劉振飛，劉 爽，張世亮

冠心病(coronary heart disease，CHD)是一種常見的慢性心血管系統疾病，好發(fā)于老年人，近年來患病率呈逐年上升趨勢[1]。我國CHD患病人數每年以20%的平均速度遞增，CHD病死率占所有典型心血管疾病死亡病例總數的10 %～20 %[4]。CHD在中醫(yī)上歸于“胸痹”范疇，其病位主要在心，病理因素可有寒凝、痰濁、血瘀等[2]，其中又以血瘀最為多見[3]。在治療CHD方面，中藥具有多通路、多靶點等優(yōu)勢，在臨床中療效顯著[5]。冠心2號方由丹參、紅花、赤芍、川芎、降香5味藥組成，具有活血化瘀之功，中華中醫(yī)學會心血管病分會發(fā)布的《冠心病穩(wěn)定型心絞痛中醫(yī)診療指南》[6]提出治療心血瘀阻型冠心病心絞痛首選冠心2號方。

網絡藥理學是在藥物分子水平上構建“藥物-成分-疾病”的靶點網絡圖。其整體性與系統性與中醫(yī)藥研究的整體觀與辨證論治相契合[7-8]。近年來，國內外學者利用網絡藥理學對治療心力衰竭、CHD、糖尿病等多種疾病的中藥復方、單味藥及藥對作用進行了研究[9-11]。本研究通過網絡數據庫分析研究冠心2號方在治療CHD的作用機制，為冠心2號方在臨床的應用研究提供新的理論思路與方法。

1 資料與方法

1.1 冠心2號方活性成分的獲取與篩選 在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcm-spsearch.php)中分別錄入丹參、紅花、赤芍、川芎、降香進行檢索，根據口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18條件選出有效成分，并且獲取成分對應的靶點。然后將導出的靶點直接導入UniProt數據庫(https：//www.unitprot.org/)進行基因的標準化處理。

1.2 CHD疾病靶點的獲取與預測 在GeneCards(https：//www.genecards.org/)數據庫中以“coronary heart disease”進行檢索，將檢索到的蛋白名稱復制到UniProt數據庫中進行基因的標準化處理，得到CHD的靶點信息，共有949個。

1.3 冠心2號方活性成分與疾病網絡的構建與分析 將冠心2號方的成分靶點與CHD的靶點取交集，尋找兩者的共同靶點，并導入Cytoscape 3.7.2軟件，組建“藥物-成分-靶點-疾病”網絡。

1.4 蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)網絡圖的構建與分析 將冠心2號方與CHD的共同靶點輸入STRING數據庫，限定物種為智人，構建“冠心2號方-CHD靶點”的PPI網絡圖。利用Cytoscape 3.7.2軟件中的Network Analyzer進行分析，根據節(jié)點度(Degree)≥38進行篩選，得到冠心2號方治療CHD的核心靶點。

1.5 生物通路及富集分析 利用DAVID(https：//david.ncifcrf.gov/)數據庫對冠心2號方治療CHD的共同作用靶點進行分析。將上述共有靶點導入DAVID，物種設置為智人，進行分析，通過通路富集結果對冠心2號方治療CHD的作用機制進行預測。

1.6 分子對接 通過TCMSP數據庫下載冠心2號方活性成分化合物的3D結構。通過PDB數據庫(http：//www1.rcsb.org/)下載目的靶點蛋白3D結構，利用AutoDock 1.5.6對蛋白質進行除氫、去水、去除小分子配體等操作，將化合物和蛋白進行蛋白-分子對接，其結果以結合自由能的高低作為與化合物結合程度的評價標準，使用Pymol 2.5軟件實現對接結果可視化。

2 結 果

2.1 冠心2號方活性成分的靶點篩選及預測 通過TCMSP篩選獲得冠心2號方有效成分160個，其中丹參最多，65個；降香次之， 37個；紅花22個；赤芍29個；川芎最少，7個。具體活性成分見表1。

表1 冠心2號方有效成分

(續(xù)表)

(續(xù)表)

(續(xù)表)

2.2 冠心2號方成分靶點的預測及成分-靶點網絡圖的構建 將冠心2號方的有效成分作用靶點與CHD的靶點取交集，通過網絡合并，獲得冠心2號方和CHD的共有靶點74個(見圖1)。利用Cytoscape3.7.2軟件構建“藥物-成分-靶點-疾病”網絡圖，見圖2。網絡圖中共有節(jié)點204個，紅色“V”形代表疾病CHD，綠色六邊形代表中藥丹參、紅花、赤芍、川芎、降香，淺藍色菱形代表冠心2號方中有效成分共124節(jié)點，深藍色圓形代表冠心2號方與CHD共有的靶點共74節(jié)點，其中最大自由度111，最小自由度為2，平均自由度為13.37。槲皮素、山奈酚、木犀草素、黃芩素、β-谷甾醇度值最高，說明其在治療冠心病中發(fā)揮主要作用。

