劉海婷 李東碩 張蕾 王寧 王彬 丁楊明 姚蓉 陸宇

耐藥結(jié)核病的迅速出現(xiàn)對(duì)結(jié)核病化療提出了挑戰(zhàn)，需要開(kāi)發(fā)新的藥物和治療方案，并且對(duì)現(xiàn)有抗結(jié)核藥物間相互作用的研究將有助于開(kāi)發(fā)更好的協(xié)同藥物組合。吡法齊明(pyrifazimine，TBI-166)是我國(guó)自主研發(fā)的抗耐藥結(jié)核病新藥，在體外及小鼠體內(nèi)研究中發(fā)現(xiàn)其具有較好的安全性和有效性[1-2]，目前正在進(jìn)行Ⅱ期臨床試驗(yàn)。TBI-166的作用機(jī)制尚不明確，筆者所在課題組前期對(duì)TBI-166的作用機(jī)制進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其通過(guò)累積活性氧(ROS)，降低三磷酸腺苷(ATP)水平，從而發(fā)揮抗結(jié)核活性[3-4]。由于結(jié)核病的治療依賴于有效的藥物組合方案，因此，對(duì)TBI-166的藥物組合進(jìn)行抗結(jié)核活性研究十分必要。為此，筆者所在課題組基于前期研究結(jié)果，著重開(kāi)展TBI-166與貝達(dá)喹啉(bedaquiline，Bdq)、莫西沙星(moxifloxacin，Mfx)、德拉馬尼(delamanid，Dlm)、SQ109、PBTZ169的兩藥組合對(duì)3株結(jié)核分枝桿菌(MTB)臨床分離株(包括2株藥物敏感菌、1株耐藥菌)的體外抗結(jié)核活性，并初步探討TBI-166與Bdq的協(xié)同作用機(jī)制，以期發(fā)現(xiàn)更有效的抗結(jié)核新方案。

材料和方法

一、 材料

1.實(shí)驗(yàn)菌株：MTB標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv(ATCC 27294)、2株藥物敏感性MTB臨床分離株(菌株編號(hào)：30031和30091)，以及1株前廣泛耐藥結(jié)核分枝桿菌(pre-XDR-MTB)臨床分離株(菌株編號(hào)：13385；對(duì)異煙肼、利福平、氟喹諾酮類(lèi)藥物耐藥)于北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所藥物學(xué)研究室保存。

2.主要儀器：高壓蒸汽滅菌器(日本三洋公司)、超低溫冰箱(日本三洋公司)、METTLER TOLEDO電子天平(瑞士梅特勒-托利多集團(tuán))、電熱恒溫水浴鍋(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)、Tecan Infinite 200酶標(biāo)儀(瑞士帝肯集團(tuán)公司)、二級(jí)生物安全柜(新加坡Esco公司)、二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(美國(guó)賽默飛世爾科技公司)、MaX-Q8000低溫?fù)u床(美國(guó)賽默飛世爾科技公司)、1730R微量高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)基因技術(shù)公司)。

3.材料及試劑：二分隔培養(yǎng)皿、涂布器、Alamar Blue指示劑(英國(guó)AbD Serotec公司)；7H9液體培養(yǎng)基干粉、7H10固體培養(yǎng)基干粉(美國(guó)Becton Dickinson公司)；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO；北京索萊寶科技有限公司)；丙三醇(北京化工廠)；細(xì)菌ROS檢測(cè)試劑盒(上海貝博生物科技有限公司；批號(hào)：BB-46111)、ATP檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

4.實(shí)驗(yàn)藥物：TBI-166(純度>99%，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所黃海洪教授課題組提供)、異煙肼(isoniazid，INH；純度≥99%，美國(guó)Sigma公司)、利福平(rifampicin，RFP；純度≥97%，美國(guó)Sigma公司)、Bdq(純度>99%，上海瀚香生物科技有限公司)、Mfx(純度>98%，上海瀚香生物科技有限公司)、Dlm(美國(guó)TargetMol公司)、SQ109(純度>98%，上海昶衍化工科技有限公司)、PBTZ169(由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所劉明亮課題組合成)。

