葉小凱 王琳

肺囊腫的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，吸煙是其主要病因，然而臨床上也發(fā)現(xiàn)很多非吸煙的患者，并且在這一些非吸煙的患者中有的具有家族簇集現(xiàn)象，通過(guò)對(duì)其家系調(diào)查，遺傳圖譜繪制，發(fā)現(xiàn)其存在孟德?tīng)栠z傳現(xiàn)象。全外顯子組測(cè)序是指利用序列捕獲技術(shù)將全基因組外顯子區(qū)域DNA捕捉并富集后，再進(jìn)行高通量測(cè)序的基因組分析方法，外顯子組序列僅占全基因組序列的1%左右，與人類85%致病基因突變相關(guān)，近年來(lái)其越來(lái)越多的被應(yīng)用于人類遺傳病研究中，應(yīng)用全外顯子組測(cè)序能夠快速發(fā)現(xiàn)罕見(jiàn)遺傳疾病的致病基因。本課題納入臨床工作發(fā)現(xiàn)1例非吸煙患者反復(fù)因肺囊腫出現(xiàn)自發(fā)性氣胸的家系，為明確其肺囊腫伴反復(fù)氣胸的病因，應(yīng)用全外顯子組測(cè)序探尋其家族性肺囊腫是否存在遺傳致病因素。

1 資料與方法

1.1 一般資料

遴選出2018年8月—2021年8月我科臨床上發(fā)現(xiàn)的具有家族聚集現(xiàn)象的肺囊腫家系，共納入1例肺囊腫家系。先證者王**，女性，45歲，保險(xiǎn)代理人，因“咳嗽、胸悶、氣喘3 d”為主訴于2017年2月首次就診我院。門(mén)診行胸部CT：右側(cè)氣胸，雙肺多發(fā)肺囊腫，門(mén)診擬“自發(fā)性氣胸、肺囊腫”收入院。既往身體健康，無(wú)慢性疾病史，無(wú)吸煙史。家族遺傳史：其母親有雙肺多發(fā)肺囊腫，其妹妹有肺囊腫、反復(fù)多次自發(fā)性氣胸病史，其2個(gè)兒子有肺囊腫。先證者2017年2月7日胸部CT：右側(cè)氣胸伴肺囊腫（圖1），入院后行腎臟彩超：雙腎無(wú)異常，無(wú)腫瘤占位情況。入院給予胸腔閉式引流術(shù)，患者治療好轉(zhuǎn)出院。出院后患者仍反復(fù)多次自發(fā)性氣胸于當(dāng)?shù)刂委煛＝Y(jié)合先證者具有家族聚集性氣胸、肺囊腫遺傳特點(diǎn)，推斷其家系存在遺傳性疾病。本研究納入先證者家系3代8人（分別為先證者、其父親、其母親、其妹妹、其弟弟、其丈夫、其2個(gè)兒子）作為研究對(duì)象，本研究經(jīng)受試者的知情同意及廈門(mén)市海滄醫(yī)院倫理委員倫理論證通過(guò)。

1.2 方法

遴選出臨床上具有家族聚集現(xiàn)象的肺囊腫家系，對(duì)先證者家系進(jìn)行遺傳咨詢，繪制遺傳圖譜。在簽署知情同意書(shū)后，采集先證者標(biāo)本及家系成員全血各2 mL（EDTA抗凝）送廈門(mén)基源醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行全外顯子組測(cè)序，提取外周血白細(xì)胞全基因組DNA，進(jìn)行DNA建庫(kù)和捕獲，并進(jìn)行150 bp雙末端測(cè)序，對(duì)檢出變異進(jìn)行生物信息分析，并運(yùn)用Sanger測(cè)序?qū)ο茸C者家系成員進(jìn)行突變位點(diǎn)的驗(yàn)證。

1.3 生物信息學(xué)分析

對(duì)檢出的SNP和Indel變異，采用ANNOVAR軟件進(jìn)行注釋，注釋信息包括染色體起始和終止位置、參考等位基因、替代等位基因，以及包括基因功能、公共數(shù)據(jù)庫(kù)人群頻率（包括千人基因組，ExAC，GnomAD數(shù)據(jù)庫(kù)等）、蛋白功能預(yù)測(cè)軟件結(jié)果（包括SIFT，PROVEAN，MutationTaster，CADD等）、ClinVar數(shù)據(jù)庫(kù)等信息。對(duì)變異進(jìn)行篩選以及基因型-表型關(guān)聯(lián)分析。最后，參考美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)（ACMG）遺傳變異分類標(biāo)準(zhǔn)與指南對(duì)候選基因變異進(jìn)行變異致病性評(píng)估與遺傳解讀。

