蘇天琳，王中會，晁 旭，樊瑩瑩，黃 峰，楊兵社，

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，陜西 西安 712046;2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，陜西 西安 712046;3.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院科研科，陜西 咸陽 712000；4.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院超聲科，陜西 咸陽 712000)

世界衛(wèi)生組織 (World Health Organization，WHO) 2019年報告顯示，癌癥是世界上絕大多數(shù)國家居民70歲前死亡的第一大原因[1]。根據(jù)2020年全球185個國家的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，原發(fā)性肝癌的發(fā)病率和病死率分別位居第6位和第3位，其中肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)占原發(fā)性肝癌的75%～85%[2]。HCC動物模型可以更好地幫助人們了解HCC的病理機制及其治療藥物的藥理機制[3]。目前，HCC的動物建模方法主要包括化學(xué)誘導(dǎo)模型、植入模型(同基因和異種移植模型)、病毒模型、遺傳模型等。其中化學(xué)誘導(dǎo)劑二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine，DEN)主要是通過使脫氧核苷酸烷基化以及活性氧的形成誘發(fā)HCC[4-6]，這種造模方式具有技術(shù)簡單、發(fā)病機制和臨床病理接近人類 HCC演變過程的特點，且具有癌細胞分化程度較低、造模成功率高的優(yōu)點[7-8]。目前，國內(nèi)外文獻中DEN誘導(dǎo)HCC多采用單一劑量給藥法，其動物死亡率為33.3%～62.1%[9-13]，較高的死亡率難以保證后續(xù)實驗的樣本數(shù)量。研究發(fā)現(xiàn)，約97.22%的HCC動物造模以病理切片蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE) 染色作為評估標準，2.78%的HCC動物造模以實體瘤組織形成作為評估標準[14]。但前者進一步損失了實驗的樣本量，且無法全面了解所有樣本的造模情況；后者僅憑瘤體生成作為造模成功標志，缺乏嚴謹?shù)脑\斷依據(jù)。基于此，本研究采用根據(jù)動物體質(zhì)量變化動態(tài)調(diào)整DEN劑量的方法誘導(dǎo)HCC，并采用常規(guī)超聲聯(lián)合甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)評估造模結(jié)果，以期為減少建立HCC動物模型過程中和評估造模結(jié)果中的損失動物樣本量提供實驗方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物無特定病原體級Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠175只，購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心(許可證號：2008-001)，體質(zhì)量120～130(124.4±3.0) g，飼養(yǎng)于陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院動物實驗室，室溫20～22 ℃，相對濕度40%～70%，自由飲食飲水；每周對大鼠進行稱重、記錄。本研究獲得陜西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會審核批準(編號：SUCMDL20210810001)。

1.2 主要試劑與儀器大鼠肝癌化學(xué)誘導(dǎo)劑DEN購自TCL科技集團股份有限公司，AFP酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒購自上海茁彩生物科技有限公司，40 g·L-1多聚甲醛購自武漢博士德生物工程有限公司，HE染色試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司；TM-STC30001電子天平(精度0.1 g)購自南京湯姆斯衡器有限公司，M7 Series型便攜式彩色多普勒超聲診斷儀購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司(線陣探頭，頻率9.0 MHz)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組和造模將SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機分為空白對照組(n=8)、對照組(n=69)和模型組(n=98)。對照組大鼠給予單一劑量DEN(50 mg·kg-1)腹腔注射。模型組大鼠給予改良DEN給藥法誘導(dǎo)大鼠HCC，即根據(jù)體質(zhì)量變化動態(tài)調(diào)整DEN給藥劑量：初始用藥劑量為50 mg·kg-1，然后每周根據(jù)體質(zhì)量變化調(diào)整給藥劑量：若大鼠體質(zhì)量未見下降或下降幅度小于每周5 g時，按50 mg·kg-1的劑量給藥；若每周大鼠體質(zhì)量下降5～20 g，則按25 mg·kg-1劑量給藥；若大鼠體質(zhì)量下降超過每周20 g，則暫停給藥1周?？瞻讓φ战M大鼠腹腔注射等量生理鹽水。第1～4周每周給藥2次，第5～15周每周給藥1次，連續(xù)給藥15周。如果造模過程中大鼠死亡，對其進行解剖并行肝臟病理組織切片。