二、 方法

1.棋盤(pán)法測(cè)定兩藥組合的相互作用：將TBI-166、INH、RFP、Bdq、Mfx、Dlm、SQ109、PBTZ169以DMSO為溶劑配制成2 mg/ml的儲(chǔ)備液，以7H9肉湯進(jìn)行稀釋，通過(guò)微孔板阿爾瑪藍(lán)染色法(microplate alamar blue assay，MABA)[5]，采用連續(xù)二倍稀釋測(cè)定藥物對(duì)3株MTB臨床分離株的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)。應(yīng)用棋盤(pán)法在96孔板中測(cè)定TBI-166與其他抗結(jié)核藥物合用的MIC，96孔板中每孔含有經(jīng)二倍稀釋的TBI-166和另一種抗結(jié)核藥物(Bdq、Mfx、Dlm、SQ109、PBTZ169)，按棋盤(pán)方式進(jìn)行分配[6-7]，兩者的最終濃度分別為各藥物的2×MIC-1/16×MIC。通過(guò)觀察96孔板中顏色的變化來(lái)確定藥物聯(lián)合應(yīng)用中單藥的MIC。組合作用由分級(jí)抑菌濃度指數(shù)(fractional inhibitory concentration index，F(xiàn)ICI)確定，F(xiàn)ICI=(MICA聯(lián)合/MICA單獨(dú))+(MICB聯(lián)合/MICB單獨(dú))，MICA單獨(dú)和MICB單獨(dú)分別表示A藥和B藥單用時(shí)的MIC，MICA聯(lián)合和MICB聯(lián)合分別表示A藥和B藥組合后相應(yīng)的MIC。兩藥組合相互作用的判定標(biāo)準(zhǔn)如下：當(dāng)FICI≤0.5時(shí)，兩藥為協(xié)同作用；當(dāng)0.5

2.時(shí)間殺菌曲線法評(píng)估含TBI-166的兩藥組合的抗菌活性：采用時(shí)間殺菌曲線法進(jìn)一步評(píng)估具有部分協(xié)同或相加作用的含TBI-166兩藥組合的抗菌效果，各藥物濃度設(shè)定為1/2MIC或1/4MIC。

具體操作方法：在24孔板中設(shè)置各亞抑制濃度(1/2MIC或1/4MIC)的單藥孔及兩藥聯(lián)用孔，以7H9進(jìn)行稀釋，調(diào)整每孔菌終濃度為1×105CFU/ml，將24孔板在37 ℃含5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d。分別在給藥當(dāng)天(D0)、第3天、第7天、第10天和第14天，吸取100 μl，以無(wú)菌1×磷酸鹽緩沖液(PBS)作為稀釋液進(jìn)行連續(xù)10倍稀釋，吸取100 μl的上述稀釋菌液涂布在含10%OADC、0.5%丙三醇的7H10固體培養(yǎng)板上培養(yǎng)3～4周。

兩藥相互作用的定義：與兩藥組合中抗菌活性最好的單藥相比，藥物聯(lián)合作用使活菌數(shù)減少量≥2 log10CFU/ml被認(rèn)為是協(xié)同作用；1 log10CFU/ml<活菌數(shù)減少量<2 log10CFU/ml被認(rèn)為是相加作用；活菌數(shù)減少量≤1 log10CFU/ml被認(rèn)為是無(wú)關(guān)作用；活菌數(shù)增加量≥2 log10CFU/ml被認(rèn)為是拮抗作用[9]。

3.MTB菌體內(nèi)ATP含量測(cè)定：采用ATP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)MTB經(jīng)藥物處理24 h后菌體內(nèi)的ATP含量變化，具體操作步驟：(1)藥物處理MTB：取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期[吸光度(A)值=0.4]的H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株菌液，將菌液加入至50 ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，每瓶10 ml，設(shè)置不同處理組：空白對(duì)照組(H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株)、TBI-166處理組(0.04、0.4、4 μg/ml)、Bdq處理組(0.03、0.3、3 μg/ml)、兩藥聯(lián)用組(0.04 μg/ml TBI-166+0.03 μg/ml Bdq、0.4 μg/ml TBI-166+0.3 μg/ml Bdq)，分別處理H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株菌液24 h后檢測(cè)菌體內(nèi)ATP含量。(2)ATP檢測(cè)：用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)570 nm下各藥物處理組的A值，于每組中吸取4×107個(gè)菌體至1.5 ml高壓過(guò)的EP管中，13 570×g離心5 min，棄上清，用無(wú)菌1×PBS重懸菌體，離心，棄上清，重復(fù)洗滌2次。加入200 μl裂解液，振蕩器振蕩混勻，在冰上溶解ATP檢測(cè)工作液，并按1∶9的比例將ATP檢測(cè)液加入ATP稀釋液中，避光混勻，將96孔黑板中加入100 μl裂解菌液和100 μl稀釋后的ATP檢測(cè)液，酶標(biāo)儀測(cè)定相對(duì)光單位(relative light unit，RLU)值。

