王瀟?蒙建州?關(guān)艷?劉思含?張佳煒?李曉輝?劉憶霜

摘要：目的 發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌Pks13（MtPks13）的抑制劑，為后續(xù)針對(duì)以MtPks13為靶點(diǎn)開(kāi)發(fā)抗結(jié)核藥物奠定了基礎(chǔ)。方法 表達(dá)MtPks13-TE蛋白并優(yōu)化其酶活測(cè)定方法，構(gòu)建MtPks13抑制劑高通量篩選模型；與海分枝桿菌表型篩選方法聯(lián)用，對(duì)5萬(wàn)個(gè)化合物進(jìn)行篩選，將獲得的抑制劑IMB-7142進(jìn)行IC50以及酶動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的測(cè)定；表面等離子共振（surface plasmon resonance， SPR）實(shí)驗(yàn)以及分子對(duì)接模型研究陽(yáng)性化合物IMB-7142與MtPks13-TE蛋白是否能發(fā)生相互作用及其作用位點(diǎn)；用菌液稀釋法評(píng)價(jià)IMB-7142對(duì)結(jié)核標(biāo)準(zhǔn)株的抗結(jié)核活性。結(jié)果 成功構(gòu)建了MtPks13抑制劑篩選模型，并發(fā)現(xiàn)了一個(gè)對(duì)MtPks13有抑制作用，同時(shí)抑制海分枝桿菌生長(zhǎng)的化合物IMB-7142，該抑制劑能與MtPks13-TE蛋白發(fā)生相互作用，具有較好的體外抗結(jié)核活性。結(jié)論 成功構(gòu)建了穩(wěn)定的MtPks13抑制劑高通量篩選模型，并且應(yīng)用該模型篩選得到的一個(gè)抑制劑同時(shí)具有抗結(jié)核活性，為后續(xù)開(kāi)發(fā)以MtPks13為靶點(diǎn)抗結(jié)核藥物提供了思路。

關(guān)鍵詞：結(jié)核分枝桿菌；Pks13；抑制劑；抗結(jié)核藥物

中圖分類號(hào)：R978.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Identification of novel anti-tuberculosis lead compound targeting

polyketide synthase 13

Wang Xiao1， Meng Jian-zhou2， Guan Yan1， Liu Si-han1， Zhang Jia-wei3， Li Xiao-hui1， and Liu Yi-shuang1

（1 National Laboratory for Screening New Microbial Drugs， Institute of Medicinal Biotechnology， Peking Union Medical College and Chinese Academy of Medical Sciences， Beijing 100050; 2 Shanghai Key Laboratory of Tuberculosis， Shanghai Pulmonary Hospital， Tongji University School of Medicine， Shanghai 200433; 3 School of Basic Medical Science， Jiamusi University， Jiamusi 154007）

Abstract Objective To discover inhibitors targeting Mycobacterium tuberculosis Pks13， and provide a foundation for the development of novel anti-tuberculosis drugs. Methods Mycobacterium tuberculosis Pks13-TE protein was overexpressed， and then the purified MtPks13-TE was used to establish a high-throughput screening model. In combination with the phenotype screening method of marine Mycobacterium， 50，000 compounds were screened， and the IC50 and enzyme kinetic properties of the lead candidate inhibitor， IMB-7142， were determined. Surface plasmon resonance （SPR） experiment and molecular docking model were used to study whether the positive compound IMB-7142 could interact with MtPks13-TE protein and， if so， its interaction sites. The anti-tuberculosis activity was evaluated by the broth dilution method. Results The screening model for MtPks13 inhibitors was constructed， and the compound IMB-7142 was found to inhibit MtPks13 and the growth of marine Mycobacterium. IMB-7142 could interact with MtPks13-TE and had anti-tuberculosis activity. Conclusion A stable high-throughput screening model for MtPks13 inhibitors was constructed， and the inhibitor obtained using this screening model exhibited anti-tuberculosis activity， which provided a starting point for the subsequent development of anti-tuberculosis drugs targeting MtPks13.

