張 宇，劉雪濤

(河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，河南 鄭州 450000)

Toll樣受體(toll-like receptor，TLR)3是TLR家族成員，可參與識別病毒雙鏈RNA(double-strand RNA,dsRNA)[1-2]，在人和小鼠的抗病毒感染過程中發(fā)揮著重要作用[3]。WANG等[4]研究了TLR3在西尼羅河病毒感染中的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TLR3基因缺陷型小鼠外周血中病毒的拷貝數(shù)高于野生型小鼠，而神經(jīng)中樞中病毒的拷貝數(shù)低于野生型小鼠，其機(jī)制可能為野生型小鼠中西尼羅河病毒通過刺激TLR3誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，破壞血腦屏障，從而促進(jìn)病毒進(jìn)入神經(jīng)中樞。TLR3可損傷血管內(nèi)皮[5-6]，且dsRNA可以誘導(dǎo)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生凋亡[7]，但機(jī)制尚未明確。聚肌胞苷酸[polyriboinosinic:polyribocytidylic acid，Poly (I:C)]是雙鏈RNA的合成類似物，常用于模擬雙鏈RNA病毒對細(xì)胞的感染[8]。在哺乳動物中，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的途徑主要有外源性途徑和內(nèi)源性途徑，外源性途徑通過細(xì)胞外信號激活細(xì)胞內(nèi)的caspase，內(nèi)源性途徑通過線粒體釋放凋亡酶激活因子激活caspase，這些活化的caspase可將細(xì)胞內(nèi)的關(guān)鍵蛋白降解，從而引起細(xì)胞凋亡[9]。外源性細(xì)胞凋亡途徑的受體已經(jīng)明確的有CD95、腫瘤壞死因子受體1(tumor necrosis factor recepeor 1，TNFR1)、腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體受體 ( tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand recepeor，TRAILR) 1[也稱死亡受體(death receptor，DR)4]、TRAILR2(也稱DR5)，以上受體相應(yīng)的配體分別為CD95配體(CD95 ligand，CD95L)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α及腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)[10]。袁明明等[11]研究發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性肝細(xì)胞癌細(xì)胞中TLR3的表達(dá)與凋亡指數(shù)呈正相關(guān),與基質(zhì)金屬蛋白酶-2、微血管密度和內(nèi)皮干細(xì)胞數(shù)量呈負(fù)相關(guān)，提示TLR3參與原發(fā)性肝細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展。目前尚未明確TLR3對血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制?；诖?，本研究使用Poly (I:C)活化TLR3，探討TLR3活化對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)凋亡的影響及其細(xì)胞外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機(jī)制，以期為臨床預(yù)防和治療病毒感染所致血管內(nèi)皮損傷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑與儀器HUVECs由中南大學(xué)腫瘤研究所腫瘤免疫生物實(shí)驗(yàn)室提供。達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbeco′s modified Eagle medium，DMEM)、新生小牛血清購自福州?？寺∩镏破酚邢薰荆鹊鞍酌?、Poly(I:C)購自美國InvivoGen公司，鼠抗人TLR3抗體購自荷蘭Hycult Biotechnology公司、鼠抗人caspase-3抗體購自美國Cell Signaling公司，辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的羊抗鼠抗體購自美國KPL公司，鼠抗人β-actin抗體購自深圳晶美生物工程有限公司，RNA提取試劑盒及TRIzol試劑購自美國賽默飛世爾科技公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自加拿大Fermentas公司，Western blot相關(guān)試劑均購自上海碧云天生物技術(shù)研究所，電化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence,ECL)試劑盒購自美國Pierce公司；反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)儀購自德國Eppendorf公司，紫外凝膠成像系統(tǒng)購自美國Pharmacia公司。本研究所用引物均由上海博尚生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)HUVECs培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%新生小牛血清、100 kU·L-1青霉素、100 kU·L-1鏈霉素和100 kU·L-1慶大霉素的DMEM中，于37 ℃、飽和濕度、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中無菌培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞分組及處理取對數(shù)生長期的 HUVECs 接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔1.0×106個細(xì)胞，隨機(jī)分為A組、B組、C組、D組、E組和F組，分別用含終濃度0.000、0.001、0.010、0.100、1.000、10.000 mg·L-1Poly(I:C)培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h備用。