4.MTB菌體內(nèi)ROS含量測(cè)定：采用細(xì)菌ROS檢測(cè)試劑盒檢測(cè)MTB經(jīng)藥物處理24 h后菌體內(nèi)的ROS含量變化，具體操作步驟：(1)藥物處理MTB：取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(A=0.4)的H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株菌液，將菌液加入至50 ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，每瓶10 ml，設(shè)置不同處理組：空白對(duì)照組(H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株)、TBI-166處理組(0.04、0.4和4 μg/ml)、Bdq處理組(0.03、0.3、3 μg/ml)、兩藥聯(lián)用組(0.04 μg/ml TBI-166+0.03 μg/ml Bdq、0.4 μg/ml TBI-166+0.3 μg/ml Bdq)分別處理H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株24 h后用酶標(biāo)儀測(cè)定熒光值。(2)ROS檢測(cè)：按照試劑盒操作步驟進(jìn)行，事先將探針稀釋液B從-20 ℃冰箱中取出，待其融化后用純水將其10倍稀釋即制得探針稀釋液；用10倍稀釋后的探針稀釋液將探針進(jìn)行1000倍稀釋即配制成染色工作液。從各處理組中吸取108個(gè)菌體并于6000×g離心10 min，棄上清，用無(wú)菌1×PBS重懸菌體，離心，棄上清，重復(fù)洗滌2次。于每管中加入1 ml染色工作液重懸菌體，并在37 ℃下避光孵育30 min，孵育結(jié)束后離心收集菌體，用1×PBS重懸菌體，離心，棄上清。于每管中加入500 μl無(wú)菌1×PBS，重懸菌體，充分混勻，吸取200 μl加入到96孔黑板中，將上述96孔黑板置于酶標(biāo)儀中，測(cè)定激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)526 nm下各組熒光值。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、棋盤(pán)法測(cè)定結(jié)果

采用MABA法測(cè)定TBI-166與抗耐藥結(jié)核病新藥對(duì)H37Rv菌株及3株MTB臨床分離株的MIC值，結(jié)果顯示，所有菌株均對(duì)TBI-166、Bdq、Dlm、SQ109、PBTZ169敏感，其MIC值介于0.0004～0.54 μg/ml(表1)。

表1 抗結(jié)核藥物對(duì)4株結(jié)核分枝桿菌菌株的體外最低抑菌濃度 (μg/ml)

棋盤(pán)法測(cè)定TBI-166與上述藥物組合的相互作用結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果顯示，TBI-166與Bdq、PBTZ169、Dlm的兩藥組合對(duì)菌株30031的相互作用均為部分協(xié)同或相加作用，F(xiàn)ICI值分別為1.00、0.75、0.75；TBI-166與Bdq、SQ109、PBTZ169兩藥組合對(duì)菌株30091的相互作用均為部分協(xié)同，F(xiàn)ICI值均為0.75；TBI-166與Bdq、Mfx、SQ109、PBTZ169、Dlm的兩藥組合對(duì)菌株13385的相互作用為部分協(xié)同或相加作用，F(xiàn)ICI值為0.75或1.00。

二、時(shí)間殺菌曲線法評(píng)估結(jié)果

單藥及兩藥組合對(duì)MTB臨床分離株30031的時(shí)間殺菌曲線圖顯示TBI-166與Bdq、PBTZ169兩藥組合對(duì)菌株30031的殺傷具有相加作用，而TBI-166與Dlm兩藥組合顯示無(wú)相互作用(圖1)。各藥物單用時(shí)對(duì)MTB無(wú)明顯殺傷作用，當(dāng)0.08 μg/ml TBI-166分別與0.03 μg/ml Bdq、0.0001 μg/ml PBTZ169 兩藥聯(lián)用與MTB孵育14 d后顯示具有部分協(xié)同殺菌活性，與0.08 μg/ml TBI-166相比活菌量分別降低1.59 log10CFU/ml和1.51 log10CFU/ml(圖1a和圖1b)；0.08 μg/ml TBI-166與0.01 μg/ml Dlm聯(lián)用與MTB孵育14 d后抗菌活性與0.08 μg/ml TBI-166單獨(dú)應(yīng)用時(shí)相比活菌量?jī)H降低0.94 log10CFU/ml(圖1c)，表明兩藥組合無(wú)相互作用。