2 結(jié)果

2.1 先證者家系分析

納入先證者家系共3代8人，分別為先證者、先證者父親、先證者母親、先證者妹妹、先證者弟弟、先證者丈夫、先證者大兒子、小兒子，其中先證者反復(fù)3次發(fā)作自發(fā)性氣胸伴肺囊腫見(jiàn)圖1，經(jīng)住院期間系統(tǒng)檢查，先證者無(wú)腎囊腫、纖維毛囊瘤，皮膚角化、腎腫瘤、面部丘疹，不伴有慢性疾病情況。先證者母親、妹妹、大、小兒子有肺囊腫，不伴有慢性疾病情況；先證者父親、弟弟、丈夫沒(méi)有肺大泡、肺氣腫。其家系圖譜分析符合常染色體顯性遺傳特征（圖2）。

圖1 先證者氣胸伴肺囊腫

圖2 先證者家系遺傳圖譜

2.2 全外顯子組測(cè)序結(jié)果及生物信息分析

本全外顯子組基因檢測(cè)針對(duì)人類基因組的外顯子組的全部區(qū)域，覆蓋20 000多個(gè)基因，涵蓋85%以上的人類遺傳性疾病。檢測(cè)范圍包括基因編碼區(qū)單核苷酸位點(diǎn)變異（single nucleotide varients）、小片段插入/缺失等突變類型。對(duì)先證者進(jìn)行全外顯子組測(cè)序，共獲得了8 814 253 200測(cè)序讀長(zhǎng)，總的有效讀長(zhǎng)3 7401 954，目標(biāo)的平均測(cè)序深度80.47，目標(biāo)區(qū)域的覆蓋率99.4%，先證者共檢出77 994基因變異，包括同義突變、錯(cuò)義突變、剪接突變、移碼插入、移碼刪除等（見(jiàn)表2）。經(jīng)全外顯子組測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)先證者FLCN基因第14號(hào)外顯子上存在一處變異c.1579_1580insA:p.R527fs（NM_144997）（變異詳細(xì)信息見(jiàn)表3），該變異為雜合移碼突變，第1579至1580號(hào)堿基間插入堿基A，導(dǎo)致氨基酸由精氨酸變成谷氨酰胺，隨后的第75個(gè)氨基酸變?yōu)榻K止密碼子，形成截短蛋白，該移碼突變發(fā)生在3’端，預(yù)計(jì)不會(huì)導(dǎo)致無(wú)義介導(dǎo)的mRNA衰變。檢出變異在千人基因組、gnomAD公共人群數(shù)據(jù)庫(kù)中未見(jiàn)收錄，在ExAC、AF公共人群數(shù)據(jù)庫(kù)中亞洲人群頻率為0.000 1，突變導(dǎo)致蛋白丟失小于10%。根據(jù)根據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)（american college of medical genetics and genomics，ACMG）指南，對(duì)PVS1進(jìn)行降級(jí)至PVS1_Moderate。對(duì)變異進(jìn)行篩選及基因型-表型關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)該基因變異，該基因關(guān)聯(lián)表型為Birt-hogg-dube syndrome（Birt-hogg-dube 綜合征）（OMIM：135150）。

表1 先證者家系臨床特點(diǎn)

表2 先證者外顯子測(cè)序結(jié)果

表3 先證者突變情況

2.3 Sanger測(cè)序

針對(duì)先證者檢出的候選變異位點(diǎn)設(shè)計(jì)上下游引物，并進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，采用Sanger法測(cè)序驗(yàn)證。引物設(shè)計(jì)：FLCN-F，5’-TGCGGAGCCCTAACTCAATC-3’；FLCN-R，5’-CCCATACCCATACCCGACAG-3’。分別對(duì)先證者、父母及其他家系成員進(jìn)行Sanger測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果如圖3所示。

圖3 先證者及家系成員基因測(cè)序結(jié)果

2.4 變異位點(diǎn)致病性評(píng)級(jí)

結(jié)合全外顯子組測(cè)序及Sanger測(cè)序結(jié)果，根據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)（american college of medical genetics and genomics，ACMG）指南判定該變異為致病性的基因變異（致病性證據(jù)等級(jí)為PVS1_Moderate+PS4+PM2_Supporting+PP1_Strong）。