1.2.3 Western blot法檢測6組HUVECs中TLR3及pro-caspase-3、caspase-3 P17蛋白相對表達(dá)量取6組6孔板中梯度濃度Poly(I:C)培養(yǎng)24 h的細(xì)胞，吸去培養(yǎng)液，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖溶液洗滌3次；每孔加入100 μL細(xì)胞裂解液冰上裂解30 min；簡短脈沖式超聲7～8次，每次2～3 s；將所有蛋白收集于EP管中，100 ℃煮沸5 min，冰上冷卻后，4 ℃ 10 000×g離心10 min，取上清液至另一EP管內(nèi)，置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。?0 μL蛋白樣品，使用聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳后將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入鼠抗人TLR3一抗(滴度1500)及鼠抗人caspase-3一抗(滴度1400)，4 ℃孵育過夜；使用Tris緩沖生理鹽水(Tris-buffered saline and tween-20，PBST)于側(cè)擺搖床上緩慢搖動洗滌3次，每次 5～10 min。 加入HRP標(biāo)記的二抗(滴度11 000)，室溫孵育1 h，使用PBST洗滌3次，每次 5～10 min。使用ECL試劑顯色，應(yīng)用紫外凝膠成像系統(tǒng)拍照,Image J軟件分析各條帶灰度值，以目的蛋白灰度值與內(nèi)參β-actin灰度值的比值表示目的蛋白相對表達(dá)量，并計(jì)算caspase-3 P17與pro-caspase-3蛋白相對表達(dá)量比值(caspase-3 P17/pro-caspase-3)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.2.4 RT-PCR法檢測6組HUVECs中TRAIL、DR4和DR5 mRNA相對表達(dá)量收集6組梯度濃度Poly(I:C)培養(yǎng)24 h的細(xì)胞，根據(jù)RNA提取試劑盒說明書提取總RNA。取2 μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行操作。以cDNA為模板，配制20 μL反應(yīng)體系，于RT-PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系：2×PCR mix 10 μL，10 μmol·L-1上下游引物各1 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 7 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，68 ℃延伸1.5 min，30個循環(huán)；68 ℃再延伸10 min。 TRAIL上游引物序列為5′-TTCACAGTGCTCCTGCAGTCT-3′,下游引物序列為5′-AGTTTATTTTGCGGCCCAGA-3′；DR4上游引物序列為5′-CAATGGGAACATAGCCCTTTG-3′,下游引物序列為5′-AAACACACCCTGTCCATGCA-3′；DR5上游引物序列為5′-TCTGATCACCCAACAAGCCCT，下游引物序列為5′-ACAATCACCGACCTTGACCA-3′；內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)上游引物序列為5′-AATCCCATCACCATCTTCCA,下游引物序列為5′-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3′。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠攝像儀成像，應(yīng)用Image J 軟件分析各目的基因條帶灰度值，以目的基因條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH灰度值的比值表示目的基因mRNA相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

2 結(jié)果

2.1 6組HUVECs中TLR3及pro-caspase-3、caspase-3 P17蛋白相對表達(dá)量比較結(jié)果見表1、圖1和圖2。B組、C組、D組、E組、F組細(xì)胞中TLR3蛋白相對表達(dá)量顯著高于A組，C組、D組、E組、F組細(xì)胞中TLR3蛋白相對表達(dá)量顯著高于B組，D組細(xì)胞中TLR3蛋白相對表達(dá)量顯著高于C組，E組、F組細(xì)胞中TLR3蛋白相對表達(dá)量顯著低于D組，F(xiàn)組細(xì)胞中TLR3蛋白相對表達(dá)量顯著低于E組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

B組、C組細(xì)胞中caspase-3 P17/pro-caspase-3顯著低于A組，D組、E組、F組細(xì)胞中caspase-3 P17/pro-caspase-3顯著高于A組、B組、C組，F(xiàn)組細(xì)胞中caspase-3 P17/pro-caspase-3顯著低于D組、E組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 6組HUVECs中TLR3蛋白相對表達(dá)量及caspase-3 P17/pro-caspase-3比較

1：A組；2：B組；3：C組；4：D組；5：E組；6：F組。

1：A組；2：B組；3：C組；4：D組；5：E組；6：F組。

2.2 6組HUVECs中TRAIL、DR4、DR5 mRNA相對表達(dá)量比較結(jié)果見表2和圖3。B組、C組、D組、E組、F組細(xì)胞中TRAIL mRNA相對表達(dá)量顯著高于A組，C組、D組、E組、F組細(xì)胞中TRAIL mRNA相對表達(dá)量顯著高于B組，E組、F組細(xì)胞中TRAIL mRNA相對表達(dá)量顯著高于C組和D組，F(xiàn)組細(xì)胞中TRAIL mRNA相對表達(dá)量顯著低于E組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);C組與D組細(xì)胞中TRAIL mRNA相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