單藥及兩藥組合對(duì)MTB臨床分離株30091的時(shí)間殺菌曲線圖顯示TBI-166與Bdq、PBTZ169、SQ109的兩藥組合均對(duì)菌株30091的殺傷具有相加作用，比單藥作用后抗菌活性增強(qiáng)(圖2)。0.05 μg/ml TBI-166分別與0.03 μg/ml Bdq、0.0002 μg/ml PBTZ169兩藥聯(lián)用與MTB孵育14 d后與0.05 μg/ml TBI-166相比活菌量分別降低1.27 log10CFU/ml和1.18 log10CFU/ml(圖2a和圖2b)；而當(dāng)0.05 μg/mlTBI-166與0.27 μg/ml SQ109聯(lián)用與MTB孵育14 d后與0.27 μg/ml SQ109相比活菌量降低1.1 log10CFU/ml(圖2c)，上述結(jié)果均表明當(dāng)Bdq、PBTZ169、SQ109分別與TBI-166組合后能增強(qiáng)TBI-166的抗結(jié)核活性。

表2 抗結(jié)核藥物組合對(duì)3株臨床分離菌株的部分抑菌濃度指數(shù)

注 圖a為0.08 μg/ml TBI-166、0.03 μg/ml Bdq單用及兩藥組合時(shí)對(duì)菌株30031的時(shí)間殺菌曲線圖；圖b為0.08 μg/ml TBI-166、0.0001 μg/ml PBTZ169單用及兩藥組合時(shí)對(duì)菌株30031的時(shí)間殺菌曲線圖；圖c為0.08 μg/ml TBI-166、0.01 μg/ml Dlm單用及兩藥組合時(shí)對(duì)菌株30031的時(shí)間殺菌曲線圖。TBI-166：吡法齊明；Bdq：貝達(dá)喹啉；Dlm：德拉馬尼；菌株30031：藥物敏感性結(jié)核分枝桿菌臨床分離株圖1 單藥及兩藥組合對(duì)結(jié)核分枝桿菌臨床分離菌株30031的時(shí)間殺菌曲線圖

注 圖a為0.05 μg/ml TBI-166、0.03 μg/ml Bdq單用及兩藥組合時(shí)對(duì)菌株30091的時(shí)間殺菌曲線圖；圖b為0.05 μg/ml TBI-166、0.0002 μg/ml PBTZ169單用及兩藥組合時(shí)對(duì)菌株30091的時(shí)間殺菌曲線圖；圖c為0.05 μg/ml TBI-166、0.27 μg/ml SQ109單用及兩藥組合時(shí)對(duì)菌株30091的時(shí)間殺菌曲線圖。TBI-166：吡法齊明；Bdq：貝達(dá)喹啉；菌株30091：藥物敏感性結(jié)核分枝桿菌臨床分離株圖2 單藥及兩藥組合對(duì)結(jié)核分枝桿菌臨床分離株30091的時(shí)間殺菌曲線圖

注 圖a為0.04 μg/ml TBI-166、0.125 μg/ml SQ109單用及兩藥組合時(shí)對(duì)菌株13385的時(shí)間殺菌曲線圖；圖b為0.04 μg/ml TBI-166、0.0001 μg/ml PBTZ169單用及兩藥組合時(shí)對(duì)菌株13385的時(shí)間殺菌曲線圖；圖c為0.04 μg/ml TBI-166、0.015 μg/ml Bdq單用及兩藥組合時(shí)對(duì)菌株13385的時(shí)間殺菌曲線圖；圖d為0.04 μg/ml TBI-166、0.005 μg/ml Dlm單用及兩藥組合時(shí)對(duì)菌株13385的時(shí)間殺菌曲線圖；圖e為0.04 μg/ml TBI-166、0.625 μg/ml Mfx單用及兩藥組合時(shí)對(duì)菌株13385的時(shí)間殺菌曲線圖。TBI-166：吡法齊明；Bdq：貝達(dá)喹啉；Dlm：德拉馬尼；Mfx：莫西沙星。菌株13385：前廣泛耐藥結(jié)核分枝桿菌臨床分離株圖3 單藥及兩藥組合對(duì)結(jié)核分枝桿菌臨床分離株13385的時(shí)間殺菌曲線圖

