段書(shū)眾，馬思佳，于文會(huì)，王歡歡，張華，王景福

（承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腎臟內(nèi)科，河北 承德 067000）

研究顯示，慢性腎臟病患者血管鈣化的抑制和促進(jìn)因素之間穩(wěn)態(tài)失衡，導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)分化［1］，血管內(nèi)膜、中膜及心臟瓣膜鈣化［2］。血管鈣化是心腦血管疾病的重要危險(xiǎn)因素，與慢性腎衰竭患者心血管并發(fā)癥和全因死亡率相關(guān)［3］。研究［4］顯示高磷血癥是慢性腎臟病患者血管鈣化的決定性因素；高磷血癥導(dǎo)致血管鈣化的機(jī)制包括VSMC向成骨/軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)分化、凋亡小體形成、細(xì)胞外囊泡釋放、細(xì)胞外基質(zhì)蓄積、炎性細(xì)胞因子釋放、氧化應(yīng)激反應(yīng)等。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與VSMC凋亡，導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、血管瘤和血管鈣化等血管疾?。?］。目前，仍無(wú)預(yù)防血管鈣化的有效手段，因此需要探索可能的藥物治療靶點(diǎn)［6］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是否參與高磷誘導(dǎo)的VSMC鈣化鮮有報(bào)道。本研究探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是否參與高磷誘導(dǎo)的血管鈣化過(guò)程及其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

人胸主動(dòng)脈VSMC（美國(guó)ScienCell Research Laboratories）于含10%胎牛血清、100 mg/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素的DMEM培養(yǎng)基中，37 ℃、5%CO2、濕度70%～80%恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2 d更換1次培養(yǎng)液，第5～8代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。設(shè)置對(duì)照組（正常培養(yǎng)）、磷正常濃度（1.3 mmol/L，NP）組、磷高濃度（2.6 mmol/L，HP）組、HP+SP600125組 ［應(yīng)用c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）抑制劑SP600125（美國(guó)Sigma-Aldrich公司，10 μmol/L）預(yù)處理30 min后，高濃度磷（2.6 mmol/L）培養(yǎng)基培養(yǎng)10 d］、HP+siCHOP組［（C/EBP homologous protein，CHOP）siRNA使CHOP基因沉默，高濃度磷（2.6 mmol/L）培養(yǎng)基培養(yǎng)10 d］。

1.2 方法

1.2.1 茜素紅染色觀察各組VSMC鈣沉積：VSMC接種到6孔板中，生長(zhǎng)至60%時(shí)，各組實(shí)施干預(yù)措施，PBS沖洗3次，4%多聚甲醛4 ℃固定10 min，PBS沖洗3次，放入1%茜素紅S溶液內(nèi)染色30 min，然后0.2%醋酸溶液快速?zèng)_洗1次，濾紙吸干后乙醇脫水，二甲苯固定、封片，顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.2 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)各組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及鈣化相關(guān)基因表達(dá)：棄去培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)上清液，PBS沖洗，TRIzol法提取總RNA。取RNA 1 μg，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以cDNA作為PCR擴(kuò)增模板，按照說(shuō)明書(shū)配比反應(yīng)體系，以GAPDH為內(nèi)參基因。引物序列：骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP-2），正向引物 5’-GGGACCCGCTGTCTTCTAGT-3’，反向引物5’-TCAACTCAAATTCGCTGAGGAC-3’；Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runt-related transcription factor 2，Runx-2），正向引物5’-ACTGTGGTTACCGTCATGGC-3’，反向引物 5’-ACTTGGTTTTTCATAACAGCGGA-3’；CHOP，正向引物5’-GGAAACAGAGTGGTCATTCC C-3’，反向引物5’-CTGCTTGAGCCGTTCATTCTC；RNA依賴(lài)的蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（RNA-dependent protein kinase-like endoplasmic reticulum kinase，PERK），正向引物 5’-ACGATGAGACAGAGTTGCGA C-3’，反向引物 5’-ATCCAAGGCAGCAATTCTCCC-3’；肌醇需求因子1（inositol-requiring enzyme1，IRE1），正向引物5’-CATCCCCATGCCGAAGTTCA-3’，反向引物 5’-CTGCTTCTCTCCGGTCAGGA-3’；GAPDH，正向引物 5’-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3’，反 向引物 5’-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3’。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃、5 min；循環(huán)反應(yīng) 95 ℃、15 s，60℃、30 s，共40個(gè)循環(huán)；溶解曲線(xiàn)95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、15 s，60 ℃、15 s?；蛳鄬?duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。

