楊璧英，黃柳向

1 湖南中醫(yī)藥大學(xué) 湖南長(zhǎng)沙 410208 2 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 湖南長(zhǎng)沙 410007

胃食管反流?。╣astroesophageal reflux disease，GERD）是指胃十二指腸內(nèi)容物反流入食管引起燒心等癥狀的疾病，我國(guó)GERD 的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[1]。GERD 主要分為非糜爛性反流?。╪on-erosive reflux disease，NERD）、反流性食管炎（reflux esophagitis，RE）和Barrett 食管 （Barrett esophagus，BE）三大臨床類(lèi)型。目前，GERD 在我國(guó)患病率約12.5%[2]。中醫(yī)根據(jù)臨床癥狀，將GERD 歸屬于“食管癉”“噫醋”“吐酸“等范疇[3]。《醫(yī)林繩墨》指出該病為胃口之酸水攻激于上，于咽嗌之間，致酸味刺心，揭示了本病的病位涉及食管和胃，并與肝、膽、脾、肺密切相關(guān)，朱震亨言：“一有怫郁則諸病生焉”“傳化失常則六郁病見(jiàn)”。GERD 總以肝木之“氣郁”為病機(jī)旨要，肝木氣機(jī)拂郁，致結(jié)聚不得發(fā)越，橫逆犯胃，釀酸上漬食道發(fā)為本病[4]。此外，李氏[5]在臨床試驗(yàn)中得出，通過(guò)證素辨證理論證實(shí)半夏瀉心湯治療吐酸的有效率高達(dá)96.2%。因此，這也為半夏瀉心湯治療GERD 的臨床應(yīng)用提供了充分的理論依據(jù)。相關(guān)文獻(xiàn)也表明，中醫(yī)藥治療GERD 的臨床療效確定、價(jià)格低廉、復(fù)發(fā)率低[6]，具有一定的特色和優(yōu)勢(shì)。

資料與方法

1 半夏瀉心湯有效成分的收集與篩選

通 過(guò)TCMSP 平 臺(tái)（https：//tcmspw.com/）[7]收 集半夏瀉心湯中半夏、黃連、黃芩、干姜、甘草、人參、大棗七味藥物的的活性成分和對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，并按文獻(xiàn)報(bào)道[8]，將藥代動(dòng)力學(xué)（ADME）參數(shù)設(shè)為：口服生物利用度（OB ≥30%，類(lèi)藥性（DL）≥0.18，篩選符合條件的有效成分，挖掘出此七種藥物的作用靶點(diǎn)，并通過(guò)Uniprot 平臺(tái)進(jìn)行靶點(diǎn)名字轉(zhuǎn)換。

2 半夏瀉心湯藥材-有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通過(guò)TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)獲取半夏瀉心湯中七味藥有效成分所對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)信息，將所有靶點(diǎn)合并、去重，并通過(guò)UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)下載注釋文件，對(duì)其名稱(chēng)標(biāo)準(zhǔn)化，然后利用Cytoscape3.8.2 軟件，構(gòu)建可視化網(wǎng)絡(luò)。

3 疾病靶點(diǎn)的獲取

Genecardss 是人類(lèi)基因綱要，使研究人員能夠有效地搜尋和關(guān)聯(lián)人類(lèi)基因、疾病、變異、蛋白質(zhì)、細(xì)胞和生物途徑[9]。利用GeneCards（https：//www.genecards.org/）數(shù) 據(jù) 庫(kù) 以“gastroesophageal reflux disease”為關(guān)鍵詞搜索與胃食管反流病相關(guān)發(fā)病機(jī)制靶點(diǎn)，得到胃食管反流病靶點(diǎn)，并繪制中藥靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)的韋恩圖，得到交集靶點(diǎn)。

4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction，PPI）的構(gòu)建

采用計(jì)算機(jī)R 語(yǔ)言中venn 程序包繪制半夏瀉心湯與GERD 交集靶點(diǎn)韋恩圖，將其導(dǎo)入STRING（https：//string-db.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)中建立PPI 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，并利用Cytoscape3.8.2 軟件中CytoNCA 插件對(duì)核心蛋白進(jìn)行多種中心性的計(jì)算，篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)。