單藥及兩藥組合對(duì)MTB臨床分離株13385的時(shí)間殺菌曲線圖顯示TBI-166與SQ109、PBTZ169的兩藥組合對(duì)菌株13385的殺傷具有協(xié)同作用，比單藥作用后抗菌活性明顯增強(qiáng)(圖3)。0.04 μg/ml TBI-166分別與0.125 μg/ml SQ109、0.0001 μg/ml PBTZ169兩藥聯(lián)用與MTB孵育14 d后分別與兩藥組中活性較好的單藥(0.125 μg/ml SQ109和0.04 μg/ml TBI-166)相比活菌量降低3.58 log10CFU/ml和2.82 log10CFU/ml(圖3a和圖3b)；TBI-166與Bdq、Dlm、Mfx的兩藥組合對(duì)菌株13385的殺傷具有相加作用，當(dāng)0.04 μg/ml TBI-166與0.015 μg/ml Bdq、0.005 μg/ml Dlm、0.625 μg/ml Mfx聯(lián)用與MTB孵育14 d后與0.04 μg/ml TBI-166相比活菌量分別降低1.70 log10CFU/ml、1.84 log10CFU/ml、1.90 log10CFU/ml(圖3c至圖3e)，上述結(jié)果均表明當(dāng)SQ109、PBTZ169、Bdq、Dlm、Mfx分別與TBI-166組合后能增強(qiáng)TBI-166的抗結(jié)核活性。

三、MTB菌體內(nèi)ATP含量測(cè)定

采用不同濃度的TBI-166與Bdq刺激H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株24 h后，空白對(duì)照組、0.04 μg/ml TBI-166組、0.4 μg/ml TBI-166組、4 μg/ml TBI-166組、0.03 μg/ml Bdq組、0.3 μg/ml Bdq組、3 μg/ml Bdq組、0.04 μg/ml TBI-166+0.03 μg/ml Bdq組、0.4 μg/ml TBI-166+0.3 μg/ml Bdq組菌體內(nèi)RLU值分別為756 971.20±69 110.53、557 022.17±112 487.20、498 944.17±56 804.81、446 099.40±28 559.58、450 618.67±85 299.64、208 599.20±24 078.74、47 879.40±6562.80、359 801.40±40 648.56、115 160.67±19 129.79，各給藥組菌體內(nèi)ATP含量呈下降趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=75.109，P<0.001)。其中，0.4 μg/ml TBI-166+0.3 μg/ml Bdq組菌體內(nèi)的RLU值明顯低于0.3 μg/ml Bdq單藥組，菌體內(nèi)ATP含量下降最明顯。

四、MTB菌體內(nèi)ROS含量測(cè)定

采用不同濃度的TBI-166與Bdq刺激H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株24 h后，空白對(duì)照組、0.04 μg/ml TBI-166組、0.4 μg/ml TBI-166組、4 μg/ml TBI-166組、0.03 μg/ml Bdq組、0.3 μg/ml Bdq組、3 μg/ml Bdq組、0.04 μg/ml TBI-166+0.03 μg/ml Bdq組、0.4 μg/ml TBI-166+0.3 μg/ml Bdq組菌體內(nèi)ROS熒光值分別為10 229.75±522.38、11 311.50±357.59、12 319.25±212.97、16 471.60±252.49、11 683.00±505.73、13 715.00±907.93、12 995.50±769.50、15 765.67±337.96、21 014.33±1189.19，各給藥組菌體內(nèi)ROS熒光值明顯高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=115.403，P<0.001)，即在TBI-166、Bdq的刺激下將誘導(dǎo)菌株ROS的產(chǎn)生。兩藥組合組菌體內(nèi)ROS含量與單藥組相比進(jìn)一步增長(zhǎng)，其中，0.4 μg/ml TBI-166+0.3 μg/ml Bdq組ROS含量上升最明顯，明顯高于0.3 μg/ml Bdq組。