C組、D組、E組、F組細(xì)胞中DR4 mRNA相對表達(dá)量顯著高于A組和B組，D組、E組、F組細(xì)胞中DR4 mRNA相對表達(dá)量顯著高于C組，E組、F組細(xì)胞中DR4 mRNA相對表達(dá)量顯著高于D組，F(xiàn)組細(xì)胞中DR4 mRNA相對表達(dá)量顯著高于E組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；A組與B組細(xì)胞中DR4 mRNA相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

B組、C組、D組、E組、F組細(xì)胞中DR5 mRNA相對表達(dá)量顯著高于A組，B組、C組、D組細(xì)胞中DR5 mRNA相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；E組、F組細(xì)胞中DR5 mRNA相對表達(dá)量顯著高于B組、C組、D組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；E組與F組細(xì)胞中DR5 mRNA相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 6組HUVECs中TRAIL、DR4和DR5 mRNA相對表達(dá)量比較

1：A組；2：B組；3：C組；4：D組；5：E組；6：F組。

3 討論

TLR3主要表達(dá)于樹突狀細(xì)胞、吞噬細(xì)胞及自然殺傷細(xì)胞，參與機(jī)體天然免疫[12-13]。此外，TLR3還廣泛表達(dá)于神經(jīng)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及各種上皮細(xì)胞[14-16]。有研究顯示，TLR3相關(guān)通路活化后不僅可以促進(jìn)免疫相關(guān)細(xì)胞釋放大量的炎癥因子如TNF、白細(xì)胞介素、前列腺素、一氧化氮，引起炎癥反應(yīng),同時可造成神經(jīng)、循環(huán)、呼吸、消化等系統(tǒng)組織損傷[17]。有研究發(fā)現(xiàn)，Poly(I:C)活化TLR3可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞、非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡，其機(jī)制均涉及caspase-3[18-20]。Poly(I:C)活化TLR3還可抑制腎細(xì)胞癌細(xì)胞增殖[21]。除腫瘤方面，在非腫瘤方面也有不少TLR3與細(xì)胞凋亡的相關(guān)研究。劉葉等[22]研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)TLR3可上調(diào)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中miR-186-5p表達(dá)，從而抑制心肌細(xì)胞凋亡。朱祎婧等[23]研究發(fā)現(xiàn)，激活TLR3可通過β干擾素TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白-核因子-κB信號通路抑制胰島β細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而介導(dǎo)細(xì)胞損傷。由此可見,TLR3與細(xì)胞凋亡的相關(guān)研究受到廣泛關(guān)注，但TLR3涉及的相關(guān)凋亡機(jī)制目前尚未完全闡明。

TLR3在抗病毒感染中的作用是雙面的：一方面TLR3可通過天然免疫和獲得性免疫抑制病毒復(fù)制、促進(jìn)病毒清除[3-4]，另一方面TLR3可介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞和其他組織細(xì)胞凋亡、損傷，從而介導(dǎo)病毒擴(kuò)散[5-6]。因此,闡明TLR3誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，就有可能找到TLR3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中不影響免疫反應(yīng)但介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵信號分子，并以此分子為靶點(diǎn)，研究靶向抑制劑，使得在不影響免疫反應(yīng)的同時預(yù)防血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，從而抑制病毒擴(kuò)散，延緩疾病的發(fā)展。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，B組、C組、D組、E組、F組細(xì)胞中TLR3蛋白相對表達(dá)量顯著高于A組，C組、D組、E組、F組細(xì)胞中TLR3蛋白相對表達(dá)量顯著高于B組，D組細(xì)胞中TLR3蛋白相對表達(dá)量顯著高于C組，說明采用Poly(I:C)干預(yù)可活化HUVECs的TLR3表達(dá)，且TLR3表達(dá)量隨著Poly(I:C)干預(yù)濃度的升高呈上升趨勢。