1.3.2 大鼠肝臟超聲檢查給藥15周后，對存活大鼠行常規(guī)超聲成像：胸腹部剃毛建立超聲窗，100 g·L-1水合氯醛(0.3 mL·100 g-1)腹腔注射麻醉，用高頻線陣超聲探頭對大鼠行上腹部肝臟超聲探查，觀察肝實質(zhì)及肝包膜回聲、肝內(nèi)有無結(jié)節(jié)及結(jié)節(jié)數(shù)目、大小、回聲、血流信號等，采集并存儲圖像。

1.3.4 肝臟大體和組織病理形態(tài)觀察造模結(jié)束后，隨機抽取空白對照組(7只)、對照組(14只)、模型組(14只)存活大鼠，禁食12 h，將稀釋好的水合氯醛(劑量為 3 g·kg-1)腹腔注射麻醉后頸椎脫臼處死大鼠，剖開大鼠腹腔剝離肝臟并稱重，計算肝臟指數(shù)，肝臟指數(shù)=肝濕重(g)/體質(zhì)量(g)×100%。觀察肝臟大體形態(tài)學(xué)變化，若肝實質(zhì)有癌結(jié)節(jié)，則切取癌結(jié)節(jié)及癌結(jié)節(jié)邊緣的癌旁組織，大小約0.8 cm×0.8 cm×0.3 cm，置于40 g·L-1多聚甲醛固定液中固定 48 h；若無癌結(jié)節(jié)，則在肝右葉恒定部位切取組織并固定；所有肝臟組織標本常規(guī)固定34 h后置于脫水機中進行梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。使用切片機將組織蠟塊切成4.0 μm厚的切片，水浴鍋中攤平切片并平貼于載玻片，烘干后再梯度脫水，行HE染色，中性樹膠封片，光鏡下觀察并拍照。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠死亡率比較造模期間，空白對照組大鼠無死亡，死亡率為0.0%(0/8)；對照組大鼠死亡24例，死亡率為34.8%(24/69)；模型組大鼠死亡19例，死亡率為19.4%(19/98)。對照組大鼠死亡率顯著高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.043，P<0.05)；模型組與空白對照組大鼠死亡率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.890，P>0.05)；模型組大鼠死亡率顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.019，P<0.05)。對照組和模型組大鼠死亡都分為2個階段：第1階段死亡大鼠解剖未見肝臟癌結(jié)節(jié)，可見腸管脹氣及腹腔少量淡黃色液體，死因是藥物的急性不良反應(yīng)；第2階段死亡大鼠解剖均見肝臟彌漫結(jié)節(jié)伴有腹腔出血，死因是肝硬化或肝癌并發(fā)腹腔出血。

2.2 3組大鼠肝臟超聲檢查結(jié)果比較不同病理變化肝臟超聲檢查結(jié)果見圖1?？瞻讓φ战M大鼠均未見癌結(jié)節(jié)或肝硬化表現(xiàn)，超聲影像正常。對照組30只、模型組48只大鼠肝臟可見癌結(jié)節(jié)，癌結(jié)節(jié)超聲檢出率分別為66.7%(30/45)、60.8%(48/79)；對照組與模型組大鼠的肝臟癌結(jié)節(jié)超聲檢出率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.278，P>0.05)。 將對照組與模型組大鼠按肝臟癌結(jié)節(jié)形狀區(qū)分：圓形或類圓形71只，不規(guī)則形7只；按癌結(jié)節(jié)回聲區(qū)分：高回聲1只，等回聲2只，低回聲75只；按癌結(jié)節(jié)數(shù)量區(qū)分：單個癌結(jié)節(jié)32只，多個癌結(jié)節(jié)46只；按癌結(jié)節(jié)內(nèi)是否觀察到血流信號區(qū)分：可見血流信號5只，未見血流信號73只；按癌結(jié)節(jié)與正常組織邊界是否清晰區(qū)分：邊界清52只，邊界欠清26只。測量大鼠肝臟癌結(jié)節(jié)的直徑為2.5～17.2 mm。對照組4只、模型組7只大鼠可見肝臟回聲光點變粗，包膜不光滑，呈肝硬化表現(xiàn)。對照組11只、模型組24只大鼠肝臟未見明顯異常。

A：肝臟低回聲結(jié)節(jié)CDFI未見血流信號；B：肝臟多發(fā)低回聲結(jié)節(jié)；C：肝臟光點變粗，包膜凹凸不平；D：正常肝臟體積較小，光點細膩。

2.3 3組大鼠血清AFP水平比較空白對照組、對照組、模型組大鼠血清AFP水平分別為(0.905±0.143)、(1.633±0.525)、(1.675±0.583)μg·L-1。對照組與模型組大鼠血清AFP水平顯著高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.728、0.771，P<0.05)；對照組與模型組大鼠血清AFP水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.043，P>0.05)。

