李衛(wèi)杰，梁冬麗，劉永忠，王朝霞，喬中東，徐汪節(jié)*

(1. 上海交通大學生命科學技術學院，上海 200240；2. 上海交通大學實驗動物中心，上海 200240；3. 上海交通大學醫(yī)學院仁濟醫(yī)院上海腫瘤研究所癌基因與相關基因國家重點實驗室，上海 200240)

精子發(fā)生是一個由一系列基因的精細調控完成的復雜過程，其間經歷劇烈的形態(tài)與功能的變化。 我們前期發(fā)現，不育患者精子中的Usp16 表達下調[1]，提示Usp16 可能與精子質量有關。

去泛素化酶Usp16 可特異性去除組蛋白H2A的泛素化修飾，調節(jié)Hox基因表達[2]、影響胚胎干細胞和造血干細胞分化[3-4]、對DNA 損傷修復起著負調控作用[5]。 Usp16 S552 的磷酸化是細胞正常增殖和細胞周期G2/M 期進程的基礎[6-8]。 此外，Usp16 參與Wnt 途徑的調節(jié)[9]、參與T 細胞介導的自身免疫病的發(fā)展[10]、還影響腫瘤的生長[11]。 但是Usp16 在精子發(fā)生中相關的功能研究較少。

由于Usp16 全身性敲除導致動物胚胎死亡[3]，所以本研究擬通過Cre-loxP 系統(tǒng)[12]構建生殖細胞特異性(Vasa-cre)敲除Usp16 小鼠，并分析其生殖表型來初步探究Usp16 在小鼠生精過程中的功能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

3 只野生型雄鼠(WT)、3 只雜合敲除 Usp16 雄鼠(Usp16flox/wt/Vasa-cre+)和3 只純合敲除Usp16 雄鼠(Usp16flox/flox/Vasa-cre+)為 4 月齡，體重約為28 g，用于表型分析。 5 只野生型雄鼠(WT)、27 只野生型雌鼠(WT) 和 2 只純合敲除 Usp16 雌鼠(Usp16flox/flox/Vasa-cre+)用于生育實驗，3 月齡，體重約為 26 g(雄鼠)和 22 g(雌鼠)。 1 只 Vasa-cre 轉基因雄鼠(B6. FVB-Tg(Ddx4-cre)1Dcas/KnwJ)購自賽業(yè)模式生物研究中心(太倉)有限公司【SCXK(蘇)2018-0003】，6 月齡，約 29 g。 1 只 Usp16flox/flox雌鼠由上海市腫瘤研究所劉永忠課題組【SYXK(滬)2018-0028】贈送，4 周齡，約 15 g。 以上小鼠均為SPF 級，遺傳背景均為C57BL/6 N，飼養(yǎng)于上海交通大學實驗動物中心【SYXK(滬)2018-0028】，溫度為20 ～25℃，濕度為40% ～70%，晝夜各半循環(huán)照明，籠具、飼料、墊料和飲水經高壓滅菌處理。 繁殖采用雌雄比 1 ∶1 或 2 ∶1 合籠，小鼠出生21 ～ 28 d 后分籠，至8 周齡性成熟。 所有操作均符合上海交通大學實驗動物倫理與使用委員會要求(審批號:A2021025)。

1.1.2 主要試劑與儀器

引物合成(上海桑尼生物科技有限公司)、血液/細胞/組織基因組DNA 提取試劑盒(DP304，天根生化科技 (北京) 有限公司)、 2 × Es Taq MasterMix(Dye)(CW0690，北京康為世紀生物科技有 限 公 司 )、 RNAiso plus ( 9109， TaKaRa )、PrimeScriptTMRT Reagent Kit(RR037A，TaKaRa)、FastStart Universal SYBR Green Master ( Rox )(04913850001，Roche)、兔抗小鼠 Usp16 抗體(14055-1-AP，武漢菲恩生物科技有限公司)、β-actin 抗體(ab6276，Abcam)、Alexa Fluor 594 山羊抗兔熒光二抗(A-11012，賽默飛世爾科技公司)、山羊抗小鼠IgG(H+L)-HRP(CW0102S，北京康為世紀生物科技有限公司)、山羊抗兔IgG (H+L)-HRP(CW0103S，北京康為世紀生物科技有限公司)、抗熒光淬滅封片液(含Hoechst 33342)(P0133-5 mL，上海碧云天生物技術有限公司)、ECL 發(fā)光試劑(C510043，生工生物工程(上海)股份有限公司)、Diff-Qick 染色液(G1541，北京索萊寶科技有限公司)。

邁朗精子分析儀(南寧松景天倫生物科技有限公司，中國)、電泳儀、PCR 擴增儀、實時熒光定量PCR 儀和凝膠成像儀(Bio-Rad，美國)、熒光顯微鏡(Zeiss，德國)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠的繁殖與篩選鑒定

