范佳兒 劉銀榕 晁志 田恩偉

關(guān)鍵詞當(dāng)歸補(bǔ)血丸;指紋圖譜;阿魏酸;毛蕊異黃酮葡萄糖苷;黃芪甲苷;含量測定;質(zhì)量控制

當(dāng)歸補(bǔ)血湯出自《內(nèi)外傷辨惑論》，由當(dāng)歸、黃芪按1 ∶5 的比例配伍而成，具有益氣生血的功效，主治血虛陽浮發(fā)熱證，為甘溫除熱法代表方之一[1]。當(dāng)歸補(bǔ)血丸由當(dāng)歸補(bǔ)血湯改良而來：將當(dāng)歸160 g、黃芪400 g 粉碎成細(xì)粉，過篩，混勻，加煉蜜30～40 g 與適量的水，泛丸，干燥，即得[2-3]。當(dāng)歸補(bǔ)血丸中含有多種黃酮苷類、氨基酸類、有機(jī)酸類等成分[4]，具有補(bǔ)氣養(yǎng)血的功效，用于身體虛弱、氣血兩虛，是婦科臨床常用中成藥[2]。

目前，僅有《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)（中藥成方制劑第一冊）》從顯微鑒別和薄層鑒別項對當(dāng)歸補(bǔ)血丸進(jìn)行定性質(zhì)量控制[2]，尚缺乏相應(yīng)的定量標(biāo)準(zhǔn)。雖然有研究對當(dāng)歸補(bǔ)血丸開展了定量研究，分別建立了阿魏酸和藁本內(nèi)酯含量測定的高效液相色譜（HPLC）法[5-6]，但上述研究也僅對組方中當(dāng)歸的指標(biāo)成分進(jìn)行了測定。當(dāng)歸補(bǔ)血丸中化學(xué)成分多樣，僅對單一成分進(jìn)行定量檢測無法全面反映其整體質(zhì)量。當(dāng)歸補(bǔ)血丸中以黃芪為君藥，當(dāng)歸為臣藥，處方具有補(bǔ)氣生血的功效。毛蕊異黃酮葡萄糖苷和黃芪甲苷是黃芪中的主要藥效成分，具有提高免疫力、抗癌等多方面的藥理作用[7-10]，可作為質(zhì)量評價指標(biāo)。阿魏酸作為當(dāng)歸的主要有效成分之一，是2020 版《中國藥典》（一部）規(guī)定的當(dāng)歸指標(biāo)性成分，具有增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤、抗氧化、抗抑郁和保肝等藥理作用[11-14]。鑒于此，本研究以來源于2 個廠家的15批當(dāng)歸補(bǔ)血丸為樣本，建立HPLC指紋圖譜，并同時采用HPLC法測定其中阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷和黃芪甲苷的含量，以期為當(dāng)歸補(bǔ)血丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善及其質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器有1260型HPLC儀、G1315B型二極管陣列（DAD）檢測器（美國Agilent 公司），Alltech 3300 型蒸發(fā)光散射（ELSD）檢測器（美國Alltech公司），BSA224S-CW型電子天平（德國Sartorius 公司），HH-S6 型水浴鍋（江蘇金怡儀器科技有限公司），YM-080S型超聲波清洗機(jī)（深圳市方奧微電子有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