Key words Mycobacterium tuberculosis; Pks13; Inhibitor; Anti-tuberculosis drugs

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染引起的一種嚴(yán)重危害人類健康的慢性傳染病[1]。目前，它仍然是全球10大致死疾病之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織估算，2020年全球約有990萬(wàn)人患結(jié)核病，其中130萬(wàn)人因該病死亡，我國(guó)在30個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家中發(fā)病數(shù)位居第二[2]。2015年世界衛(wèi)生組織（WHO）通過(guò)了1項(xiàng)終止全球結(jié)核病的戰(zhàn)略決議，其目標(biāo)是在2015—2030年之間將結(jié)核病發(fā)病率降低80%，死亡人數(shù)減少90%。然而，由于治療方案不合理，患者依從性差，二線抗結(jié)核藥物的使用不當(dāng)以及代謝和營(yíng)養(yǎng)差異等諸多因素，導(dǎo)致近年來(lái)多藥耐藥結(jié)核分枝桿菌（MDR-MTB）和廣泛耐藥結(jié)核分枝桿菌（XDR-MTB）的出現(xiàn)與快速傳播。

從最新的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)可以看出，結(jié)核病治療以及預(yù)防方面的全球目標(biāo)和現(xiàn)實(shí)狀況之間還存在著巨大差距。并且，近幾十年來(lái)，僅有3種抗結(jié)核藥物被批準(zhǔn)上市。貝達(dá)喹啉（bedaquiline）于2012年獲得美國(guó)FDA的批準(zhǔn)用于結(jié)核病治療，通過(guò)靶向ATP合成酶抑制所有敏感和耐藥性MTB菌株[3-4]，隨后由日本大冢研發(fā)的德拉馬尼（delamanid）獲得歐洲FDA批準(zhǔn)[5]，其主要通過(guò)抑制MTB細(xì)胞壁霉菌酸的合成發(fā)揮作用[6]，對(duì)耐藥結(jié)核分枝桿菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗菌活性。2019年美國(guó)FDA批準(zhǔn)了TB聯(lián)盟的pretomanid與貝達(dá)喹啉、利奈唑胺聯(lián)用，治療廣泛耐藥、不耐受或無(wú)反應(yīng)的耐多藥結(jié)核病。這3個(gè)上市藥物正是因?yàn)槠湫碌淖饔脵C(jī)制和靶點(diǎn)，使其能夠有效地治療MDR-MTB和XDR-MTB的感染。因此，發(fā)現(xiàn)抗結(jié)核藥物新靶標(biāo)，開(kāi)發(fā)新型抗結(jié)核藥物十分迫切。

分枝桿菌的細(xì)胞壁在分枝桿菌的生存力中起重要作用，因而其細(xì)胞壁是結(jié)核病藥物開(kāi)發(fā)新靶點(diǎn)的豐富來(lái)源。分枝菌酸則是構(gòu)成結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁的重要成分，它能形成滲透屏障，防止許多環(huán)境溶質(zhì)進(jìn)入，并賦予對(duì)許多抗生素的天然抗性。抑制分枝菌酸的生物合成已經(jīng)被廣泛認(rèn)為是抗結(jié)核藥物發(fā)現(xiàn)的一個(gè)高效策略[7-9]。在結(jié)核分枝桿菌中，聚酮合酶13（Pks13）主要負(fù)責(zé)分枝菌酸生物合成的最后一步，即C26 α-烷基支鏈和C40-60分枝菌酸脂前體的克萊森型縮合，最終生成α-烷基β-酮酸，而α-烷基β-酮酸是合成分枝菌酸的前體[10-11]。因此，Pks13在分枝菌酸的生物合成中起著至關(guān)重要的作用，同時(shí)它也是抑制這一途徑的一個(gè)有效靶點(diǎn)。Pks13蛋白由5個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，包括：酮基合成酶結(jié)構(gòu)域（keto synthase domain， KS）、?；D(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域（acyltransferase domain， AT）、兩個(gè)?；d體蛋白結(jié)構(gòu)域（acyl-carrier protein domain， ACP） 和硫酯酶結(jié)構(gòu)域（thioesterase domain， TE）。

其中TE結(jié)構(gòu)域主要負(fù)責(zé)催化聚酮類化合物達(dá)到全長(zhǎng)時(shí)從酶中的釋放，這是形成分枝菌酸前體所必需的。2013年Loerger等[10]發(fā)現(xiàn)了一種對(duì)MTB H37Rv有活性的小分子TAM1，并確定其靶點(diǎn)為Pks13，后對(duì)抗性突變體進(jìn)行全基因測(cè)序，發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)位于Pks13的TE結(jié)構(gòu)域。這提示Pks13的TE結(jié)構(gòu)域被賦予作為結(jié)核藥物靶點(diǎn)的巨大潛力。