5 GO 功能與KEGG 通路富集分析

采用計(jì)算機(jī)R 語(yǔ)言中clusterProfiler 程序包對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO 功能和KEGG 通路分析，并繪制氣泡圖進(jìn)行可視化。

6 分子對(duì)接驗(yàn)證

分子對(duì)接是基于計(jì)算機(jī)技術(shù)，虛擬預(yù)測(cè)分子配體與靶標(biāo)的方法，是藥物設(shè)計(jì)領(lǐng)域的重要手段之一[10]。在PubChem（https：//www.rcsb.org/）中得到半夏瀉心湯中化合物的2D 結(jié)構(gòu)，并導(dǎo)入Chem3D 軟件得到優(yōu)化后的3D 結(jié)構(gòu)；通過(guò)PYMOL 軟件去除了水分子和配體，分離蛋白結(jié)構(gòu)。采用AutoDock 軟件并運(yùn)用Grid模塊設(shè)置蛋白原配體為對(duì)接盒子中心，其格點(diǎn)盒子大小設(shè)定為40×40×40，并對(duì)配體小分子可能發(fā)生作用的區(qū)域進(jìn)行設(shè)定，利用AutoDock Vina 分子模擬軟件對(duì)藥物小分子和靶蛋白受體進(jìn)行分子對(duì)接分析。

結(jié)果

1 半夏瀉心湯有效成分及相關(guān)靶點(diǎn)的篩選

通過(guò)TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索半夏瀉心湯中7 種中藥的化合物數(shù)據(jù)及對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)，以O(shè)B ≥30% 和DL ≥0.18 為篩選條件，所得化合物中半夏12 個(gè)、黃連 11 個(gè)、黃芩31 個(gè)、干姜5 個(gè)、甘草88 個(gè)、人參17 個(gè)、大棗19 個(gè)。將所得化合物去重后共得到148 個(gè)化合物。將所得靶點(diǎn)去重后共得到95 個(gè)靶點(diǎn)。

2 構(gòu)建半夏瀉心湯藥材-有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

將2.1 中數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 中，繪制半夏瀉心湯-胃食管反流病網(wǎng)絡(luò)圖（圖1），該網(wǎng)絡(luò)圖中共包括148 個(gè)有效成分節(jié)點(diǎn)和95 個(gè)靶基因節(jié)點(diǎn)，共243 個(gè)節(jié)點(diǎn)，見(jiàn)圖1。

圖1 半夏瀉心湯藥材-有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

3 半夏瀉心湯靶點(diǎn)與GERD 靶點(diǎn)交集分析

合并去重得到GERD 靶點(diǎn)1257 個(gè)，將藥材與疾病靶點(diǎn)映射后，共得到靶點(diǎn)93 個(gè)，見(jiàn)圖2。

圖2 半夏瀉心湯與胃食管反流病共同靶點(diǎn)韋恩圖

4 構(gòu)建交集靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)

利用STRING 平臺(tái)，對(duì)交集靶點(diǎn)構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖3。通過(guò) Cytoscape3.8.2 插件 CytoNCA 對(duì)共有靶點(diǎn)進(jìn)行拓?fù)浞治?，根?jù)degree 值大小篩選前27 位關(guān)鍵靶點(diǎn)，進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建得到圖4 所示網(wǎng)絡(luò)，并最終提取10 個(gè)關(guān)鍵的靶點(diǎn)（圖4 黃色標(biāo)記部分）。

圖3 交集靶點(diǎn)蛋白網(wǎng)絡(luò)互作圖

圖4 關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白網(wǎng)絡(luò)互作圖

5 GO 富集分析

通過(guò) UniProt 工具將關(guān)鍵靶點(diǎn)的名稱(chēng)轉(zhuǎn)為對(duì)應(yīng)的Entrez ID，利用R 語(yǔ)言中的“ClusterProfiler”等程序包進(jìn)行GO 富集分析，根據(jù)基因富集數(shù)目與顯著程度，篩選排名前30，通過(guò)R 語(yǔ)言包繪制GO 功能注釋條圖及氣泡圖進(jìn)行可視化處理，見(jiàn)圖5、圖6。對(duì)靶點(diǎn)的GO 富集分析結(jié)果顯示：這些靶點(diǎn)富集在生物過(guò)程中顯著的條目有對(duì)金屬離子響應(yīng)、對(duì)藥物響應(yīng)、對(duì)脂多糖的響應(yīng)、對(duì)輻射的響應(yīng)、細(xì)胞對(duì)化學(xué)壓力的響應(yīng)、對(duì)營(yíng)養(yǎng)水平的響應(yīng)、對(duì)細(xì)胞外刺激的響應(yīng)等生物學(xué)過(guò)程。