1.2.3 Western blotting檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白CHOP、磷酸化PERK（phosphorylated PERK，p-PERK）、IRE1、磷酸化c-Jun氨基末端激酶（phosphorylated c-Jun N-terminal kinase，p-JNK）及鈣化蛋白BMP-2、Runx-2表達(dá)：于75 cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)各組VSMC，PBS洗滌3次，經(jīng)裂解液在4 ℃下裂解30 min，離心、取上清液，BCA試劑盒測(cè)定蛋白含量。SDS-PAGE電泳分離蛋白組分，轉(zhuǎn)至PVDF膜上5%脫脂奶粉封閉60 min，一抗［分別為抗CHOP（1 ∶1 000）、抗BMP-2（1 ∶1 000）、抗IRE1（1 ∶1 000）、抗p-PERK（1 ∶1 000）、抗p-JNK（1 ∶500）、抗Runx-2（1 ∶1 000）和抗-β-actin（1 ∶5 000）］孵育液內(nèi)4 ℃過(guò)夜，TBST洗滌3次，與相應(yīng)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗結(jié)合，室溫孵育1 h?；瘜W(xué)發(fā)光法顯色發(fā)光，全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)掃描、拍照，Image J軟件分析數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組VSMC鈣沉積比較

結(jié)果顯示，對(duì)照組與NP組未見(jiàn)鈣化表現(xiàn)；HP組VSMC染成深紅色，提示存在細(xì)胞鈣化；HP+SP600125組鈣化較HP組明顯減輕，提示JNK誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡參與了高磷誘導(dǎo)的VSMC鈣化；HP+siCHOP組VSMC鈣化較HP組減輕，提示CHOP誘導(dǎo)的VSMC凋亡也參與了高磷誘導(dǎo)的VSMC鈣化。見(jiàn)圖1。

圖1 各組VSMC鈣沉積比較Fig.1 Comparison of VSMC calcium deposition in each group

2.2 各組VSMC鈣化相關(guān)基因BMP-2、Runx-2和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因IRE1、PERK、JNK、CHOP表達(dá)比較

結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，NP組VSMC相關(guān)基因BMP-2、Runx-2表達(dá)無(wú)明顯增加，提示正常濃度磷無(wú)誘導(dǎo)VSMC鈣化的作用；而HP組BMP-2、Runx-2表達(dá)較對(duì)照組及NP組明顯增高（P＜ 0.05），提示高濃度磷可誘導(dǎo)VSMC鈣化。與對(duì)照組及NP組比較，HP組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因IRE1、PERK、JNK及CHOP表達(dá)均顯著增加（均P＜ 0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 各組VSMC鈣化相關(guān)基因BMP-2、Runx-2，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因IRE1、PERK、JNK、CHOP表達(dá)比較Fig.2 The expression of BMP-2，Runx-2，IRE1，PERK，JNK，and CHOP in each group

2.3 高磷導(dǎo)致VSMC內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)

結(jié)果顯示，與對(duì)照組及NP組比較，HP組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白IRE1、p-PERK、CHOP、p-JNK表達(dá)均顯著增高（均P＜ 0.05），提示高磷培養(yǎng)細(xì)胞可增強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，并且同時(shí)激活了pPERK-CHOP和IRE1-p-JNK 2條途徑。見(jiàn)圖3。

圖3 各組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白IRE1、p-PERK、JNK、CHOP表達(dá)Fig.3 Protein expression of IRE1，p-PERK，JNK，and CHOP in each group

2.4 抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)傳遞可減輕高磷血癥導(dǎo)致的鈣化

Western blotting結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，CHOPsiRNA使CHOP基因沉默后凋亡蛋白CHOP表達(dá)下調(diào)，說(shuō)明轉(zhuǎn)染成功敲低了CHOP表達(dá)，見(jiàn)圖4。與HP組比較，CHOPsiRNA使CHOP基因沉默后，CHOP表達(dá)減少，說(shuō)明抑制了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激p-PERK-CHOP途徑。應(yīng)用JNK抑制劑SP600125抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的IRE1-p-JNK途徑，與HP組比較，siCHOP+HP組與SP600125+HP組鈣化蛋白BMP-2及Runx-2表達(dá)均顯著減少（均P＜0.05），提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與了高磷誘導(dǎo)的VSMC鈣化。見(jiàn)圖5。

圖4 VSMC轉(zhuǎn)染siCHOP后CHOP蛋白表達(dá)Fig.4 Expression of CHOP protein in VSMC transfected with siCHOP

圖5 各組鈣化蛋白BMP-2及Runx-2表達(dá)比較Fig.5 Comparison of expression of calcifying proteins BMP-2 and Runx-2 in each group