3 討論

Birt-hogg-dube（BHD）綜合征是一種以面部丘疹，肺囊腫，大皰病，自發(fā)性氣胸，腎腫瘤、腎囊腫、結(jié)腸腫瘤為臨床表現(xiàn)的罕見(jiàn)的常染色體顯性遺傳病，皮膚角化、纖維毛囊瘤為其特征改變，其由位于第17號(hào)染色體的FLCN基因突變引起[1]。典型的BHD綜合征患者常伴有肺囊腫、面部丘疹、腎臟腫瘤等三聯(lián)征表現(xiàn)，然而不同人群其臨床表現(xiàn)仍有明顯差異，中國(guó)人群大多僅有肺部表現(xiàn)，表現(xiàn)為肺型BHD綜合征即僅有肺部氣囊或伴有自發(fā)性氣胸，較少伴有其他系統(tǒng)損害表現(xiàn)，對(duì)于這部分人群如果沒(méi)有進(jìn)行全外顯子組或全基因組檢測(cè)常常會(huì)導(dǎo)致疾病的誤診。

表4 ACMG致病性評(píng)級(jí)

現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)FLCN基因突變位點(diǎn)超過(guò)200個(gè)，這些突變主要包含小片段的插入/缺失、剪接突變和無(wú)義突變，其中c.1285dup是白種人和亞洲人群中最常見(jiàn)的突變[2-3]。查閱維普、萬(wàn)方中文數(shù)據(jù)庫(kù)，截止2021年12月31日暫未發(fā)現(xiàn)該基因變異位點(diǎn)（c.1579_1580insA）相關(guān)病例報(bào)道，本例為國(guó)內(nèi)首例報(bào)道；查閱PubMed英文數(shù)據(jù)庫(kù)，已有4個(gè)相關(guān)家系病例報(bào)道檢出FLCN基因c.1579_1580insA變異，均來(lái)自中國(guó)家庭，已報(bào)道癥狀除了氣胸，肺囊腫，還包括有皮膚病變，腎臟病變和肝臟病變，如淋巴結(jié)腫大，脂肪粒，皮疹，腎囊腫，肝囊腫[4-7]。不過(guò)與國(guó)外報(bào)道不同的是，文章研究家系中攜帶FLCN基因c.1579_1580insA變異的陽(yáng)性病例均僅有肺部損害表現(xiàn)，其中包括65歲的先證者母親。BHD綜合征患者的預(yù)后相對(duì)良好，盡管腎癌是其最嚴(yán)重的并發(fā)癥，但其在中國(guó)人群的發(fā)病率并不高，考慮到先證者檢出變異有50%概率遺傳給子代，我們后續(xù)將密切觀察隨訪該家系成員其他癥狀表現(xiàn)，特別是針對(duì)腎臟腫瘤的隨訪觀察。