應用Cre-loxP 基因編輯技術(圖1A)，將Vasacre 轉基因雄鼠與雌鼠Usp16flox/flox雜交，得F1 代雄鼠Usp16flox/wt/Vasa-cre+為雜合敲除組，繼續(xù)與雌鼠Usp16flox/flox回交得 F2 代雄鼠 Usp16flox/flox/Vasa-cre+為純合敲除組(圖1B)。

圖1 條件性敲除Usp16 小鼠的構建與繁殖Note. A. Cre-loxP knockout principle. B. Reproductive strategy.Figure 1 Construction and reproduction of Usp16 conditional knockout mice

剪取7 日齡左右小鼠腳趾，按照TIANGEN 試劑盒提取DNA，通過PCR 擴增并進行2%瓊脂糖凝膠電泳的方法確定小鼠基因型。 PCR 擴增10 μL 體系為 2 × Es Taq MasterMix(Dye)5 μL，ddH2O 4 μL，10 μmol/L 引物各 0.25 μL，模板 DNA 0.5 μL。Vasa-cre 基因擴增條件為 94℃ 30 s，62℃ 30 s，72℃45 s，33 個循環(huán)；Usp16-wt 基因擴增條件為 94℃ 30 s，59℃ 30 s，72℃ 45 s，38 個循環(huán)；Usp16-loxP 基因擴增條件為 94℃ 30 s，61℃ 30 s，72℃ 60 s，33 個循環(huán)。 所使用的引物信息見表1。

表1 小鼠基因型鑒定引物信息Table 1 Primers for mouse genotyping

1.2.2 小鼠組織總RNA 提取及qPCR

新鮮組織經液氮研磨后，用RNAiso plus 提取組織總RNA，取 1 μg 總 RNA 按反轉錄試劑盒合成cDNA。 cDNA 為模板，依照 Roche 熒光定量試劑盒說明書，用 Bio-Rad 熒光定量 PCR 儀進行 qPCR。目的基因 Usp16 上游引物:5’-CTGCCAAGACT GTAAGACTGAC-3’， 下 游 引 物: 5’-GGTGTCGTG TAGTGCTTCAAG-3’，內參基因 GAPDH 上游引物:5’-TGGCCTTCCGTGTTCCTAC-3’，下游引物:5’-GAGTTGCTGTTGAAGTCGCA-3 ’。 反 應 體 系:FastStart Universal SYBR Green Master (Rox) 10 μL，ddH2O 6.8 μL，上下游引物各 0.6 μL，cDNA 2 μL。反應條件:95℃ 10 min 預變性，95℃ 10 s，60℃30 s，40 個循環(huán)。 用 2-ΔΔCt法分析結果。

1.2.3 Western Blot

用RNAiso plus 提取組織總蛋白后，加入5×蛋白質凝膠電泳上樣緩沖液后煮沸10 min，取30 μL上樣，恒壓60 V 濃縮蛋白，恒壓120 V 分離蛋白(8%分離膠)，恒流300 mA 濕轉90 min，將蛋白轉移至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗(1 ∶2000 稀釋)于 4℃ 過夜，TBST 洗膜后加入相應 HRP 偶聯二抗(1 ∶20 000 稀釋)室溫孵育 1 h，TBST 洗膜后ECL 化學發(fā)光顯色于成像儀成像，結果用軟件Image J 進行灰度分析，β-actin 為內參。

1.2.4 HE 染色和免疫熒光

組織于4%多聚甲醛中固定，常規(guī)石蠟切片，HE染色，顯微鏡下拍照。 免疫熒光:切片脫蠟至水，放入預熱的檸檬酸鈉抗原修復液中微波加熱30 min自然冷卻后，0.5% Triton X-100 通透 20 min，PBS 洗后5%山羊血清37℃封閉90 min，PBS 洗后一抗(1∶200 稀釋)4℃ 孵育過夜，PBS 洗后二抗(1 ∶200稀釋)室溫孵育1 h，PBS 洗后滴加抗熒光淬滅封片液封片，熒光顯微鏡下拍照。

1.2.5 精液分析及精子涂片

取小鼠一側附睪，剪開小口使精液置于精子獲能液HTF 中，放入二氧化碳培養(yǎng)箱10 min，稀釋100倍后用邁朗精子分析儀分析。 其中取10 μL 精液涂片風干后，Diff-Qick 快速染色，顯微鏡下拍照。

1.3 統(tǒng)計學分析

獨立重復實驗3 次，結果用GraphPad Prism 8 軟件統(tǒng)計分析，以平均值±標準差()表示，兩組間平均值比較采用Student’st檢驗，多組間平均數比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異具有顯著性。