3 討論

本研究結(jié)果顯示，高磷可誘導(dǎo)VSMC BMP-2及Runx-2表達(dá)增加，提示VSMC發(fā)生了成骨細(xì)胞表型轉(zhuǎn)分化。血管鈣化是VSMC向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成脂細(xì)胞及巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)分化驅(qū)動(dòng)的主動(dòng)過(guò)程［6］。隨著腎臟功能逐漸減退，腎臟排泄磷功能障礙，慢性腎臟病患者普遍存在高磷血癥。研究［7］顯示，高磷啟動(dòng)和促進(jìn)血管鈣化進(jìn)展的機(jī)制包括：（1）促進(jìn)VSMC向軟骨細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變，增加細(xì)胞外基質(zhì)鈣化；（2）誘導(dǎo)VSMC凋亡；（3）抑制單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞向破骨樣細(xì)胞分化；（4）增加成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子23（fibroblast growth factor 23，F(xiàn)GF23）水平；（5）減少Klotho蛋白表達(dá)。已有研究［8］顯示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激機(jī)制通過(guò)多種機(jī)制誘導(dǎo)血管鈣化。

本研究應(yīng)用高磷培養(yǎng)基刺激VSMC表達(dá)p-JNK等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特異性蛋白，探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是否參與高磷誘導(dǎo)的VSMC鈣化。結(jié)果顯示，高磷培養(yǎng)細(xì)胞可增強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)；同時(shí)發(fā)現(xiàn)p-JNK、CHOP等凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)增多，提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)了VSMC凋亡。已有體外實(shí)驗(yàn)［9］證實(shí)VSMC凋亡先于血管鈣化，凋亡小體含有高濃度鈣，它沉積到細(xì)胞外基質(zhì)，作為鈣沉積的內(nèi)核而引起鈣化。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)負(fù)責(zé)合成蛋白和脂類(lèi)的細(xì)胞器，同時(shí)又是主要的鈣儲(chǔ)存庫(kù)，維持細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)；當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)未折疊蛋白或者錯(cuò)誤折疊蛋白過(guò)多時(shí)，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激穩(wěn)態(tài)破壞、發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而導(dǎo)致多種疾病發(fā)生［10］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激主要通過(guò)誘導(dǎo)VSMC凋亡的方式促進(jìn)血管鈣化［11］，其誘導(dǎo)凋亡的信號(hào)通路包括：（1）PERK活化后，磷酸化真核細(xì)胞起始因子（eukaryotic initiation factor 2，eIF2）的α亞單位，進(jìn)而促進(jìn)轉(zhuǎn)錄激活因子4（activating transcription factor 4，ATF4）轉(zhuǎn)位入核，激活凋亡蛋白CHOP，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［12］。（2）IRE1發(fā)生二聚化和自身磷酸化，生成的IRE1α可以募集腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2（TNF receptor associated factor 2，TRAF2），依次激活凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1（apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1）、JNK，JNK通過(guò)抑制B淋巴細(xì)胞瘤-2基因而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［13］。（3）內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，caspase-12活化激活caspase家族蛋白而誘導(dǎo)凋亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激除了通過(guò)誘導(dǎo)凋亡的方式參與血管鈣化外，還激活轉(zhuǎn)錄活化因子X(jué)盒結(jié)合蛋白1（X-box binding protein 1，XBP1）結(jié)合Runx-2啟動(dòng)子，促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)分化［14］。

本研究在沉默CHOP基因后再高磷刺激VSMC，結(jié)果顯示BMP-2及Runx-2表達(dá)均減少，提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的PERK-eIF2-CHOP途徑參與高磷誘導(dǎo)的VSMC鈣化。應(yīng)用JNK抑制劑SP600125預(yù)處理高磷細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)預(yù)處理后的VSMC鈣沉積減輕，提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的IRE1-TRAF2-JNK途徑亦參與了高磷誘導(dǎo)的VSMC鈣化。已有研究［15］顯示體外培養(yǎng)子宮頸癌細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞外液高磷環(huán)境可激活區(qū)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，細(xì)胞凋亡蛋白裂解的caspase-3表達(dá)增加，但加入SP600125抑制JNK后表達(dá)減少。研究［16］顯示在糖尿病大鼠模型中，鐵死亡通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與心肌缺血/再灌注損傷?？梢?jiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制可能發(fā)生在多種細(xì)胞內(nèi)，因此可能成為與凋亡相關(guān)的血管鈣化等疾病的潛在治療靶點(diǎn)。

綜上所述，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激機(jī)制參與了高磷誘導(dǎo)的VSMC鈣化，其作用機(jī)制可能是激活了pPERK-CHOP和IRE1-p-JNK兩條途徑。本研究不足之處：（1）未進(jìn)行SP600125和CHOPsiRNA對(duì)VSMC鈣定量和堿性磷酸酶活性影響的檢測(cè)；（2）為體外實(shí)驗(yàn)，僅采用細(xì)胞培養(yǎng)，今后應(yīng)設(shè)計(jì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步論證。