圖5 GO 功能注釋條圖

圖6 半夏瀉心湯治療GERD 的核心靶點(diǎn) GO 基因功能富集分析氣泡圖

6 關(guān)鍵靶點(diǎn)的KEGG 通路分析

采用計(jì)算機(jī)R 語(yǔ)言中"colorspace""stringi""DOS E""clusterProfiler""pathview""clusterProfiler" 等程序包，篩選排名靠前的20 條通路，得到KEGG 注釋條圖（圖7）、氣泡圖（圖8）。通路富集分析結(jié)果顯示主要涉及脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病并發(fā)癥、流體剪切應(yīng)激、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染的年齡、AGERAGE 信號(hào)通路、膀胱癌、內(nèi)分泌抵抗性丙型肝炎、胰腺癌和前列腺癌、人類(lèi)巨細(xì)胞病毒感染、癌癥相關(guān)蛋白聚糖、IL-17 信號(hào)通路、結(jié)直腸癌、腫瘤壞死因子信號(hào)通路、麻疹、肝癌、非小細(xì)胞肺癌、子宮內(nèi)膜癌、弓形體病等。

圖7 KEGG 功能注釋條圖

圖8 半夏瀉心湯治療GERD 的核心靶點(diǎn)KEGG 基因功能富集分析氣泡圖

7 分子對(duì)接文件準(zhǔn)備

通過(guò)Pubchem 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲得小分子配體2D 結(jié)構(gòu)，再通過(guò)ChemOffice 軟件將2D 結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換為3D，為文件1。通過(guò)PDB（http：//www.rcsb.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)下載蛋白受體，使用PyMol 軟件刪除蛋白受體的水分子和小分子配體，獲得文件2。將文件1 和文件2 轉(zhuǎn)化為PDBQT 格式并確定活性口袋，獲得活性口袋相關(guān)信息。

8 分子對(duì)接結(jié)果

通 過(guò)Cytoscape3.8.2 插 件 CytoNCA 對(duì) 共 有 靶點(diǎn)進(jìn)行拓?fù)浞治?，根?jù)過(guò)濾值BC＞59.68258267、CC＞0.426470588、DC＞20、EC＞0.065383181、LAC＞10.65、NC＞12.307222905 篩 選 出 最 終10 個(gè)核心基因，將10 個(gè)核心基因EGFR、TP53、STAT3、MAPK3、RELA、MAPK14、JUN、AKT1、CTNNB1、CASP3 與其相對(duì)應(yīng)的小分子配體槲皮素、柚皮素、β-胡蘿卜素、甘草查耳酮A、3’-甲氧基光甘草定、漢黃芩素、黃芩黃素等通過(guò)vina 軟件進(jìn)行分子對(duì)接分析，結(jié)果為圖9。每個(gè)基因相對(duì)相應(yīng)的最低結(jié)合能分 別 為：-8.5kcal/mol、-8.5kcal/mol、-8.0kcal/mol、-8.3kcal/mol、-9.6kcal/mol、-7.6kcal/mol、-8.7kcal/mol、-8.6kcal/mol、-10.0kcal/mol、-8.4kcal/mol，其 中CTNNB1 的對(duì)接分值最低，結(jié)合最穩(wěn)定。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，結(jié)合能小于-5.0 kcal/mol 是分子對(duì)接時(shí)配體和受體穩(wěn)定結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合能越低分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性越高[11]。分子對(duì)接結(jié)果顯示，核心成分與核心蛋白的結(jié)合能均小于-8kcal·mol-1，構(gòu)象穩(wěn)定，能形成穩(wěn)定的氫鍵和疏水作用。說(shuō)明核心成分能與核心蛋白結(jié)合起效，并通過(guò)激活或抑制核心蛋白的相關(guān)通路，從而達(dá)到治療胃食管反流病的作用。

