吳小溪 汪濤 杜晟楠 高靜靜 蔣元燁 曹勤

非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)全球流行率達(dá)到25.24%，且患病率逐年上升，在我國，超過25%的人患有NAFLD[1,2]。缺乏運(yùn)動(dòng)、不健康的飲食習(xí)慣都是NAFLD 發(fā)生的重要誘因[3,4]。20%～30%的NAFLD患者進(jìn)展為脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis, NASH)和纖維化，在極端情況下可能進(jìn)展為肝硬化，甚至肝癌[5-7]。改變不良生活方式、減少體質(zhì)量和腰圍是預(yù)防和治療NAFLD及其合并癥的重要措施[8]。不同國家和地區(qū)的指南對NAFLD患者的飲食及運(yùn)動(dòng)推薦不盡相同[9-12]，但是，限制碳水化合物飲食及適當(dāng)運(yùn)動(dòng)是廣泛推薦干預(yù)措施。本研究運(yùn)用等熱量低碳水化合物高蛋白飲食進(jìn)行干預(yù)4周，試圖找尋適合中國NAFLD患者的可以廣泛推廣和開展的飲食建議。

資料與方法

一、研究對象

以2019年1月至2020年1月在上海市普陀區(qū)中心醫(yī)院確診并定期隨訪的23例NAFLD患者為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡16～75歲，性別不限；②符合2018 年中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝臟病學(xué)分會(huì)脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組修訂的《非酒精性脂肪性肝病診療指南》中NAFLD的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①糖尿病或正在接受降糖藥或胰島素治療患者、嚴(yán)重心臟疾病患者；②接受或正在接受抗纖維化治療或抗病毒治療者；③6個(gè)月內(nèi)接受或正在進(jìn)行藥物、飲食等減肥治療患者；④排除其他慢性肝病，如慢性病毒性肝炎、酒精性肝病、藥物性肝病、自身免疫性肝疾病、遺傳性肝病患者；⑤合并有肝臟及其他臟器腫瘤、嚴(yán)重心肺系統(tǒng)疾病者。剔除標(biāo)準(zhǔn)：①自行中斷飲食干預(yù)者；②研究期間未按照規(guī)定方案進(jìn)食者。本研究通過上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(PETC-A-2018-49-1)。

二、研究方法

(一)等熱量低碳水化合物高蛋白限制飲食 根據(jù)基礎(chǔ)代謝率估算每個(gè)受試者的能量需求(使用Harris Benedict方程)，乘以相應(yīng)于受試者活動(dòng)水平的1.5。飲食提供來自碳水化合物4%的能量，來自脂肪72%的能量和來自蛋白質(zhì)24%的能量，而基線飲食中相應(yīng)的宏量營養(yǎng)素組分分別為40%、42%和18%。飲食中碳水化合物限制在23～30 g/d。

(二)患者基礎(chǔ)信息測量 干預(yù)4周前后，記錄患者年齡、身高、體質(zhì)量、腰圍。

(三)生化檢測 入組前及干預(yù)4周后，所有患者在夜間禁食后于第2日清晨采集血樣。分析血清肝功能、血脂、血糖指標(biāo)。

(四)生物標(biāo)志物 血清樣品100 μL，加入400 μL甲醇，振搖2 min，以14 000 r/min離心10 min，吸取200 μL上清，待檢測。使用高分辨質(zhì)譜，通過精確分子量并結(jié)合HMDB，mz/cloud等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對鑒定生物標(biāo)志物。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，比較采用配對樣本t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的計(jì)量資料以M(P25，P75)表示，比較采用 Wilcoxon 非參數(shù)檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、研究對象干預(yù)前后基礎(chǔ)信息比較

23例患者中，男性20例，女性3例。年齡為(40.8±17.1)歲，身高為(171.6±4.3)cm。經(jīng)等熱量低碳水化合物高蛋白飲食干預(yù)4周后；體質(zhì)量由74.00(70.75，80.00)kg降至72.50(69.50，78.25)kg，BMI由25.63(24.40，26.17)kg/m2降至24.87(24.27，26.15)kg/m2，腰圍從100.00(91.50，104.00)cm減少為98.00(94.50，100.00)cm，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-3.083、-3.389、-2.560，均P<0.05)。結(jié)果表明采用等熱量低碳水化合物高蛋白飲食干預(yù)1周后能顯著減少患者體質(zhì)量、腰圍及BMI，對NAFLD有良好的干預(yù)作用。

二、研究對象干預(yù)前后肝功能指標(biāo)變化

經(jīng)等熱量低碳水化合物高蛋白飲食干預(yù)4周后患者AKP、GGT、ALT、AST指標(biāo)均發(fā)生改善，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，而TBil、IDB、DB、TP、ALB、CHE等指標(biāo)無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。結(jié)果表明本飲食方案干預(yù)后可在一定程度上改善NAFLD患者的肝功能。

表1 23例研究對象干預(yù)前后肝功能指標(biāo)變化

三、研究對象干預(yù)前后血脂指標(biāo)變化

經(jīng)等熱量低碳水化合物高蛋白飲食干預(yù)4周后，患者血脂TC及GLU水平顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表2。結(jié)果表明本方案能夠有效降低患者血清總膽固醇，并且對于改善糖代謝也有一定作用。