討 論

結(jié)核病的治療需要組合用藥，現(xiàn)有的藥物方案尚無(wú)法滿足結(jié)核病的治療需求，因此，迫切需要開(kāi)發(fā)新的藥物及藥物方案縮短結(jié)核病的治療療程。亞胺吩嗪類(lèi)藥物具有較強(qiáng)的抗結(jié)核活性，其中，氯法齊明具有廣泛的抗結(jié)核作用，但由于其會(huì)引起皮膚紅染等不良反應(yīng)，使用受限。經(jīng)過(guò)廣泛的藥物化學(xué)篩選最終發(fā)現(xiàn)了TBI-166[1]。TBI-166作為我國(guó)抗耐藥結(jié)核病新藥，已完成臨床單藥的安全性及有效性評(píng)估。由于單藥治療往往會(huì)導(dǎo)致MTB耐藥性的出現(xiàn)，因此，對(duì)TBI-166與現(xiàn)有抗結(jié)核藥物的組合研究是非常必要的。既往對(duì)TBI-166與一線及二線抗結(jié)核藥物組合的抗結(jié)核活性研究中發(fā)現(xiàn)INH和RFP對(duì)TBI-166的抗結(jié)核活性無(wú)明顯作用，而B(niǎo)dq、吡嗪酰胺的加入?yún)s明顯增強(qiáng)了TBI-166的抗結(jié)核活性[10]。隨著對(duì)抗結(jié)核藥物的廣泛研究，目前出現(xiàn)了幾種有效且具有新作用機(jī)制的抗結(jié)核新藥，如質(zhì)子解偶聯(lián)劑SQ109、DprE1酶抑制劑PBTZ169、分枝菌酸合成抑制劑Dlm等，對(duì)這些新藥的研究有望縮短結(jié)核病療程。鑒于TBI-166將與抗耐藥結(jié)核病核心藥物及有潛力的新藥組成新方案用于耐藥結(jié)核病的治療，筆者所在課題組前期評(píng)估了TBI-166與抗耐藥結(jié)核病A組藥物(Bdq和Mfx)及新型抗結(jié)核藥物(Dlm、SQ109、PBTZ169)的兩藥組合對(duì)MTB標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv的抗結(jié)核活性，發(fā)現(xiàn)Bdq、SQ109、PBTZ169與TBI-166的兩藥組合具有協(xié)同殺菌活性(數(shù)據(jù)未展示)，但由于菌株比較單一，因此，本研究進(jìn)一步評(píng)估TBI-166與抗結(jié)核藥物(Bdq、Mfx、Dlm、SQ109、PBTZ169)的兩藥組合對(duì)3株臨床分離株的體外抗結(jié)核活性。

體外聯(lián)合藥物敏感性試驗(yàn)顯示，TBI-166與Bdq、PBTZ169對(duì)臨床藥物敏感及耐藥菌株均表現(xiàn)出部分協(xié)同或相加作用，并且Bdq、PBTZ169的加入使TBI-166的MIC降低至其MIC的1/4～1/2。同時(shí)，筆者采用了時(shí)間殺菌曲線對(duì)TBI-166的協(xié)同藥物組合進(jìn)行了14 d的殺菌實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果顯示，0.08 μg/ml TBI-166分別與0.03 μg/ml Bdq、0.0001 μg/ml PBTZ169兩藥聯(lián)用與藥物敏感菌株30031孵育14 d后，兩藥聯(lián)用組的活菌量與兩藥組中活性較好的單藥(0.08 μg/ml TBI-166)相比分別降低1.59 log10CFU/ml和1.51 log10CFU/ml；0.05 μg/ml TBI-166分別與0.03 μg/ml Bdq、0.0002 μg/ml PBTZ169兩藥聯(lián)用與藥物敏感菌株30091孵育14 d后，與0.05 μg/ml TBI-166組相比活菌量分別降低1.27 log10CFU/ml和1.18 log10CFU/ml；而在菌株13385中，筆者發(fā)現(xiàn)TBI-166與PBTZ169的兩藥組合具有協(xié)同殺菌活性，與Bdq的兩藥組合具有相加作用。當(dāng)0.04 μg/ml TBI-166與0.0001 μg/ml PBTZ169聯(lián)用14 d后，活菌量與0.04 μg/ml TBI-166組相比降低2.82 log10CFU/ml。然而，在聯(lián)合藥物敏感性試驗(yàn)中，筆者發(fā)現(xiàn)TBI-166與Dlm的兩藥組合對(duì)敏感株30031表現(xiàn)出部分協(xié)同抗菌活性，但時(shí)間殺菌實(shí)驗(yàn)顯示0.08 μg/ml TBI-166與0.01 μg/ml Dlm兩藥聯(lián)用與藥物敏感菌株30031孵育14 d后，兩藥聯(lián)合組的活菌量與TBI-166組相比僅降低0.94 log10CFU/ml，提示TBI-166與Dlm的兩藥組合無(wú)相互作用。