本研究的目的是構(gòu)建MtPks13-TE抑制劑高通量篩選模型，并應(yīng)用此模型篩選獲得MtPks13抑制劑，為尋找具有MtPks13抑制作用的結(jié)構(gòu)新穎的抗結(jié)核先導(dǎo)化合物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 菌株、細(xì)胞株與載體

大腸埃希菌E. coli DH5α和E. coli BL21 （DE3） 為本室保存；海分枝桿菌（Mycobacterium marinum， BAA-535）由本室保存；結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv（ATCC27294）由北京胸科醫(yī)院保存。人肝癌細(xì)胞HepG2和非洲綠猴腎細(xì)胞Vero由本室保存。pET28a-Pks13-TE質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建并保存。

1.2 試劑與試劑盒

卡那霉素、異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl thiogalactoside ， IPTG）、Tris-HCl購(gòu)自Amresco公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自Topscience公司，CCK-8可被活細(xì)胞中的脫氫酶還原成黃色甲瓚，可利用此特性進(jìn)行細(xì)胞毒性檢測(cè)；4-MUH購(gòu)自Sigma公司；7H9液體培養(yǎng)基購(gòu)自BD公司；質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自Qiagen公司；蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自Thermo公司。篩選所用化合物庫(kù)來(lái)自國(guó)家新藥（微生物）篩選實(shí)驗(yàn)室。

1.3 儀器

?KTA蛋白層析系統(tǒng)、His trapTM HP親和層析柱為Cytiva公司產(chǎn)品；表面等離子共振（surface plasmon resonance， SPR）儀器為Richert公司；酶標(biāo)儀為美國(guó)PerkinElmer公司的PerkinElmer Enspire 2300 Multilabel Reader型。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 結(jié)核分枝桿菌Pks13-TE蛋白的克隆、表達(dá)與純化

結(jié)核分枝桿菌Pks13-TE蛋白的克隆、表達(dá)與純化見(jiàn)之前的方法所述[12]，最終將得到的成分中較純的蛋白進(jìn)行定量，加入甘油，凍于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

2.2 Pks13-TE酶活性的測(cè)定

本研究使用4-甲基傘形基庚酸酯（4-methylumbelliferyl heptanoate，4-MUH）作為底物[10]，在Pks13-TE蛋白的催化下，4-MUH會(huì)被水解為4-甲基傘形酮（4-methylumbelliferone，4-MU），通過(guò)在激發(fā)光355 nm、發(fā)射光460 nm處檢測(cè)熒光值，來(lái)判斷水解產(chǎn)物4-MU的量，從而反映出Pks13-TE蛋白的活性。

為了確定合適的底物濃度，將0.5 μmol/L Pks13-TE蛋白與不同濃度的4-MUH（1.56～200 μmol/L）加入96孔黑板（Costar）進(jìn)行孵育，置于酶標(biāo)儀37℃條件下檢測(cè)熒光讀數(shù)，5 min讀1次，共檢測(cè)120 min。使用前期處于線性范圍內(nèi)的點(diǎn)計(jì)算酶反應(yīng)初始速率，以4-MUH濃度為橫坐標(biāo)，初始反應(yīng)速率為縱坐標(biāo)，使用GraphPad軟件進(jìn)行米氏方程擬合分析，確定動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km值。

2.3 海分枝桿菌對(duì)化合物庫(kù)進(jìn)行初篩

由于MTB需要在三級(jí)生物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行操作，因此本研究選擇與MTB基因相似性高達(dá)95%以上的海分枝桿菌作為體外篩選的模式菌，對(duì)化合物庫(kù)中5萬(wàn)個(gè)樣品進(jìn)行初步篩選。將海分枝桿菌用7H9培養(yǎng)基（含10% OADC，0.05%吐溫80）培養(yǎng)，每孔加入200 μL接種有對(duì)數(shù)期海分枝桿菌的7H9培養(yǎng)液（終濃度A600≈0.1），化合物篩選的終濃度為50 μg/mL，30℃靜置培養(yǎng)5～7 d，觀察結(jié)果。將抑制海分枝桿菌生長(zhǎng)的化合物挑選出來(lái)，建立為初篩陽(yáng)性庫(kù)。

