國藥典》（2015 版）四部通則的非無菌產(chǎn)品微生物檢查方法，從TAMC、TYMC、耐膽鹽革蘭陰性菌和沙門菌這四方面對微生物污染水平進行評價。因為《中國藥典》（2015 版）當前對需氧菌總數(shù)、酵母菌和霉菌總數(shù)限度標準未做出要求，本文從現(xiàn)行《美國藥典》《歐洲藥典》《日本藥典》三方面進行判定。

研究結(jié)果顯示，甘肅省市售的61 批當歸和黨參中藥飲片均檢出需氧菌、酵母菌和霉菌，61批飲片需氧菌總數(shù)平均值超過103CFU/g，最大值超過106CFU/g。霉菌及酵母菌總數(shù)平均值達到102CFU/g，最大值超過103CFU/g，耐膽鹽革蘭陰性菌檢出率47.5%，全部飲片樣品都沒有檢出含沙門菌，可見微生物負載量較高，污染程度依舊相當嚴重，各中藥飲片樣品的微生物負載量差異很大，同一市售廠家同種中藥飲片不同批次之間微生物污染程度差異也很大［15-17］。

我國中藥飲片品種多，生產(chǎn)、流通、經(jīng)營各個環(huán)節(jié)都可能帶入外源性污染，威脅用藥安全。較中成藥而言，中藥飲片微生物限度要求很長時間以來一直被人們所忽視，數(shù)據(jù)資料顯示我國中藥飲片的載菌量偏高，已經(jīng)對中藥飲片本身和飲片所制得的中成藥的品質(zhì)和使用的安全產(chǎn)生了很大影響，但建立健全的微生物限度標準必定需要大量數(shù)據(jù)的支持，而我國中藥產(chǎn)業(yè)的現(xiàn)狀決定了這還需要很長一段時間的努力才可實現(xiàn)?；诒狙芯拷Y(jié)果，應(yīng)將微生物檢測方法和標準與我國國情相結(jié)合，把握飲片質(zhì)量現(xiàn)狀，制定出合理的標準，全面評估中藥飲片微生物污染的風險。進一步加大過程監(jiān)控力度，強化中藥飲片的生產(chǎn)環(huán)節(jié)，減小中藥飲片臨床利用的安全隱患，增強藥品質(zhì)量安全，推進我省中藥飲片行業(yè)健康發(fā)展，為行業(yè)發(fā)展助力。