2.4 超聲、血清AFP單獨與聯(lián)合檢測對肝臟癌結(jié)節(jié)診斷敏感度比較對照組和模型組共124只存活大鼠行肝臟超聲檢查，其中78只大鼠檢出肝臟癌結(jié)節(jié)，超聲對肝臟癌結(jié)節(jié)診斷的敏感度為62.9%(78/124)。棄除血清溶血大鼠，對照組、模型組共86只大鼠進行血清AFP水平檢測，將AFP水平轉(zhuǎn)化為二分類資料后，其中AFP陽性50只，陰性36只，血清AFP對肝臟癌結(jié)節(jié)診斷的敏感度為58.1%(50/86)。86只具有血清AFP值大鼠中，超聲陽性且AFP陽性37只，超聲陽性且AFP陰性23只，超聲陰性且AFP陽性13只，超聲陰性且AFP陰性13只；血清AFP聯(lián)合超聲檢查對肝臟癌結(jié)節(jié)診斷的敏感度為87.2% (73/86)。超聲與血清AFP對肝臟癌結(jié)節(jié)診斷的敏感度比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.014，P>0.05)；血清AFP聯(lián)合超聲檢查對肝臟癌結(jié)節(jié)診斷的敏感度顯著高于超聲和血清AFP單獨檢測，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=35.342、21.271，P<0.05)。

2.5 3組大鼠肝臟大體觀及肝臟指數(shù)比較結(jié)果見圖2和表1?？瞻讓φ战M大鼠肝臟均表面光滑，顏色紅潤細膩，未見癌結(jié)節(jié)；對照組與模型組大鼠肝臟增大、質(zhì)地變硬，癌結(jié)節(jié)呈大小不等彌漫性分布，部分癌結(jié)節(jié)伴出血壞死。對照組與模型組大鼠體質(zhì)量顯著低于空白對照組，肝質(zhì)量、肝臟指數(shù)顯著高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；對照組與模型組大鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量、肝臟指數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

A：正常大鼠肝臟；B：HCC大鼠肝臟。

表1 3組大鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量及肝臟指數(shù)比較

2.6 3組大鼠肝臟病理學(xué)改變結(jié)果見圖3。空白對照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細胞索排列整齊，細胞核明顯，未見水腫及炎癥細胞浸潤；對照組和模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)不完整，出現(xiàn)假小葉，癌細胞排列成巢狀，可見纖維組織增生，部分區(qū)域可見局灶性的細胞壞死，癌細胞核大、深染，偶見雙核或多核，具有明顯的細胞異形性，部分腫瘤細胞侵犯血管。隨機抽取的對照組和模型組各14只大鼠均形成HCC癌結(jié)節(jié)，2組大鼠的成瘤率均為100.0%。

A：正常肝組織(×200)；B：正常肝組織(×400)；C：HCC肝組織(×200)；D:HCC肝組織(×400)。

3 討論

HCC是一種發(fā)病率與病死率較高的惡性腫瘤，且預(yù)計HCC的發(fā)病率會逐年增加[15-16]。HCC的病因多與肝炎病毒感染、酒精性肝病以及化學(xué)致癌物暴露相關(guān)[17]。在我國，HCC患者的5 a生存率僅為12.5%[18]，因此，尋求針對HCC新的診療手段迫在眉睫。DEN是HCC動物造模中經(jīng)典的化學(xué)誘導(dǎo)劑，其通過刺激細胞外基質(zhì)，導(dǎo)致纖維組織增生，并誘導(dǎo)細胞內(nèi)自由基的形成而引起氧化應(yīng)激，導(dǎo)致肝細胞損傷甚至壞死，從而誘發(fā)HCC。這種誘導(dǎo)方式的優(yōu)點與臨床發(fā)病過程較為相似，都經(jīng)歷肝炎-肝硬化-肝癌3個過程[6-7,19]。目前，國內(nèi)外文獻中DEN誘導(dǎo)HCC造模多使用單一劑量給藥法，其成瘤率高、方法簡便易行，但死亡率較高[9-13,20-21]。因此，本研究根據(jù)大鼠的體質(zhì)量變化，評估大鼠對DEN毒性和肝臟病變的耐受情況，動態(tài)調(diào)整給藥劑量，盡可能在大鼠的耐受范圍內(nèi)建立HCC模型。本研究結(jié)果顯示，對照組大鼠死亡率為34.8%，模型組大鼠死亡率為19.4%，模型組大鼠死亡率顯著低于對照組；且隨機抽取對照組和模型組各14只大鼠行肝臟大體形態(tài)學(xué)檢查，結(jié)果顯示，對照組與模型組大鼠肝臟增大、質(zhì)地變硬，結(jié)節(jié)大小不等彌漫性分布，部分結(jié)節(jié)伴出血壞死。肝臟病理學(xué)檢查結(jié)果顯示，對照組和模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)不完整，出現(xiàn)假小葉，癌細胞排列成巢狀，可見纖維組織增生，部分區(qū)域可見局灶性的細胞壞死，癌細胞核大、深染，偶見雙核或多核，具有明顯的細胞異形性，部分腫瘤細胞侵犯血管。對照組與模型組大鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量、肝臟指數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，2組大鼠的HCC成瘤率均為100.0%。以上結(jié)果說明，根據(jù)體質(zhì)量動態(tài)調(diào)整DEN給藥劑量，可在保證HCC成瘤率的基礎(chǔ)上降低造模大鼠的死亡率，保證了后續(xù)實驗的樣本數(shù)量。