2.4 Pks13-TE蛋白抑制劑高通量篩選模型的建立與篩選

運(yùn)用2.2所述方法，對(duì)酶促反應(yīng)時(shí)間和酶的用量進(jìn)行優(yōu)化。依據(jù)Km值，設(shè)置底物4-MUH濃度為30 μmol/L，然后與不同濃度的Pks13-TE蛋白（0～7.2 μmol/L）孵育，置于酶標(biāo)儀37℃條件下檢測(cè)熒光讀數(shù)，10 min讀一次，共檢測(cè)120 min?？紤]到高通量篩選模型信號(hào)背景比大于3，且孵育時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)、酶用量不宜過(guò)大以確保通量，最終確定的酶活檢測(cè)體系如下：0.1 mol/L Tris-HCl pH 7.0，30 μmol/L 4-MUH，1.8 μmol/L Pks13-TE蛋白，反應(yīng)時(shí)間為20 min。

運(yùn)用上述優(yōu)化的酶活測(cè)定方法，對(duì)建立的初篩陽(yáng)性化合物庫(kù)中樣品以終濃度20 μg/mL進(jìn)行篩選，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組（含相同含量的DMSO）和陽(yáng)性對(duì)照組（不加入Pks13-TE蛋白，即酶活性完全被抑制）。抑制率計(jì)算公式如下：酶抑制率=（陰性對(duì)照組-加入化合物的實(shí)驗(yàn)組）/（陰性對(duì)照組-陽(yáng)性對(duì)照組）×100%。經(jīng)過(guò)初篩和復(fù)篩之后，得到抑制效果最好的抑制劑IMB-7142。

2.5 IMB-7142對(duì)海分枝桿菌的MIC測(cè)定

海分枝桿菌用7H9培養(yǎng)基（含10% OADC，0.05%吐溫80）培養(yǎng)，在96孔板中。每孔加入200 μL接種有對(duì)數(shù)期海分枝桿菌的7H9培養(yǎng)液（終濃度A600≈0.1），化合物的終濃度依次為0、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64和128 μg/mL，30℃靜置培養(yǎng)5～7 d觀察結(jié)果，孔內(nèi)完全抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最小藥物濃度為最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組（含相同DMSO含量的7H9培養(yǎng)基）和陽(yáng)性對(duì)照組（異煙肼 0.5 μg/mL）。

2.6 IMB-7142在Pks13-TE蛋白抑制劑模型上的IC50測(cè)定

將篩選得到的陽(yáng)性化合物用DMSO配置成10 mg/ mL的母液，將化合物倍比稀釋，使其終濃度分別為0.78、1.56、3.125、6.25、12.5、25、50和100 μg/mL，按照上述的酶活體系，分別獲得化合物不同濃度條件下的抑制率，以化合物濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)，利用Graphpad prism 5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合分析，獲得半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。

2.7 IMB-7142對(duì)Pks13-TE蛋白抑制作用的酶動(dòng)力學(xué)研究

篩選條件下，分別將底物4-MUH、化合物IMB-1742進(jìn)行濃度倍比稀釋，對(duì)于同一濃度的化合物，設(shè)置7個(gè)4-MUH濃度梯度（120、60、30、15、7.5、3.75和1.875 μmol/L），同時(shí)對(duì)陽(yáng)性化合物設(shè)置5個(gè)濃度梯度（100、50、25和12.5 μg/mL）。按照反應(yīng)速率=（FT2- FT1）/（T2-T1）計(jì)算各底物濃度下對(duì)應(yīng)的不同化合物濃度的反應(yīng)速率。采用Lineweaver-Burk作圖法以4-MUH濃度的倒數(shù)為橫坐標(biāo)，以反應(yīng)速率的倒數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制不同抑制劑濃度作用下的曲線，依據(jù)這些直線的交點(diǎn)位置推測(cè)抑制劑的類型。