圖1 冠心2號方治療CHD的藥物-疾病共同靶點韋恩圖

圖2 冠心2號方治療CHD的藥物-成分-靶點-疾病網絡圖(DS為丹參，JX為降香，CS為赤芍，HH為紅花，CX為川芎)

2.3 核心靶點的篩選 將冠心2號方與CHD的74個共同靶點導入STRING數據庫建立“冠心2號方-CHD”靶點的PPI網絡，見圖3，共得到74個節(jié)點、833條邊，平均節(jié)點度為22.5；再將該結果以TSV格式導出，通過Cytoscape 3.7.2軟件對該網絡進行拓撲分析，以藍色圓形代表共同靶點，Degree值越大，圓形越大。以Degree值≥38為篩選標準，得到17個核心靶點，見表2，并一起構成核心網絡圖，節(jié)點藍色越深、面積越大，代表Degree值越大，該靶點自由度越高。邊顏色越深，寬度越大，證明兩個節(jié)點之間聯系越緊密，見圖4。

表2 冠心2號方治療CHD的核心靶點

圖3 冠心2號方治療CHD的“成分-疾病”靶點PPI網絡圖

圖4 冠心2號方治療CHD的核心靶點網絡圖

2.4 生物通路及富集分析 將冠心2號方治療CHD的PPI網絡篩選出的17個核心靶點導入DAVID數據庫進行富集分析，共獲得93條基因本體(GO)條目(P<0.05)，其中生物途徑(biological process，BP)62條，細胞定位(cell component，CC)11條，分子功能(molecular function，MF)20條。包括一氧化氮(NO)生物合成過程的正調控(positive regulation of nitric oxide biosynthetic process)、平滑肌細胞增殖的正調控(positive regulation of smooth muscle cell proliferation)等。將GO條目中的信息利用Omicshare平臺構建高級氣泡圖，見圖5。京都基因和基因組百科全書(KEGG)富集信號通路74條(P<0.05)，包括NOD樣受體信號通路、TNF信號通路、雌激素信號通路等。選取前20名信息通路，詳見表3。

圖5 冠心2號方治療CHD的GO功能富集分析圖

表3 冠心2號方治療CHD的KEGG功能富集信號通路

(續(xù)表)

2.5 分子對接分析 將冠心2號方作用靶點較多的前兩位成分槲皮素、山奈酚與核心靶點蛋白Degree值前兩位IL-6及VEGFA分別進行分子對接結合，結果如表4所示，一般而言，結合能<-20.9 kJ/mol說明可形成穩(wěn)定的對接結構，使用Pymol 2.5軟件實現對接結果可視化，觀察結合位點名稱及兩結合位點之間的距離。詳見圖6、圖7。

