龍遠雄, 徐寅, 鄧桂明

(湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院,湖南省長沙市 410007)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是一種最常見的鱗狀上皮細胞癌,其病因與EB病毒(epstein-barr virus，EBV)感染、遺傳、環(huán)境因素密切相關，放化療是目前治療鼻咽癌的有效方法,但晚期高分化鼻咽癌患者對放療靈敏度較差,預后效果不佳,常規(guī)化療藥物不良反應大、易產(chǎn)生耐藥性,因此急需尋求安全高效的治療方法來解決鼻咽癌治療的瓶頸[1]。中醫(yī)藥治療惡性腫瘤,在改善癥狀,提高生活質量等方面具有獨特優(yōu)勢,白花蛇舌草具有清熱解毒、消痛散結等功效,研究顯示白花蛇舌草具有抗炎、抗腫瘤等作用[2]。本研究基于網(wǎng)絡藥理學研究其作用于鼻咽癌的有效成分、核心靶點與關鍵通路,揭示白花蛇舌草治療鼻咽癌的藥理作用,以其為后續(xù)研究提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 白花蛇舌草有效化合物及作用靶點查詢

TCMSP數(shù)據(jù)庫(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)檢索白花蛇舌草的化合物,以口服利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、類藥性(drug like，DL)≥0.18為篩選條件,提取白花蛇舌草主要活性化合物,通過化合物編號檢索其作用靶標,并通過Uniport數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)檢索各靶點的基因名。

1.2 鼻咽癌相關靶點預測

基于GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)以“nasopharyngeal carcinoma”為關鍵詞檢索鼻咽癌相關靶基因,并與白花蛇舌草活性化合物靶點取交集,得到治療鼻咽癌的相關作用靶點。

1.3 “化合物-靶點”網(wǎng)絡構建與分析

將白花蛇舌草活性化合物及作用于鼻咽癌的相關靶點導入Cytoscape3.7.1軟件中,構建白花蛇舌草活性化合物-鼻咽癌靶點網(wǎng)絡圖，利用“Network Analyzer”功能網(wǎng)絡進行分析,根據(jù)化合物與靶點連接情況篩選關鍵化合物。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡構建及核心靶點篩選

將交集靶點導入STING數(shù)據(jù)庫(https://cn.string-db.org/),構建交集靶點蛋白互作(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡。借助Cytoscape3.7.1軟件對網(wǎng)絡進行拓撲分析,選取自由度(Degree)、介數(shù)、中心度均大于平均值的靶點為核心靶點。

1.5 GO功能富集分析與KEGG通路分析

將交集靶點導入DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp),進行GO功能富集和KEGG通路分析,對富集分析結果采用微生信平臺和Cytoscape3.7.1軟件進行可視化處理，分析核心靶基因功能和白花蛇舌草治療鼻咽癌的主要作用通路。

1.6 分子對接

將關鍵化合物(配體)作用于核心靶點(受體)進行分子對接。從TCMSP數(shù)據(jù)庫以及PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)中下載關鍵化合物分子與核心靶點的分子結構,并分別保存為mol2與pdb格式文件,將兩者導入AutoDock1.1.2軟件進行加工,輸出pdbqt格式文件后進行對接,若配體與受體可自發(fā)結合,則結合能<0 kcal/mol,若結合能<-5 kcal/mol表示具有較好的結合活性,若結合能<-7 kcal/mol表示具有強烈的結合活性；結合能絕對值越大,表示結合活性越強[3]。

2 結 果

2.1 白花蛇舌草有效化合物及作用靶點

白花蛇舌草有效化合物7個,獲取各化合物靶點237個,其中MOL001646化合物找不到靶點,故實際有效化合物為6個(表1),對應去重后靶點數(shù)為123個,再通過Uniprot獲取各靶點基因名。

表1 白花蛇舌草有效化合物基本信息表

2.2 鼻咽癌疾病靶點

檢索到鼻咽癌相關靶點數(shù)2 143個,排序提取相關性得分≥5的靶點共908個納入本研究。

2.3 化合物-靶點網(wǎng)絡構建與分析結果

將白花蛇舌草123個靶點,與鼻咽癌908個靶點基因比對,獲取交集靶點49個,可能是白花蛇舌草與治療鼻咽癌相關靶點。Cytoscape3.7.1軟件對6個活性化合物和49個靶點構建白花蛇舌草活性化合物-鼻咽癌靶點互作網(wǎng)絡,Network Analyzer功能分析結果為網(wǎng)絡中55個節(jié)點(化合物節(jié)點6個,靶基因節(jié)點49個)和80條邊(圖1)。提取Degree≥10的化合物作為關鍵化合物共4個,依次為槲皮素44度、β-谷甾醇12度、2-甲氧基-3-甲基-9,10-蒽醌11度、豆甾醇10度。

圖1 白花蛇舌草活性化合物-鼻咽癌靶點網(wǎng)絡圖△為化合物節(jié)點,○為靶基因節(jié)點。

2.4 PPI網(wǎng)絡構建及核心靶點篩選結果

STRING數(shù)據(jù)庫構建交集靶點PPI網(wǎng)絡(圖2)。拓撲分析結果顯示,自由度、介數(shù)、中心度數(shù)均超過平均值的靶點有12個,可能是白花蛇舌草治療鼻咽癌的核心靶點(表2)。