圖9 分子對(duì)接三維圖（ 處為分子對(duì)接位置 ）

討論

典型和常見(jiàn)的GERD 癥狀為燒心和反流，其他少見(jiàn)或不典型的相關(guān)癥狀包括上腹痛、上腹不適、胸痛、噯氣、腹脹、咽部異物感、吞咽痛、吞咽困難等，此外還有食管外癥狀，如慢性咳嗽、咽喉炎、哮喘等[12]。GERD的病位主要在食管與胃，與肝膽脾肺密切相關(guān)，病性有虛有實(shí)，虛主要是脾胃虛損，實(shí)主要是為氣郁、食滯及痰凝，胃有失和降，氣逆于上，脾胃功能失職，以至水谷不化、水濕不運(yùn)，聚而為痰為飲，痰飲阻肺，導(dǎo)致肺的宣發(fā)肅降失常，同時(shí)肝膽氣機(jī)疏泄失常，肝膽郁熱而犯胃是GERD 的主要病因病機(jī)[13]。半夏瀉心湯乃張仲景治療寒熱錯(cuò)雜之良方，以寒熱共伍、攻補(bǔ)兼施、苦辛并進(jìn)、陰陽(yáng)并調(diào)為組方特點(diǎn)。現(xiàn)代研究表明該方具有增強(qiáng)胃動(dòng)力、雙向調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動(dòng)、保護(hù)消化道黏膜、提高機(jī)體免疫力等多種功能[14]，半夏瀉心湯中用半夏散結(jié)除痞，又善降逆止嘔為君藥，臣以干姜之辛熱以溫中散寒，黃芩、黃連之苦寒以泄熱開(kāi)痞[15]。以上四味相伍，具有寒熱平調(diào)、辛開(kāi)苦降之用，然寒熱錯(cuò)雜，又緣于中虛失運(yùn)，故方中又以人參、大棗甘溫益氣，以補(bǔ)脾虛，為佐藥，使以甘草補(bǔ)脾和中而調(diào)諸藥[15]。契合胃食管反流病主要病機(jī)證候。

目前胃食管反流病的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，尚未完全明確，本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)聯(lián)合分子對(duì)接方法，構(gòu)建了藥材-有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)、靶點(diǎn)蛋白 PPI 網(wǎng)絡(luò)、藥材-成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)，對(duì)半夏瀉心湯治療胃食管反流病的分子機(jī)制進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，為半夏瀉心湯的后續(xù)深入研究提供科學(xué)依據(jù)。本研究結(jié)果顯示槲皮素（quercetin）、柚皮素（naringenin）、甘草查耳酮A（licochalcone a）、3’-甲氧基光甘草定（3'-Methoxyglabridin）、漢黃芩素（wogonin）、黃芩苷（baicalein）、β-胡蘿卜素（beta-carotene）等為半夏瀉心湯方主要活性成分。基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)槲皮素因具有廣泛的藥理學(xué)作用，現(xiàn)在受到了越來(lái)越廣泛的關(guān)注，它是一種天然的黃酮類(lèi)化合物，其優(yōu)勢(shì)是具有多靶點(diǎn)作用和綜合治療優(yōu)勢(shì)的一個(gè)中藥單體[16]。柚皮素抑制 FaDu 細(xì)胞增殖、侵襲可能與 ZFP36 蛋白表達(dá)上調(diào)有關(guān)，提示ZFP36 可能是一種新型柚皮素靶點(diǎn)，ZFP36 參與多種腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著重要的生物學(xué)作用[17]。甘草查耳酮A 具有廣泛的抗炎、抗氧化、抗腫瘤等活性，且甘草價(jià)格低廉含量豐富，具有廣闊的應(yīng)用前景[18]。已經(jīng)有研究表明，甘草查爾酮A 在小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、鼻咽癌等諸多癌癥中具有明顯抑制腫瘤細(xì)胞活性及腫瘤組織生長(zhǎng)的作用[19-21]。有研究表明，漢黃芩素可顯著抑制類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維滑膜細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡，并可顯著下調(diào)炎癥因子IL-6 水平[22]。黃芩苷是黃芩的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，也是黃芩質(zhì)量控制的主要植物化學(xué)標(biāo)志，具有抗病毒、抗菌、抗過(guò)敏、抗腫瘤、保肝、利膽、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用，尤以抗真菌、細(xì)菌作用最為顯著[23]。