表4 冠心2號方治療CHD的主要活性成分與靶點的結合能 單位：kJ/mol

圖6 槲皮素與IL-6、槲皮素與VEGFA的分子對接3D模式圖

圖7 山奈酚與IL-6、山奈酚與VEGFA的分子對接3D模式圖

3 討 論

本研究利用網絡藥理學技術，通過網絡數據庫找到冠心2號方的活性化學成分160個，與CHD交集靶點74個，GO富集分析條目93條，KEGG富集分析得到信號通路74條。溫昭君[12]在進行了85例臨床觀察后發(fā)現，冠心2號方治療CHD療效較好，且相對于對照組，實驗組不良反應較少。李黔云等[13]進行108例CHD穩(wěn)定型心絞痛的臨床觀察，發(fā)現冠心2號方能明顯改善冠心病病人的癥狀、體征、心電圖，提高生活質量。從冠心2號方的活性成分分析，度值最高的前5位分別為紅花中的槲皮素、山奈酚，丹參和紅花中共有的木犀草素，赤芍和紅花中共有的黃芩素，赤芍、紅花及降香中共有的β-谷甾醇。槲皮素、木犀草素、黃芩素、山奈酚都屬于黃酮類化合物。槲皮素具有抗氧化、抗炎癥、保護心血管等作用，其通過減少氧化應激、干擾腎素-血管緊張素-醛固酮系統和下調活性氧介導的下游信號通路等方式發(fā)揮作用[14]。槲皮素進行抗動脈粥樣硬化的機制可能是通過下調高遷移率族蛋白1(HMGB1)、Toll樣受體4(TLR4)的蛋白和基因表達，并且呈劑量依賴性和時間依賴性[15]。山奈酚可通過抑制氧化應激和炎癥反應來防止動脈粥樣硬化的發(fā)生[16]。木犀草素可以預防心血管疾病的發(fā)生，機制為改善較高的血壓狀態(tài)和膽固醇含量[17]。黃芩素化學名稱為5，6，7-三羥基黃酮，與木犀草素相同都由降壓作用，同時又具有擴張血管、心肌保護、保護內皮細胞以及抗動脈粥樣硬化等藥理活性，從而達到血管保護的作用[18]。β-谷甾醇屬于植物甾醇，具有抗氧化、抗炎、免疫調節(jié)、抗腫瘤等作用[19]，研究發(fā)現β-谷甾醇能明顯降低血清總膽固醇和低密度脂蛋白的水平[20]，降低動脈硬化指數[21]，從而發(fā)揮抗動脈硬化作用。通過對冠心2號方有效成分的分析發(fā)現，冠心2號方通過降壓、降脂、抗炎、抗氧化等多種途徑來治療CHD，具有多途徑的特點。在PPI網絡圖中，得到與CHD交集自由度較高的靶點有IL6、VEGFA、TNF、TP53、MAPK1。IL6是其基因轉錄的一種多功能細胞因子，包含184個氨基酸，其在機體病理和生理活動中發(fā)揮多種作用，例如急性炎癥反應、自身免疫性疾病和腫瘤形成[22]。VEGFA廣泛存在于人的心、腦、骨骼等器官中，能夠促進新生血管的形成及血管內皮細胞的生長，并能夠改善心肌重塑，保護存活心肌細胞[23]。TNF是可以損傷腫瘤細胞且使其壞死的物質，TNF最重要的是對腫瘤的作用，同時也對心血管疾病有著重要的治療意義，并且VEGF須依靠TNF-α才能調節(jié)血管內皮高度滲透性的狀態(tài)[24]。TP53屬于腫瘤抑制因子，能夠抑制腫瘤的產生與生長，其機制為抑制細胞生長與誘導細胞凋亡、促進DNA損傷修復。同時在細胞自噬及葡萄糖代謝中也發(fā)揮重要作用[25]。MAPK1又稱為細胞外信號調節(jié)激酶2，在細胞的炎癥性反應、生長、分化、增殖和生存等生理過程中有重要調控作用[26]。

GO富集結果顯示，在BP過程富集條目主要為NO生物合成過程的正調控、平滑肌細胞增殖的正調控、對脂多糖(LPS)的細胞反應。NO由血管內皮細胞分泌，有維護血管正常收縮的功能，當NO分泌不足或過多時，會出現血管舒縮異常的癥狀，從而引起冠心病的發(fā)生與促進冠心病的發(fā)展[27]。VSMCs增殖是動脈粥樣硬化的重要病理改變，PDGF、成纖維細胞生長因子、血栓素A2、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)、極低密度脂蛋白都可使VSMCs增殖，在冠心病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[28]。脂多糖是冠心病機制性生物學標志物，能夠引導形成泡沫細胞并促進膽固醇酯在低密度脂蛋白中的累積，從而導致動脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展，脂多糖濃度越高，動脈內膜厚度越厚[29-30]。由此推測，冠心2號方可能通過增加NO分泌，減少平滑肌增殖，減少脂多糖等途徑來治療冠心病。

從KEGG富集分析結果可知，在治療過程中涉及的通路主要有NOD樣受體信號通路、TNF信號通路、雌激素信號通路等。張曉林[31]在研究中發(fā)現，大鼠腎臟缺血再灌注損傷中可激活NOD2信號通路介導的炎癥途徑導致急性腎損傷，予NADPH氧化酶抑制劑抑制氧化應激后可阻斷NOD2樣受體依賴的炎癥途徑以減輕腎臟缺血再灌注損傷。TNF介導的信號通路具有促進細胞生長、分化、凋亡和誘導炎癥的作用[32]。雌激素具有保護血管內皮細胞的作用，其過程與抑制PERK信號通路引起的內質網應激凋亡的過程有關[33]。由此推測冠心2號方可能通過減輕炎癥反應，以及減少細胞凋亡來保護血管內皮，從而達到治療冠心病的目的，說明冠心2號方治療CHD的路徑較多，機制相對較為復雜，同時也提示該生物過程將會是未來研究冠心2號方治療CHD的方向。

采用分子對接技術將槲皮素、山奈酚與核心靶點蛋白IL6及VEGFA分別進行分子對接結合，進行結合能力預測，結果發(fā)現槲皮素、山奈酚與IL6及VEGFA成分與有較強的結合能力，且結合較為穩(wěn)定。冠心2號方在治療CHD方面具有多通路、多靶點、多成分的特點，本研究通過網絡藥理學技術發(fā)掘預測并優(yōu)選冠心2號方有效成分及其作用靶點，構建可視化“成分-靶點-疾病-通路”多層次、多維度網絡圖，明確其藥效物質基礎，深入探究其治病機制，闡明其靶點作用通路，為冠心2號方后續(xù)的處方優(yōu)化及藥效學評價提供參考。同時也為其他復方中藥的研究提供思路與方法，促進現代中醫(yī)藥發(fā)展及新藥的發(fā)現與創(chuàng)新。