2 結果

2.1 Usp16 在野生型成年雄鼠不同組織中表達情況

qPCR 和 Western Blot 結果顯示 Usp16 在成年雄鼠睪丸組織表達量最高，在其他組織中(心、肝、脾、肺、腎和胃)表達量較低(圖2)。

圖2 Usp16 在野生型成年雄鼠不同組織中的表達情況Note. A. Usp16 mRNA expression level detected by qPCR. B. Usp16 protein expression level detected by Western Blot.Figure 2 Expression of Usp16 in different tissues of wild-type adult male mice

2.2 Usp16 條件性小鼠的建立及驗證

Usp16 條件性小鼠是在Usp16 基因第4 個外顯子兩端插入loxP 位點，PCR 條帶大小為961 bp，若被Vasa-cre 重組酶敲除則為170 bp，野生型和Vasacre 陽性條帶大小分別為 607 bp 和 240 bp，Usp16flox/wt小鼠可見 607 bp 和 961 bp 條帶，Usp16flox/flox小鼠只可見961 bp，雜合子 Usp16flox/wt/Vasa-cre+小鼠可見 961、607 和 240 bp 條帶，純合子Usp16flox/flox/Vasa-cre+小鼠可見 961、170 和 240 bp條帶(圖3)。

圖3 小鼠腳趾DNA 經PCR 擴增后電泳條帶Note. 1. Wild type. 2. Vasa-cre. 3. Usp16flox/wt. 4. Usp16flox/flox. 5.Usp16flox/wt/Vasa-cre+. 6. Usp16flox/flox/Vasa-cre+.Figure 3 Electrophoresis band of PCR amplification of mouse toe DNA

Usp16flox/wt/Vasa-cre+雄鼠與Usp16flox/flox雌鼠雜交共產仔 80 只(雄鼠 43 只，雌鼠 37 只)。 其中Usp16flox/wt基因型小鼠 26 只，Usp16flox/flox基因型小鼠21 只，Usp16flox/wt/Vasa-cre+基因型小鼠 27 只，Usp16flox/flox/Vasa-cre+基因型小鼠 6 只(雌鼠 3 只，雄鼠 3 只)。

qPCR 結果顯示:相較于野生型，雜合敲除組和純合敲除組雄鼠睪丸中Usp16 mRNA 表達顯著降低，分別降低了約83%和99%(Mean 0.17 SD 0.01 vs Mean 1.03 SD 0.03，P＜ 0.0001；Mean 0.01 SD 0.01 vs Mean 1.03 SD 0.03，P＜ 0.0001)(圖 4A)。Western Blot 結果顯示相較于野生型，雜合敲除組和純合敲除組雄鼠睪丸中Usp16 蛋白表達顯著降低，分別降低了約22%和43%(Mean 0.58 SD 0.10 vs Mean 0.75 SD 0.03，P= 0.0445；Mean 0.43 SD 0.05 vs Mean 0.75 SD 0.03，P= 0.0007)(圖 4B)。免疫熒光結果顯示Usp16 高表達于圓形精子，在體細胞中弱表達，純合敲除組雄鼠睪丸中Usp16 陽性圓形精子明顯少于野生型(圖4C)。 這些結果從基因和蛋白水平證明生殖細胞特異性敲除Usp16 小鼠建立成功。

圖4 條件性敲除Usp16 小鼠驗證Note. A. The expression of Usp16 mRNA levels in the testis of the wild type， heterozygous knockout and homozygous knockout group detected by qPCR. Compared with the wild type，****P ＜ 0.0001. B. The expression of Usp16 protein levels in the testis of the wild type， heterozygous knockout and homozygous knockout group detected by Western Blot. Compared with the wild type，*P ＜ 0.05，***P ＜ 0.001. C. Immunofluorescence detection of Usp16 in the testis. Red fluorescence represents Usp16 and blue fluorescence represents cell nucleus. Arrow. Positive germ cells.Figure 4 Verification of Usp16 conditional knockout mice

2.3 Usp16 條件性敲除小鼠表型分析

2.3.1 Usp16 敲除對睪丸組織形態(tài)的影響

野生型、雜合敲除組和純合敲除組的睪丸中曲細精管排列緊密，結構完整，直徑大小沒有明顯變化，管腔空腔化明顯，管壁至管腔的各類生精細胞層次分明，但純合敲除組睪丸中部分管腔中含有少量圓形精子相融形成的多核細胞(見圖5)。

圖5 睪丸HE 染色Note. Arrow. Multinucleated cell.Figure 5 HE staining of the testis

2.3.2 Usp16 敲除對附睪組織形態(tài)的影響

相較于野生型，純合敲除組附睪中精子密度減小，且附睪中早熟精子數顯著增加了約3 倍(Mean 5.77 SD 1.68 vs Mean 1.40 SD 0.36，P= 0.0117)，而雜合敲除組無明顯差異(圖6)。