PPI 網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析顯示，EGFR、TP53、STAT3、RELA、AKT1 等為半夏瀉心湯治療GERD 的潛在作用關(guān)鍵靶點(diǎn)。EGFR 是上皮生長(zhǎng)因子細(xì)胞增殖和信號(hào)傳導(dǎo)的酪氨酸激酶型受體，屬于ErbB 受體家族的一種，EGFR 在部分腫瘤細(xì)胞中呈過(guò)表達(dá)，與腫瘤細(xì)胞的增殖、血管生成、腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及細(xì)胞凋亡的抑制有關(guān)[24]。Dong 等研究發(fā)現(xiàn)肺腺癌中突變頻率較高的KRAS聯(lián)合TP53 共突變可以預(yù)測(cè)腫瘤免疫治療療效[25]。STAT3 信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)參與凋亡及炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要通路，能被多種代謝產(chǎn)物激活，引起炎癥因子表達(dá)增多，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[26]。該蛋白質(zhì)屬于NF-κB 通路中樞信號(hào)復(fù)合物的一部分，NF-κB 通路在機(jī)體炎癥的發(fā)生、自身免疫過(guò)程以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[27]。AKT1 信號(hào)通路參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移，在胃癌的癌變過(guò)程中起著重要作用，并有研究證明，干擾AKT1 表達(dá)能抑制胃腺癌細(xì)胞增殖、遷移等行為[28-29]。

GO 與KEGG 分析結(jié)果顯示，半夏瀉心湯可能通過(guò)干預(yù)對(duì)金屬離子響應(yīng)、對(duì)脂多糖的響應(yīng)、脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病并發(fā)癥、流體剪切應(yīng)激、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒、AGE-RAGE 信號(hào)通路、膀胱癌、內(nèi)分泌抵抗性丙型肝炎、胰腺癌和前列腺癌、人類(lèi)巨細(xì)胞病毒感染、癌癥相關(guān)蛋白聚糖、IL-17 信號(hào)通路等來(lái)治療GERD。AGE-RAGE 信號(hào)通路介導(dǎo)了多種細(xì)胞的損傷過(guò)程[30]。IL-17 信號(hào)通路是促炎的細(xì)胞因子，可引起核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號(hào)通路激活，引起下游效應(yīng)因子轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞增殖，血管生成，參與機(jī)體的炎性反應(yīng)[31]。

分子對(duì)接結(jié)果顯示，核心成分與核心蛋白的結(jié)合能均小于-8kcal·mol-1，構(gòu)象穩(wěn)定，能形成穩(wěn)定的氫鍵和疏水作用。說(shuō)明核心成分能與核心蛋白結(jié)合起效，并通過(guò)激活或抑制核心蛋白的相關(guān)通路，從而達(dá)到治療胃食管反流病的作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)半夏瀉心湯有效成分可能通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡、減輕炎性反應(yīng)、減少細(xì)胞增殖、遷移、抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、促進(jìn)血管新生等作用，從而達(dá)到治療胃食管反流病的效果，其機(jī)制可能與AGERAGE 信號(hào)通路、IL-17 信號(hào)通路等通路有關(guān)。但要注意的是本研究仍存在許多不足之處，比如使用的數(shù)據(jù)庫(kù)不全面，篩選策合理性有待提升，未考慮煎煮后中藥活性成分的改變，易忽視其他可能發(fā)揮潛在作用的活性成分。因此本次研究只是初步預(yù)測(cè)了半夏瀉心湯的作用機(jī)制，為基礎(chǔ)研究與臨床提供一個(gè)方向，后續(xù)還需要進(jìn)一步的相關(guān)研究加以驗(yàn)證。