2.8 SPR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)IMB-7142與Pks13-TE蛋白的結(jié)合情況

SPR實(shí)驗(yàn)首先將Pks13-TE蛋白固定在帶有葡聚糖的CM5芯片上，隨后使用PBST緩沖液將陽(yáng)性化合物梯度稀釋（100、50和25 μmol/L），保證每個(gè)濃度均含5%的DMSO，后將稀釋好的化合物由低濃度到高濃度依次流經(jīng)芯片。SPR實(shí)驗(yàn)使用Reichert 2SPR system儀器完成，結(jié)果使用TraceDrawer軟件進(jìn)行分析。

2.9 分子對(duì)接分析IMB-7142與Pks13-TE蛋白的相互作用位點(diǎn)

為了探究陽(yáng)性化合物的結(jié)構(gòu)如何影響其對(duì)Pks13-TE蛋白的抑制作用，使用了Discovery Studio 2019對(duì)化合物和Pks13-TE進(jìn)行分子對(duì)接分析。Pks13-TE的晶體結(jié)構(gòu)來(lái)自于Protein Data Bank數(shù)據(jù)庫(kù)（PDB：5V3Y），其蛋白結(jié)構(gòu)由一個(gè)核心結(jié)構(gòu)域和一個(gè)蓋子結(jié)構(gòu)域組成，活性口袋位于這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間的界面。用分子對(duì)接軟件對(duì)IMB-7142分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化，并與活性口袋進(jìn)行對(duì)接，選出打分最高的對(duì)接模型分析其相互作用。

2.10 IMB-7142抗結(jié)核活性的測(cè)定

將待測(cè)化合物用DMSO溶解后，在96孔板檢測(cè)IMB-7142對(duì)Mtb H37Rv 的MIC，同時(shí)設(shè)置異煙肼為陽(yáng)性對(duì)照。每孔加入200 μL接種有對(duì)數(shù)期Mtb H37Rv的7H9培養(yǎng)液（終濃度A600≈0.1），化合物的終濃度依次為0、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64和128 μg/mL，37℃靜置培養(yǎng)7 d觀察結(jié)果，獲得MIC。

2.11 CCK-8檢測(cè)化合物的細(xì)胞毒性

HepG2細(xì)胞以5×104/mL接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，Vero細(xì)胞以2×104/mL接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔體積100 μL，同時(shí)96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的邊緣孔以無(wú)菌PBS填充，盡量避免邊緣效應(yīng)。將細(xì)胞置于37℃，5% CO2條件下過(guò)夜培養(yǎng)，使細(xì)胞貼壁。使用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基將化合物IMB-7142進(jìn)行2倍梯度稀釋10個(gè)濃度（200～0.39 μmol/L），每孔加入200 μL。各個(gè)濃度均做3個(gè)復(fù)孔，并設(shè)置含等量DMSO的對(duì)照組和無(wú)細(xì)胞僅含培養(yǎng)基的空白組。培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μL的CCK-8，于細(xì)胞培養(yǎng)箱37℃孵育1～4 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)在450 nm下的吸光值，計(jì)算細(xì)胞存活率。存活率計(jì)算公式如下：存活率=（給藥組A值-空白組A值）/（對(duì)照組A值-空白組A值）×100%。以化合物濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，存活率為縱坐標(biāo)，利用Graphpad prism 5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合分析，獲得IC50。

3 結(jié)果

3.1 Pks13-TE的活性測(cè)定

在Pks13-TE蛋白的催化下，底物4-MUH會(huì)被水解為4-MU，在激發(fā)光355 nm、發(fā)射光460 nm處檢測(cè)熒光值，通過(guò)水解產(chǎn)物4-MU的變化量來(lái)反應(yīng)Pks13-TE的催化活性。結(jié)果顯示，隨著4-MUH濃度的增加，Pks13-TE的活性越來(lái)越強(qiáng)，直至達(dá)到平臺(tái)期，Km值為28.7 μmol/L（圖1）。

3.2 海分枝桿菌BAA-535對(duì)化合物庫(kù)進(jìn)行初篩

利用模式菌海分枝桿菌對(duì)化合物庫(kù)中的5萬(wàn)樣品進(jìn)行篩選，如果化合物能夠完全抑制海分枝桿菌的生長(zhǎng)，則被認(rèn)為是初篩陽(yáng)性的化合物。通過(guò)篩選，共得到849個(gè)初篩陽(yáng)性的化合物，建立初篩陽(yáng)性化合物庫(kù)。