同時(shí)，對(duì)體內(nèi)外篩選出的協(xié)同藥物組合作用機(jī)制的探討將有利于基于靶標(biāo)的新藥發(fā)現(xiàn)。前期研究發(fā)現(xiàn)，TBI-166與Bdq具有較強(qiáng)的協(xié)同殺菌活性。藥物產(chǎn)生協(xié)同作用可能是基于增加單藥療效和降低MTB耐藥性的產(chǎn)生等。本研究中，筆者測(cè)定不同濃度的TBI-166與Bdq單用及兩藥組合作用于H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株24 h后ATP及ROS含量的變化，結(jié)果顯示，TBI-166與Bdq均能誘導(dǎo)菌體內(nèi)ROS的產(chǎn)生并且降低ATP水平，與既往研究認(rèn)為T(mén)BI-166可能通過(guò)累積ROS[3]、降低ATP水平而發(fā)揮抗菌活性，Bdq可抑制F0F1ATP合成酶阻止ATP合成發(fā)揮殺菌活性一致[11]。筆者進(jìn)一步評(píng)估了TBI-166與Bdq兩藥組合后對(duì)菌體內(nèi)ATP及ROS的影響，結(jié)果顯示，當(dāng)TBI-166與Bdq兩藥聯(lián)用后，ATP水平與單藥組相比進(jìn)一步降低，而ROS含量進(jìn)一步升高。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，TBI-166可在Ⅱ型NADH醌氧化還原酶(Type-Ⅱ NADH-quinone oxidoreductase，NDH-2)的作用下被NADH還原為活性形式，之后與O2自發(fā)反應(yīng)產(chǎn)生ROS[4]。既往在對(duì)Bdq處理恥垢分枝桿菌后的蛋白質(zhì)組學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)NDH-2表達(dá)上調(diào)[12]，在Bdq處理MTB后的蛋白質(zhì)組學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)NADPH表達(dá)下調(diào)[13]?；诖?，筆者推測(cè)Bdq與TBI-166聯(lián)用后，菌體內(nèi)有更多的NADPH在NDH-2的作用下被還原，電子釋放增多，進(jìn)而導(dǎo)致TBI-166的還原當(dāng)量增加、ROS的產(chǎn)生增加。由于TBI-166增強(qiáng)醌氧化還原酶介導(dǎo)的氧化還原反應(yīng)使NADPH/NADP+比值下降，導(dǎo)致NAD+還原當(dāng)量減少，下游呼吸鏈電子傳遞受阻，同時(shí)TBI-166與Bdq的刺激使丙酮酸的氧化及三羧酸循環(huán)受阻，最終導(dǎo)致菌體內(nèi)的ATP合成大大減少。

本研究存在以下不足：(1)體外協(xié)同作用研究選取的臨床菌株數(shù)較少，后期研究還需加大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證；(2)協(xié)同作用僅是體外實(shí)驗(yàn)的發(fā)現(xiàn)，還需要體內(nèi)模型及人體試驗(yàn)的驗(yàn)證；(3)作用機(jī)制研究?jī)H針對(duì)MTB標(biāo)準(zhǔn)菌株且尚需深入研究。

綜上，本研究通過(guò)體外棋盤(pán)法及時(shí)間殺菌實(shí)驗(yàn)評(píng)估了TBI-166與抗結(jié)核新藥對(duì)3株MTB臨床分離株的抗結(jié)核活性，發(fā)現(xiàn)TBI-166與Bdq、PBTZ169的兩藥組合對(duì)MTB敏感株及耐藥株均具有協(xié)同殺菌活性；并且推測(cè)TBI-166與Bdq可能是通過(guò)作用于MTB呼吸鏈，進(jìn)一步累積ROS、降低ATP水平來(lái)發(fā)揮協(xié)同殺菌作用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)劉海婷：直接參與(包括：實(shí)施研究、采集數(shù)據(jù)、分析/解釋數(shù)據(jù))、文章撰寫(xiě)(起草文章)；李東碩、張蕾：直接參與(實(shí)施研究)；王寧：直接參與(分析/解釋數(shù)據(jù))；王彬、丁楊明、姚蓉：工作支持(支持性貢獻(xiàn))；陸宇：工作支持(獲取研究經(jīng)費(fèi)、行政/技術(shù)/材料支持、指導(dǎo)、支持性貢獻(xiàn))