FLCN基因突變?nèi)绾螌?dǎo)致BHD綜合征相關(guān)病變其發(fā)病機(jī)制并不清楚，推斷由于FLCN基因突變導(dǎo)致FLCN蛋白功能喪失從而影響上述生命活動(dòng)功能進(jìn)而出現(xiàn)相關(guān)疾病。FLCN蛋白參與了多種生命活動(dòng)過(guò)程，包括信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞黏附、溶酶體和線粒體的生物合成、纖毛形成、細(xì)胞能量代謝和營(yíng)養(yǎng)穩(wěn)態(tài)等。FLCN基因目前被認(rèn)為是一種抑癌基因，攜帶FLCN變異基因的患者腎癌的患病率高[8-9]?，F(xiàn)有研究表明FLCN基因可能通過(guò)參與雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號(hào)通路、TGFβ/BMP 信號(hào)通路、Rho A信號(hào)調(diào)控、PGC1α驅(qū)動(dòng)的線粒體生物合成、TFE3/TFEB轉(zhuǎn)錄調(diào)控等多種細(xì)胞信號(hào)通路調(diào)控從而起到腫瘤抑制作用[10-15]，而FLCN基因發(fā)生變異時(shí)通過(guò)上述信號(hào)通路產(chǎn)生的腫瘤抑制作用將大大減弱。FLCN基因突變所引起的肺部氣囊病變，其病理改變是肺泡囊性擴(kuò)張所形成的肺囊腫，當(dāng)肺氣囊發(fā)生破裂可形成自發(fā)性氣胸，該致病機(jī)制目前尚不清楚。本研究家系先證者其肺部多發(fā)囊性病變伴反復(fù)自發(fā)性氣胸表現(xiàn)為肺型BHD綜合征，其FLCN基因第14號(hào)外顯子上c.1579_1580insA:p.R527fs（NM_144997）移碼插入，導(dǎo)致FLCN蛋白過(guò)早截短蛋白及功能喪失，考慮為其致病基礎(chǔ)。FLCN蛋白在肺內(nèi)巨噬細(xì)胞、纖維原細(xì)胞以及I型肺泡上皮細(xì)胞表達(dá)，相關(guān)研究表明當(dāng)其基因發(fā)生突變時(shí)，通過(guò)巨噬細(xì)胞和纖維原細(xì)胞會(huì)分泌大量的炎性因子，誘發(fā)炎癥，最終造成肺內(nèi)彈性纖維的破壞而導(dǎo)致氣胸[16]，其病理表明因?yàn)檠装Y導(dǎo)致肺結(jié)構(gòu)的改變引起氣囊的形成及氣胸的發(fā)生[16]。也有研究表明，F(xiàn)LCN基因突變導(dǎo)致FLCN單倍體不足，進(jìn)而導(dǎo)致肺成纖維細(xì)胞功能障礙，影響肺組織修復(fù)能力[17]。處此之外也有研究表明，F(xiàn)LCN在中胚層間葉細(xì)胞中的缺失導(dǎo)致肺泡生長(zhǎng)顯著減少及破壞，導(dǎo)致氣囊[18]。

外顯子組序列僅占全基因組序列的1%左右，卻包含了大約85%的已知致病基因變異。近年來(lái)隨著全外顯子組檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，其越來(lái)越廣泛的運(yùn)用于人類遺傳性疾病的研究。以往傳統(tǒng)篩查遺傳疾病主要通過(guò)連鎖分析和關(guān)聯(lián)分析，以家系為單位，多采用以假說(shuō)為導(dǎo)向的候選基因法，選定一個(gè)或幾個(gè)候選基因，在家系成員中對(duì)這些候選基因進(jìn)行Sanger測(cè)序，根據(jù)基因表型與疾病表型確定候選基因與疾病質(zhì)檢關(guān)系。此方法不僅研究效率低，且需要樣本多，對(duì)于罕見(jiàn)疾病或人數(shù)稀少的小家系不適用。全基因組測(cè)序可直接發(fā)現(xiàn)變異位點(diǎn)，但其費(fèi)用昂貴，且檢測(cè)到的變異位點(diǎn)多位于非功能區(qū)域。外顯子組測(cè)序具有以下優(yōu)勢(shì)：可針對(duì)連鎖分析不能檢測(cè)的罕見(jiàn)疾病和小家系進(jìn)行檢測(cè)；可以將不同家系樣本綜合研究；僅對(duì)編碼蛋白的功能區(qū)域進(jìn)行測(cè)序，定位準(zhǔn)確；研究周期短，大大加快研究進(jìn)程，相比以上兩種方法，外顯子組測(cè)序是一種經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)潔、快速的尋找致病基因的方法。

文章研究通過(guò)應(yīng)用全外顯子組測(cè)序技術(shù)，在納入研究的具有遺傳疾病特征的小樣本家系的先證者中發(fā)現(xiàn)了FLCN基因c.1579_1580insA位點(diǎn)變異，在其他陽(yáng)性家系成員中，采用Sanger測(cè)序驗(yàn)證同樣檢出該變異，故該變異在本次研究家系中呈現(xiàn)共分離特點(diǎn)，通過(guò)應(yīng)用生物信息分析及致病性分析進(jìn)而鎖定該致病基因變異。盡管我們檢出了c.1579_1580insA位點(diǎn)變異，但是該變異如何導(dǎo)致BHD綜合征，其發(fā)病機(jī)制仍不清楚有待進(jìn)一步研究。通過(guò)本研究，建議臨床上若出現(xiàn)不明原因肺囊腫，并呈現(xiàn)家族聚集性，應(yīng)進(jìn)行基因檢測(cè)以明確是否存在遺傳因素，全外顯子組測(cè)序作為一種經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)潔、快速的檢測(cè)技術(shù)，應(yīng)作為輔助臨床診斷的首選技術(shù)，文章研究為后期肺囊腫的臨床診療指南的制定提供了借鑒內(nèi)容。