3.3 Pks13-TE抑制劑高通量篩選模型的建立與篩選

以實(shí)驗(yàn)方法2.2所述為基礎(chǔ)，將蛋白進(jìn)行梯度稀釋，檢測(cè)120 min（每隔10 min檢測(cè)一次）內(nèi)酶促反應(yīng)情況，以對(duì)酶活反應(yīng)體系中的酶用量和反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化（圖2A）。依據(jù)高通量篩選模型信號(hào)噪聲比＞3以及高通量篩選過(guò)程的時(shí)間成本，最終選定的酶活檢測(cè)條件為蛋白用量1.8 μmol/L，反應(yīng)時(shí)間為20 min。經(jīng)評(píng)價(jià)，模型的Z'因子為0.98，信號(hào)噪音比、信號(hào)背景比均符合高通量篩選的要求。對(duì)初篩陽(yáng)性化合物庫(kù)中的849個(gè)化合物進(jìn)行篩選，最終得到一個(gè)具有較好抑制活性的化合物IMB-7142，其結(jié)構(gòu)如圖2B所示。

3.4 陽(yáng)性化合物IMB-1742對(duì)Pks13-TE抑制作用的IC50測(cè)定

IMB-1742對(duì)Pks13-TE活性抑制作用如圖2C所示，隨著化合物濃度的增高，對(duì)Pks13-TE蛋白抑制作用逐漸增強(qiáng)，表現(xiàn)出明顯的濃度依賴性。通過(guò)Graphpad Prism 5軟件對(duì)曲線進(jìn)行擬合分析，可得陽(yáng)性化合物IMB-1742對(duì)Pks13-TE酶活性的IC50約為14.52 μg/mL。

3.5 陽(yáng)性化合物IMB-1742對(duì) Pks13-TE抑制作用的酶動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的研究

對(duì)IMB-1742抑制Pks13-TE活性的作用類型進(jìn)行研究，在不同濃度的抑制劑作用下，反應(yīng)速度隨底物濃度而變化。采用Lineweaver-Burk曲線法，以底物濃度的倒數(shù)為橫坐標(biāo)，反應(yīng)速率的倒數(shù)為縱坐標(biāo)作圖。結(jié)果如圖3顯示，不同濃度IMB-1742的抑制曲線交于縱軸正半軸，推測(cè)陽(yáng)性化合物IMB-1742可能為4-MUH的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。

3.6 SPR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)陽(yáng)性化合物IMB-1742與Pks13-TE蛋白的相互作用

SPR實(shí)驗(yàn)由Reichert 2SPR system儀器完成，將PBST緩沖液梯度稀釋的陽(yáng)性化合物（100、50和25 μmol/L）由低濃度到高濃度依次流經(jīng)固定有Pks13-TE蛋白的CM5芯片，結(jié)果顯示，IMB-1742能夠劑量依賴性的與Pks13-TE蛋白結(jié)合（圖4），其結(jié)合的KD值為4.08×10-4? mol/L。

3.7 陽(yáng)性化合物IMB-1742與Pks13-TE的分子對(duì)接結(jié)果

Pks13-TE蛋白的活性中心位于其核心結(jié)構(gòu)域和蓋子結(jié)構(gòu)域之間的界面，將配體結(jié)合到Pks13-TE蛋白的活性中心，結(jié)果如圖5所示，IMB-1742結(jié)構(gòu)中的酰胺基團(tuán)的活潑氫原子作為氫鍵供體能夠與Asn1640形成氫鍵作用力。噻吩取代基可以與Tyr1663、Tyr1674形成π-π堆積相互作用，結(jié)構(gòu)中大的芳香母核結(jié)構(gòu)與His1664同樣形成π-π堆積相互作用。同時(shí)，四氫吡咯中的氮原子與Asp1644和Phe1670兩個(gè)氨基酸殘基分別存在Pi-Cation相互作用力。此外，IMB-1742還能與Ser1533等形成范德華力。

3.8 陽(yáng)性化合物IMB-1742的抗菌活性評(píng)價(jià)

陽(yáng)性化合物IMB-1742對(duì)海分枝桿菌、結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv的MIC分別為16和8 μg/mL（表1）。