2022版原發(fā)肝癌的診療指南指出，超聲顯像具有便捷、實時、無創(chuàng)和無放射輻射等優(yōu)勢，是臨床上最常用的肝臟影像學(xué)檢查方法[22]。血清AFP是當前診斷肝癌和肝癌療效監(jiān)測常用且重要的指標。臨床常將AFP聯(lián)合超聲作為HCC高危人群篩查與檢測的指標，但在動物實驗中，將其作為HCC模型評估標準較少。目前，評估動物造模多采用隨機抽樣進行病理切片作為金標準[14]，這損失了實驗動物的數(shù)量，減少了后續(xù)實驗的樣本量，且無法全面了解所有樣本的個體情況。因此，本研究比較了超聲、血清AFP單獨與聯(lián)合檢測評估HCC造模成功的敏感性，結(jié)果顯示，超聲、血清AFP、超聲聯(lián)合血清AFP對肝臟癌結(jié)節(jié)診斷的敏感度分別為62.9%(78/124)、58.1%(50/86)、87.2%(73/86)，超聲與血清AFP對肝臟癌結(jié)節(jié)診斷的敏感度比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，超聲聯(lián)合血清AFP檢測對肝臟癌結(jié)節(jié)診斷的敏感度顯著高于超聲和血清AFP單獨檢測，說明超聲和血清AFP評估大鼠HCC造模情況均具有一定價值，且超聲聯(lián)合血清AFP檢測對大鼠HCC模型評估價值更高。同時，本研究結(jié)果顯示，HCC大鼠超聲成像情況與臨床小肝癌成像情況大致相符，病灶以圓形、類圓形低回聲病灶為主，邊界清晰。臨床研究表明，單獨應(yīng)用AFP具有高特異性和低靈敏性的特征，但AFP聯(lián)合肝臟超聲檢查可以明顯提高檢出率，降低假陽性率[3]。一篇納入373項臨床研究的最新文獻表明，單獨采用AFP作為檢測指標(以20 μg·L-1為臨界值)的敏感度為 60.0%，單獨采用肝臟超聲作為檢測指標的敏感度為72.0%，AFP聯(lián)合超聲作為檢測指標的敏感度為96.0%[24]。本研究中單獨使用AFP的敏感度接近臨床數(shù)值，符合AFP靈敏度低的特點；單獨使用超聲的敏感度和血清AFP聯(lián)合超聲的敏感度均比臨床數(shù)據(jù)略低；究其原因，可能是由于相較人HCC病灶，大鼠HCC病灶體積較小，更易出現(xiàn)假陰性。但總體而言，血清AFP聯(lián)合超聲檢測具有微創(chuàng)、成本低、檢查時間短、可重復(fù)操作和動態(tài)觀察等優(yōu)點，適用于期望減少樣本量損失、需了解全部樣本造模情況或后續(xù)實驗中需對造模動物進行連續(xù)、動態(tài)觀察的實驗研究，是比較理想的動物HCC造模評估方式。

綜上所述，在HCC大鼠建模中，采取根據(jù)大鼠體質(zhì)量變化動態(tài)調(diào)整DEN給藥劑量的方式，能夠在保證成瘤率的前提下有效提高大鼠存活率；采用肝臟超聲聯(lián)合AFP檢測評估造模結(jié)果，具有敏感度高，無需處死動物，可了解全部樣本的個體情況并在后續(xù)實驗中持續(xù)、動態(tài)觀察的優(yōu)點，從而有效減少造模的成本。