表2 研究對象干預(yù)前后血脂指標(biāo)變化

四、干預(yù)前后患者血清樣本OPLS分析

采用 LC-Q-orbitrap/MS 技術(shù)分析了等熱量低碳水化合物高蛋白飲食干預(yù)前后患者血清代謝譜的變化，并鑒定血清生物標(biāo)志物。并使用Simca-P對質(zhì)譜采集的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)干預(yù)前后的血清樣本能夠完全實(shí)現(xiàn)分離。干預(yù)前后患者血清樣本OPLS分析結(jié)果見圖1。說明本方案能夠很好的改善NAFLD患者血清代謝。

圖1 干預(yù)前后患者血清樣本OPLS分析結(jié)果

五、干預(yù)前后患者血清樣本PCA分析

血清樣本PCA分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)樣本處于95%置信區(qū)間內(nèi)，干預(yù)前后患者血清樣本位于不同區(qū)域且基本分離，說明本飲食方案干預(yù)4周后NAFLD患者的血清代謝得到明顯改善。見圖2。

圖2 干預(yù)前后患者血清樣本PCA分析結(jié)果

六、差異性代謝物的尋找

進(jìn)一步進(jìn)行OPLS-DA分析，發(fā)現(xiàn)經(jīng)本飲食方案干預(yù)后患者血清中共存在67個(gè)差異代謝產(chǎn)物，其中以氨基酸和磷脂類代謝異常居多。這些具有差異的血清代謝產(chǎn)物可能是本飲食方案起效的潛在的生物標(biāo)志物。

討 論

目前，國內(nèi)外已有大量證據(jù)表明飲食可以干預(yù)及改善NAFLD，一項(xiàng)meta分析顯示，體質(zhì)量減輕能夠使NAFLD患者肝功能改善及肝脂肪變性減少，且改善程度與體質(zhì)量的減少呈正相關(guān)[13]。有報(bào)道表明，BMI降低5%，肝臟脂肪即可降低25%，低碳水化合物飲食能夠改善NAFLD患者脂質(zhì)代謝，使肝內(nèi)脂質(zhì)含量顯著降低[14-16]。

本研究采用等熱量低碳水化合物高蛋白飲食進(jìn)行4周的干預(yù)，結(jié)果顯示能夠顯著降低NAFLD患者體質(zhì)量、BMI、腰圍及血清GLU水平，患者血清ALT、AST指標(biāo)明顯改善，血脂TC水平顯著降低，這與國內(nèi)外的研究結(jié)果類似[17-19]。

代謝組學(xué)作為能宏觀整體觀察不同生物體系的代謝產(chǎn)物變化或其代謝產(chǎn)物隨時(shí)間的變化的一種技術(shù)，可以識別和量化特定生物樣本中的代謝物[20-23]。

本研究通過代謝組學(xué)分析共發(fā)現(xiàn)了67種差異性代謝產(chǎn)物，大部分為氨基酸和磷脂類代謝異常。在氨基酸代謝異常途徑中，患者苯丙氨酸、二酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-脯氨酸增加，而組氨酸、亮氨酸降低。肝臟是氨基酸代謝的主要器官，當(dāng)肝臟出現(xiàn)損傷時(shí)，血液中的氨基酸含量會(huì)發(fā)生顯著的變化。已有研究表明，苯丙氨酸含量升高與肥胖和肝脂肪變性高度相關(guān)，而NAFLD患者的肝功能惡化可能導(dǎo)致苯丙氨酸代謝下降[24-27]。在磷脂類代謝異常途徑中，患者1-棕櫚酰甘油磷酸膽堿，溶血磷脂， 1-亞油酸甘油磷酸膽堿增加，而1-油酰甘油磷酸膽堿降低。近年來，人們普遍認(rèn)識到脂質(zhì)是調(diào)控細(xì)胞功能和疾病的中心環(huán)節(jié)，而脂質(zhì)成分在NAFLD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用，脂質(zhì)毒性是肝臟發(fā)病機(jī)制中的重要因素[28-29]。本研究還發(fā)現(xiàn)經(jīng)4周干預(yù)后患者的膽堿增高，而甜菜堿降低。肝臟是膽堿代謝的主要場所，主要以磷脂酰膽堿的形式存在[30]。50多年來，人們已經(jīng)認(rèn)識到膽堿缺乏和肝臟脂質(zhì)積累之間的聯(lián)系[31]，并且建立了膽堿缺乏飲食誘導(dǎo)動(dòng)物NAFLD模型，但是關(guān)于膽堿在預(yù)防或治療 NAFLD 中的作用仍知之甚少。在肝細(xì)胞內(nèi)，膽堿可在線粒體中氧化為甜菜堿，然后供應(yīng)甲基，或進(jìn)入CDP-膽堿途徑合成磷脂酰膽堿。而磷脂酰膽堿的肝內(nèi)穩(wěn)態(tài)是通過平衡磷脂酰膽堿/膽堿/甜菜堿的攝取和合成代謝與磷脂酰膽堿的分解代謝和分泌來實(shí)現(xiàn)的[32]。膽堿/磷脂酰膽堿在NAFLD 疾病進(jìn)展中的作用機(jī)制仍然值得深入闡明。

綜上所述，等熱量低碳水化合物高蛋白飲食可以顯著降低 NAFLD 患者體質(zhì)量、BMI 及腰圍，改善患者的肝功能、血脂及血糖，可能是一種適合中國NAFLD患者的飲食建議，對于指導(dǎo)臨床醫(yī)生為 NAFLD 患者制定合理的飲食策略、預(yù)防NAFLD的進(jìn)展具有重要的臨床意義。但本研究是單中心研究，樣本量偏少，結(jié)果可能會(huì)存在一定的偏倚，今后需要進(jìn)行多中心大樣本量的研究，為臨床提供更加堅(jiān)實(shí)的依據(jù)。