表2 白花蛇舌草治療鼻咽癌的12個核心靶點

圖2 交集靶點蛋白互作網(wǎng)絡圖

2.5 GO功能與KEGG通路分析結果

結果顯示49個交集靶點基因共影響163個生物學過程。其中生物進程(biological process，BP)122個,分子功能(molecular function，MF)過程23個,細胞組分(cell component，CC)18個。白花蛇舌草治療鼻咽癌主要影響的BP富集于RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控、轉錄正調控、DNA模板等；影響的MF富集于蛋白質結合、酶結合等；影響的CC富集于細胞核、細胞質等(圖3)。

圖3 GO功能富集結果

KEGG顯示，49個交集基因得到通路共63條(P<0.01)。選擇富集顯著性(P.Value)排名前15的進行分析,并Cytoscape3.7.1構建白花蛇舌草活性成分-靶點-通路可視化網(wǎng)絡圖見圖4。

圖4 白花蛇舌草活性化合物-靶點-通路網(wǎng)絡圖

2.6 分子對接結果

將白花蛇舌草中關鍵化合物與Degree值排名前5核心靶點進行分子對接,結合能均<0 kcal/mol(表3)，表示白花蛇舌草中關鍵化合物與核心靶點可自發(fā)結合。

表3 白花蛇舌草關鍵化合物-核心靶點分子對接 單位：kcal/mol

3 討 論

鼻咽癌病因為外感六淫、內傷七情等,主要病機為正氣不足、毒熱內蘊、痰瘀互結,病理產(chǎn)物為火毒、瘀血、痰凝,臨床治療強調清熱解毒[4]。中藥白花蛇舌草可清熱解毒,具有抗炎、抗腫瘤等作用,對鼻咽癌治療具有較好的效果。

本研究結果顯示，白花蛇舌草可能發(fā)揮鼻咽癌治療作用的關鍵成分有槲皮素、β-谷甾醇、2-甲氧基-3-甲基-9,10-蒽醌、豆甾醇。槲皮素屬于黃酮類化合物，能通過調節(jié)抑癌基因表達、阻斷細胞周期、誘導細胞凋亡等發(fā)揮抗癌作用[5]。β-谷甾醇與豆甾醇均為甾醇類化合物，可通過阻滯細胞周期而抑制腫瘤細胞的增殖，能促使其發(fā)生典型的凋亡變化，誘導癌細胞凋亡并抑制其轉移[6]。2-甲氧基-3-甲基-9,10-蒽醌為蒽醌類化合物，能夠通過激活細胞表面誘導Fas、死亡受體4和腫瘤壞死因子凋亡，促進胱天蛋白酶8的活化誘導凋亡[7]。

PPI網(wǎng)絡與拓撲分析篩選出12個核心靶點，最重要靶點TP53 Degree值最大。TP53抑瘤基因在DNA損傷和癌基因等應激條件下激活，阻滯細胞周期、抑制細胞增殖、誘導細胞分化、啟動細胞凋亡、抑制腫瘤血管生成，阻止腫瘤的發(fā)生發(fā)展[8]。VEGFA為本研究的關鍵靶點之二，能特異性刺激腫瘤血管內皮細胞增殖與血管生成，與VEGFR1結合可促進內皮細胞分裂和增殖，誘導癌細胞生長和轉移[9]。JUN家族中的成員c-jun基因作為轉錄因子，可參與細胞的侵襲、遷移和轉移,促進鼻咽癌的發(fā)展和放射抗性[10]。TNF細胞因子對腫瘤具有雙向調控作用，既是抗癌活性最強細胞因子之一，亦是高水平下明顯促進腫瘤進展以及轉移相關基因之一[11]。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤壞死因子-α可通過激活ERK1/2信號通路，影響鼻咽癌細胞的侵襲和遷移能力[12]。IL-6可通過與自身靶細胞的IL-6受體結合調節(jié)腫瘤發(fā)生發(fā)展[13]。本研究分子對接結果顯示，兩者結合活性較好，其中槲皮素與靶點VEGFA、JUN、IL-6，β-谷甾醇與靶點TP53、TNF，2-甲氧基-3-甲基-9,10-蒽醌與靶點TNF，豆甾醇與靶點TP53、TNF、IL-6結合能均<-7.0 kcal/mol，說明上述靶點蛋白和關鍵化合物具有強烈的結合活性，在白花蛇舌草治療鼻咽癌中可能發(fā)揮重要作用。

GO功能富集結果顯示白花蛇舌草作用于鼻咽癌的靶點影響163個生物學過程，包括基因正向調控、蛋白表達、細胞核、細胞質等，這些生物過程可能在鼻咽癌的發(fā)展轉歸中體現(xiàn)重要作用。KEGG結果顯示白花蛇舌草活性化合物可能作用癌癥信號通路、HIF-1信號通路、PI3K-Akt信號通路而發(fā)揮作用。在HIF-1通路中，腫瘤在其發(fā)展過程中均會造成局部的乏氧微環(huán)境，進而激活HIF-1，特別是HIF-1α的表達明顯增加，能促進腫瘤的迅速生長及侵襲[14]。PI3K-Akt信號通路參與細胞增殖、分化、遷移、凋亡和血管生成等過程，亦有研究表明此通路與鼻咽癌的發(fā)生及預后有密切聯(lián)系[15]。

綜上，白花蛇舌草可能通過關鍵化合物槲皮素、β-谷甾醇、2-甲氧基-3-甲基-9,10-蒽醌，豆甾醇作用于TP53、VEGFA、JUN、TNF、IL-6等關鍵靶點，影響相關生物學過程與關鍵通路干預鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展。本研究初步分析了白花蛇舌草治療鼻咽癌可能的作用機制，為后續(xù)研究提供了參考依據(jù)。