當(dāng)歸、黃芪藥材由南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院田恩偉副教授于2020 年7 月分別從甘肅岷縣、河北承德采集，并由其鑒定分別為傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels 和豆科植物膜莢黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根。本研究共收集了2 個廠家的15 批當(dāng)歸補(bǔ)血丸樣品，其中來自A 廠家的樣品有7 批（批號分別為20062022、19123021、21032722、21041122、20092021、21062221、20112321，規(guī)格為6 g×10 袋，編號S1～S7），來自B廠家的樣品有8 批（批號分別為190204、190302、190306、190308、190311、190504、190505、190809，規(guī)格為6 g×10 袋，編號S8～S15）。阿魏酸對照品（批號110773-201915，純度≥99.4%）、黃芪甲苷對照品（批號110781-202118，純度≥96.9%）均購自北京瑞達(dá)恒輝科技發(fā)展有限公司;毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品（批號wkq21010405，純度≥98%）購自四川省維克奇生物科技有限公司;乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用Hypersil ODS2 C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm），以乙腈（A）-0.2%甲酸溶液（B）為流動相進(jìn)行梯度洗脫（0～10 min，5%A→8%A;10～15 min，8%A→12%A;15～25 min，12%A→20%A;25～35 min，20%A→25%A;35～42 min，25%A;42～50 min，25%A→40%A;50～65 min，40%A→80%A;65～75 min，80%A）;流速為1.0 mL/min;柱溫為25 ℃;進(jìn)樣量為20 μL;DAD檢測器的檢測波長為250 nm（毛蕊異黃酮葡萄糖苷）、323 nm（阿魏酸）;ELSD檢測器（黃芪甲苷）的條件為氮氣流速1.5 L/min、漂移管溫度80 ℃、增益值4。

2.2 混合對照品溶液的制備

取阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、黃芪甲苷對照品各適量，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為1.242mg/mL 的阿魏酸母液、0.846 mg/mL 的毛蕊異黃酮葡萄糖苷母液、1.940 mg/mL 的黃芪甲苷母液。取各對照品母液1 mL，置于同一10 mL量瓶中，用甲醇稀釋并定容，得到阿魏酸質(zhì)量濃度為124.2 μg/mL、毛蕊異黃酮葡萄糖苷質(zhì)量濃度為84.6 μ g/mL、黃芪甲苷質(zhì)量濃度為194.0 μg/mL的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取2 g 當(dāng)歸補(bǔ)血丸細(xì)粉于錐形瓶中，加入100 mL含4%濃氨試液的80%甲醇（取濃氨試液4 mL，加80%甲醇至100 mL，搖勻即得），稱定質(zhì)量;然后以80 ℃水浴回流1 h，冷卻后，再次稱定質(zhì)量，用含4%濃氨試液的80%甲醇補(bǔ)足損失的質(zhì)量;抽濾，取50 mL濾液蒸干，殘渣用80%甲醇復(fù)溶，轉(zhuǎn)移到10 mL量瓶中，并以80%甲醇定容，搖勻;用微孔濾膜（0.22 μm）濾過，取續(xù)濾液，即得[8]。

2.4 對照藥材溶液的制備

取當(dāng)歸藥材細(xì)粉和黃芪藥材細(xì)粉各1 g，按“2.3”項下方法制備當(dāng)歸對照藥材溶液和黃芪對照藥材溶液。

2.5 HPLC指紋圖譜的建立及分析

2.5.1 精密度試驗取當(dāng)歸補(bǔ)血丸（S15）細(xì)粉適量，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6 次，記錄色譜圖。結(jié)果，以32 號峰為參照峰，計算得各共有峰相對保留時間的RSD 為0.06%～0.23%（n=6）、相對峰面積的RSD 為0.97%～3.09%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.5.2 重復(fù)性試驗取同一批當(dāng)歸補(bǔ)血丸（S15）細(xì)粉適量，共稱取6 份，按“2.3”項下方法平行制備6 份供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果，以32 號峰為參照峰，計算得各共有峰相對保留時間的RSD為0.08%～0.09%（n=6）、相對峰面積的RSD為1.05%～2.54%（n=6），表明此方法重復(fù)性良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗取當(dāng)歸補(bǔ)血丸（S15）細(xì)粉適量，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，分別在室溫下放置0、2、4、8、12、24 h 時，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果，以32 號峰為參照峰，計算得各共有峰相對保留時間的RSD為0.02%～0.07%（n=6）、相對峰面積的RSD為0.49%～2.57%（n=6），表明該供試品溶液在室溫下24 h 內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