圖6 附睪HE 染色Note. Solid arrow. Precocious sperm. Compared with the wild type，nsP ＞ 0.05，*P ＜ 0.05.Figure 6 HE staining of the epididymis

2.3.3 Usp16 敲除對精子質量及出生率的影響

野生型和雜合敲除組雄鼠生育能力正常，純合敲除雌鼠也能正常生育產仔。 而純合敲除組雄鼠僅與其交配的15 只雌鼠中的1 只成功生育鼠仔，受孕率約7%(表2)。

表2 生育能力測試Table 2 Fertility test

純合敲除組雄鼠的精子數量、活率和活力相較于野生型顯著下降，分別下降了約79%、81%和87%，精子運動速度(VSL、VCL、VAP)與精子空間位移程度(ALH、BCF、MAD)也顯著降低，分別降低了約80%、80%、80%、80%、78%和 78%，而雜合敲除組精子各參數沒有顯著差異(表3)。

表3 計算機輔助精子分析Table 3 Computer-aided sperm analysis

野生型和雜合敲除組中有一些精子的頭部、頸部和尾部會發(fā)生畸形，而純合敲除組相較于野生型精子畸形率顯著增加了約4 倍，高達約83%(Mean 83.33 SD 6.11 vs Mean 18.33 SD 5.51，P=0.0002)。 畸形類型有精子頭部無鉤狀不定型畸形，尾部和頸部出現卷曲或彎曲(圖7)。

圖7 精子涂片染色Note. Solid arrow. Curved neck and tail. Hollow arrow. Abnormal head. Compared with the wild type，nsP ＞ 0.05，****P ＜ 0.0001.Figure 7 Staining of sperm smear

3 討論

本研究通過Vasa-cre 轉基因小鼠與Usp16 條件性小鼠(Usp16flox/flox)雜交成功獲得生殖細胞特異性敲除Usp16 小鼠，并從基因和蛋白水平得到證實。Vasa 蛋白從12.5 dpc 開始表達持續(xù)至減數分裂后的精子細胞，通過與Vasa-cre 小鼠雜交，雄鼠睪丸中生殖細胞中的Usp16 被定向敲除，而除了睪丸中生殖細胞外，Usp16 在支持細胞和間質細胞中也有表達，故敲除后Western Blot 中仍能看到條帶，在免疫熒光中也有熒光表達。

精子發(fā)生是一個復雜而有序的過程，從精原細胞分化、精母細胞減數分裂至精子成熟，任何一個環(huán)節(jié)出現問題都有可能造成生殖缺陷。 雜合敲除組相對于野生型，Usp16 表達量也顯著降低，但生殖細胞中還存在Usp16，可能降低的Usp16 表達量不足以影響精子發(fā)生，故其精子質量和數量與野生型相比沒有明顯差異。 純合敲除雄鼠(Usp16flox/flox/Vasa-cre+)附睪中精子濃度明顯減少，曲細精管管腔中出現更多的早熟精子被釋放入附睪中，可能是由于精子釋放過程異常[13]，使得精細胞未能完成重塑形成成熟精子而被釋放入附睪中。 而純合敲除雄鼠睪丸中出現的少量多核細胞可能是由于圓形精子相融來抵抗細胞凋亡[14]。 此外，精子變態(tài)形成過程包含頂體發(fā)生、鞭毛形成和多余胞質脫落，其中生殖細胞染色質重塑[15]和組蛋白與魚精蛋白的交換[16]對精子形成至關重要，此過程的異常往往導致精子畸形，精子質量下降。 例如，E3 泛素連接酶RNF8 的缺失[17]或是Miwi 的雜合突變[18]都導致組蛋白上泛素化修飾的缺失，使得組蛋白和魚精蛋白無法完全交換造成精子少弱畸形癥，而純合敲除Usp16 雄鼠的生殖表型與其類似。 去泛素化酶Usp16 可特異性去除組蛋白H2A 泛素化修飾，且它在圓形精子細胞中表達上調[19]，推測其可能參與圓形精子至精子成熟的變態(tài)過程，其是否在此過程中調節(jié)組蛋白的泛素化修飾使得組蛋白和魚精蛋白交換異常，從而造成精子畸形、精子活力低和精子數量少等，還需進一步研究。 此外，純合敲除雌鼠能正常生育產仔，推測Usp16 對其卵子形成沒有明顯影響。

綜上所述，本文從基因和蛋白層面證實了成功構建了生殖細胞特異性敲除Usp16 小鼠。 通過對其生殖表型進行分析，發(fā)現純合敲除雄鼠精子數量和活力嚴重下降，大量精子形態(tài)出現異常，這些表型提示，去泛素化酶Usp16 可調節(jié)精子生成過程來影響精子質量和數量，最終對雄性生殖能力產生作用，具體作用機制還需進一步研究。