3.9 陽(yáng)性化合物IMB-1742的細(xì)胞毒性檢測(cè)結(jié)果

采用CCK-8試劑盒檢測(cè)IMB-1742對(duì)HepG2和Vero細(xì)胞的毒性影響，結(jié)果如圖6所示，陽(yáng)性化合物對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的IC50為73.61 μmol/L，對(duì)Vero細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的IC50為79.94 μmol/L，說(shuō)明IMB-1742對(duì)細(xì)胞毒性較小。

4 討論

分枝菌酸是分枝桿菌細(xì)胞壁中含量豐富且特異的脂質(zhì)成分[13]。通過(guò)切斷合成分枝菌酸的通路，除可產(chǎn)生抗結(jié)核作用外，還可提高其他抗結(jié)核藥物在菌體的濃度，利于組建聯(lián)合用藥方案[14]。因此，分枝菌酸生物合成途徑中的各種酶可作為結(jié)核病藥物研究的靶點(diǎn)來(lái)源。Pks13是分枝菌酸生物合成最后一步的關(guān)鍵蛋白，它對(duì)分枝桿菌的生存至關(guān)重要[15]。如果Pks13蛋白被抑制，分枝菌酸合成途徑受阻，將會(huì)破壞結(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞壁，最終導(dǎo)致菌體的死亡。因此，以MtPks13蛋白為靶點(diǎn)，可能會(huì)獲得具有抗結(jié)核活性的先導(dǎo)化合物。近年來(lái)，僅有4類Pks13抑制劑被報(bào)道，分別是噻吩類[16]、苯并呋喃類[10]、香豆雌酚類[17-18]和β-內(nèi)脂類[19]，目前對(duì)具有新型母核結(jié)構(gòu)、且具有抗結(jié)核活性的Pks13抑制劑有著強(qiáng)烈的需求。

本研究對(duì)結(jié)核分枝桿菌Pks13蛋白的TE結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了表達(dá)純化，通過(guò)酶活性的測(cè)定與評(píng)價(jià)，建立了以MtPks13-TE為靶點(diǎn)的高通量篩選模型。利用該模型對(duì)初篩得到的849個(gè)具有抗海分枝桿菌活性的化合物進(jìn)行再次篩選，選取活性較好的IMB-1742進(jìn)行進(jìn)一步的研究。IMB-1742雖然包含苯并呋喃環(huán)，但此環(huán)連接了一個(gè)柔性長(zhǎng)鏈基團(tuán)，這點(diǎn)不同于已發(fā)現(xiàn)的苯并呋喃類Pks13抑制劑。我們通過(guò)SPR實(shí)驗(yàn)證明IMB-1742能夠與MtPks13-TE蛋白發(fā)生相互作用，其KD值為4.08×10-4 mol/L，屬于中等強(qiáng)度的結(jié)合。進(jìn)一步，我們使用分子對(duì)接軟件分析了化合物如何抑制MtPks13-TE的活性。MtPks13-TE活性中心位于核心結(jié)構(gòu)域和蓋子結(jié)構(gòu)域之間的界面，結(jié)果顯示，IMB-1742能與MtPks13-TE蛋白的多個(gè)活性關(guān)鍵氨基酸（Asn1640、Phe1670、Asp1644、Ser1533）形成相互作用，說(shuō)明化合物很可能與底物競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合蛋白的活性位點(diǎn)，進(jìn)而抑制蛋白的催化功能，從而發(fā)揮抗菌活性。SPR和分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)為后續(xù)修飾化合物IMB-1742提供了方向，以增強(qiáng)與蛋白結(jié)合的親和力和穩(wěn)定性，提高抗菌活性。

本研究獲得了1個(gè)MtPks13-TE的選擇性抑制劑IMB-1742。該化合物表現(xiàn)出較好的體外抗結(jié)核活性， 可與MtPks13-TE蛋白結(jié)合并能濃度依賴性的抑制其活性。IMB-1742沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性， 通過(guò)結(jié)構(gòu)改造有可能成為抗結(jié)核先導(dǎo)化合物，為針對(duì)以MtPks13為靶點(diǎn)開(kāi)發(fā)抗結(jié)核藥物提供了新思路。

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收稿日期：2022-04-13

作者簡(jiǎn)介：王瀟，女，生于1988年，助理研究員，博士，主要從事抗結(jié)核藥物的發(fā)現(xiàn)和機(jī)制研究，E-mail： wangxiao_1107@163.com

*通訊作者，E-mail： liuys@imb.pumc.edu.cn