2.5.4 指紋圖譜生成及相似度評價取15 批當(dāng)歸補(bǔ)血丸樣品細(xì)粉，分別按“2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件（其中檢測波長為323 nm）進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。將15 批樣品的HPLC 圖譜導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012 版）》中，選擇樣品S1 的圖譜作為參照圖譜，經(jīng)多點校正后，進(jìn)行全譜峰匹配生成疊加指紋圖譜，并以中位數(shù)法生成對照指紋圖譜R（見圖1）。以對照指紋圖譜R為參照，對各樣品的色譜圖進(jìn)行相似度評價。結(jié)果，在15 批樣品的疊加指紋圖譜中共發(fā)現(xiàn)33 個共有峰。與生成的對照圖譜R比較，15 批樣品色圖譜的相似度在0.893～0.995 之間（見表1），表明15批樣品的化學(xué)成分組成基本相同。

2.5.5 共有峰的指認(rèn)和歸屬取當(dāng)歸對照藥材溶液、黃芪對照藥材溶液、“2.2”項下混合對照品溶液和“2.3”項下供試品溶液（S1），分別按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖（見圖2）。通過與混合對照品溶液色譜圖進(jìn)行比對，可指認(rèn)出13 號峰為阿魏酸、15 號峰為毛蕊異黃酮葡萄糖苷;通過與對照藥材色譜圖進(jìn)行比對，可發(fā)現(xiàn)1～3、7、8、10、12、13（阿魏酸）、17～19、27～29、32、33 號峰歸屬于當(dāng)歸，14、15（毛蕊異黃酮葡萄糖苷）、20～23、25號峰歸屬于黃芪。

2.6 指標(biāo)成分含量測定

2.6.1 專屬性試驗分別取“2.2”項下混合對照品溶液、“2.3”項下供試品溶液（S15）及空白溶劑（80%甲醇），按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖（見圖3）。結(jié)果顯示，阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、黃芪甲苷的保留時間分別為25.948、27.465、54.664 min，與相鄰色譜峰的分離度均大于2.0，理論板數(shù)均大于80 000，且空白溶劑對測定無干擾，表明該方法的專屬性良好。

2.6.2 線性關(guān)系及檢測限、定量限考察分別取“2.2”項下混合對照品溶液0.8、1.0、1.5、2.5、5 mL 于5 mL 量瓶中，用80%甲醇稀釋至刻度，然后按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以樣品進(jìn)樣量（x）為橫坐標(biāo)，阿魏酸和毛蕊異黃酮葡萄糖苷以峰面積（y）為縱坐標(biāo)、黃芪甲苷以峰面積對數(shù)值（lgy）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸。結(jié)果，3種指標(biāo)成分在各自進(jìn)樣量范圍內(nèi)線性關(guān)系均良好（r 為0.999 0～0.999 5）。取“2.2”項下混合對照品適量，以80%甲醇為溶劑進(jìn)行逐級稀釋，以信噪比10 ∶1、3 ∶1 分別得定量限和檢測限。結(jié)果見表2。

2.6.3 精密度試驗取“2.2”項下混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積。結(jié)果，阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、黃芪甲苷峰面積的RSD分別為2.02%、2.15%、1.09%（n=6），表明儀器的精密度良好。

2.6.4 穩(wěn)定性試驗取“2.3”項下供試品溶液（S15），于室溫下分別放置0、2、4、8、12、24 h 時，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、黃芪甲苷峰面積的RSD 分別為2.37% 、0.60%、0.49%（n=6），表明供試品溶液在室溫下24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.5 重復(fù)性試驗取同一批樣品（S15）6 份，每份約2.00 g，分別按“2.3”項下方法制備供試品溶液，然后按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并采用外標(biāo)法計算含量。結(jié)果，阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、黃芪甲苷的含量分別為0.093 6、0.361 9、0.915 9 mg/g，RSD分別為1.62%、2.99%、1.56%（n=6），表明該方法的重復(fù)性良好。

2.6.6 加樣回收率試驗精密稱取已知含量的樣品（S15）6 份，每份約1.00 g，分別按已知成分含量1 ∶1 的比例加入混合對照品溶液（按“2.2”項下方法制備），然后按“2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算其加樣回收率。結(jié)果顯示，阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、黃芪甲苷的平均加樣回收率分別為95.08%、100.96%、98.19%，RSD 分別為2.56%、2.93%、2.59%（n=6），表明該方法的準(zhǔn)確度較好。結(jié)果見表3。

2.6.7 樣品含量測定取15 批當(dāng)歸補(bǔ)血丸樣品細(xì)粉，分別按“2.3”項下方法制備供試品溶液，然后按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并采用外標(biāo)法計算3 種成分的含量。每批樣品平行測定3 次，取平均值。結(jié)果顯示，15 批當(dāng)歸補(bǔ)血丸樣品中阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、黃芪甲苷的平均含量分別為0.050 1、0.402 6、0.913 4 mg/g。B廠家各批次當(dāng)歸補(bǔ)血丸樣品中黃芪甲苷的含量（0.891 2～0.940 0 mg/g）與A廠家樣品（0.868 5～0.966 0 mg/g）基本沒有差異，但B廠家各批次當(dāng)歸補(bǔ)血丸樣品中阿魏酸含量（0.037 7～0.093 4 mg/g）明顯高于A廠家樣品（0.024 5～0.047 1 mg/g），且B廠家各批次當(dāng)歸補(bǔ)血丸樣品中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量（0.335 3～0.424 2 mg/g）略低于A 廠家樣品（0.261 6～0.535 6mg/g）。結(jié)果見表4。

3 討論

3.1 樣品提取方法及色譜條件的確定

在前期實驗中，筆者考察了超聲法和加熱回流法對樣品提取效果的影響。結(jié)果顯示，采用加熱回流法提取得到的成分較超聲法更多，且各成分的提取率更高，故本研究采用加熱回流法進(jìn)行樣品提取。本研究測定了阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷以及黃芪甲苷的含量，其中黃芪甲苷因紫外吸收弱，故采用ELSD檢測器進(jìn)行檢測。當(dāng)采用DAD 檢測器對供試品溶液進(jìn)行190～400nm全波長掃描時，發(fā)現(xiàn)在250 nm波長處毛蕊異黃酮葡萄糖苷的吸光度高，在323 nm 波長處阿魏酸的吸光度高，故本研究分別選擇250、323 nm為檢測波長。此外，與250 nm 波長處所得色譜圖進(jìn)行比較，在323 nm 波長處所得色譜圖中共有峰數(shù)目較多、峰形較好，故本研究在進(jìn)行指紋圖譜分析時選擇檢測波長為323 nm。

3.2 當(dāng)歸補(bǔ)血丸指紋圖譜與3種指標(biāo)成分含量的分析通過前期調(diào)查，本課題組發(fā)現(xiàn)目前當(dāng)歸補(bǔ)血丸的在售廠家僅有2 家，故本研究僅選擇上述2 個廠家的15 批樣品進(jìn)行分析。本研究建立了15 批當(dāng)歸補(bǔ)血丸樣品的HPLC指紋圖譜，其與對照指紋圖譜R的相似度均大于0.89，表明15 批樣品的化學(xué)成分組成基本相同。在15 批當(dāng)歸補(bǔ)血丸樣品中，3 個指標(biāo)成分的含量由高到低依次為黃芪甲苷（平均含量為0.913 4 mg/g）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷（平均含量為0.402 6 mg/g）、阿魏酸（平均含量為0.050 1 mg/g）。其中，阿魏酸含量高于魏俊軍[5]報道的結(jié)果（平均含量為0.037 3 mg/g）。本研究結(jié)果顯示，2 個廠家生產(chǎn)的當(dāng)歸補(bǔ)血丸中黃芪甲苷的含量基本一致，但B 廠家大部分批次樣品中阿魏酸含量均高于A廠家樣品，A廠家樣品中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量略高于B廠家樣品。

綜上，本研究建立了當(dāng)歸補(bǔ)血丸的HPLC指紋圖譜及3 種指標(biāo)成分的HPLC 定量分析方法，所建方法準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好，可為當(dāng)歸補(bǔ)血丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善及其質(zhì)量控制提供基礎(chǔ)。