Caspase 家族是一類獨(dú)特的半胱氨酸蛋白酶，是哺乳動物凋亡機(jī)制的基本組成部分，可作為細(xì)胞凋亡或程序性細(xì)胞死亡的效應(yīng)物，其中 caspase-3 是調(diào)控凋亡最關(guān)鍵的酶之一[24]。非活性狀態(tài)的pro-caspase-3和活性狀態(tài)的cleaved-caspase-3均存在于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)pro-caspase-3被剪切為 P17和P12亞基后，可產(chǎn)生活性[25]。本研究結(jié)果顯示，B組、C組細(xì)胞中caspase-3 P17/pro-caspase-3顯著低于A組，D組、E組、F組細(xì)胞中caspase-3 P17/pro-caspase-3顯著高于A組、B組、C組，F(xiàn)組細(xì)胞中caspase-3 P17/pro-caspase-3顯著低于D組、E組，說明隨著Poly(I：C)干預(yù)濃度的升高，TLR3表達(dá)的增加，caspase-3的活化呈升高趨勢，從而可促進(jìn)HUVECs凋亡。

本研究結(jié)果顯示，B組、C組、D組、E組、F組細(xì)胞中TRAIL mRNA相對表達(dá)量顯著高于A組，C組、D組、E組、F組細(xì)胞中TRAIL mRNA相對表達(dá)量顯著高于B組，E組、F組細(xì)胞中TRAIL mRNA相對表達(dá)量顯著高于C組和D組，F(xiàn)組細(xì)胞中TRAIL mRNA相對表達(dá)量顯著低于E組；C組、D組、E組、F組細(xì)胞中DR4 mRNA相對表達(dá)量顯著高于A組和B組，D組、E組、F組細(xì)胞中DR4 mRNA相對表達(dá)量顯著高于C組，E組、F組細(xì)胞中DR4 mRNA相對表達(dá)量顯著高于D組，F(xiàn)組細(xì)胞中DR4 mRNA相對表達(dá)量顯著高于E組；B組、C組、D組、E組、F組細(xì)胞中DR5 mRNA相對表達(dá)量顯著高于A組，E組、F組細(xì)胞中DR5 mRNA相對表達(dá)量顯著高于B組、C組、D組，說明隨著Poly(I:C)干預(yù)濃度的升高，TLR3表達(dá)升高可上調(diào)HUVECs中TRAIL、DR4、DR5 mRNA的表達(dá)，提示Poly(I:C)活化TLR3引起的HUVECs凋亡可能涉及外源性凋亡途徑TRAIL-DR4/DR5。

同時，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，E組、F組細(xì)胞中TLR3蛋白相對表達(dá)量顯著低于D組，F(xiàn)組細(xì)胞中TLR3蛋白相對表達(dá)量顯著低于E組；F組細(xì)胞中caspase-3 P17/pro-caspase-3顯著低于D組、E組；F組細(xì)胞中TRAIL mRNA相對表達(dá)量顯著低于E組，說明TLR3、caspase-3 P17/pro-caspase-3及TRAIL mRNA相對表達(dá)量在Poly(I:C)劑量增加到一定濃度時反而有所下降。分析其原因，可能是高劑量Poly(I:C)所致細(xì)胞凋亡數(shù)量的增多，使蛋白和mRNA的分解增多。另外，本研究中，caspase-3 P17/pro-caspase-3雖然整體是增高趨勢，但B組、C組細(xì)胞中caspase-3 P17/pro-caspase-3顯著低于A組，分析其原因可能是在Poly(I:C)濃度低時pro-caspase-3的合成速度大于裂解活化速度，但隨著Poly(I:C)濃度的升高、細(xì)胞凋亡增強(qiáng)，pro-caspase-3裂解活化速度大于合成速度，從而導(dǎo)致caspase-3 P17/pro-caspase-3比值呈顯著上升趨勢，其中的機(jī)制將是以后研究的方向。

未來，可進(jìn)一步研究內(nèi)源性凋亡途徑是否也參與了TLR3誘導(dǎo)的HUVECs凋亡，在TLR3下游、TRAIL、DR4、DR5上游是否存在更核心的凋亡調(diào)控分子，如果能夠發(fā)現(xiàn)更多機(jī)制、找到更多有價值的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，那么在治療炎癥和腫瘤方面將會得到更多的靶點(diǎn)，為臨床治療疾病提供更多的依據(jù)和啟發(fā)。

綜上所述，Poly(I:C)活化TLR3可能引起HUVECs凋亡，其機(jī)制可能涉及外源性凋亡途徑TRAIL-DR4/DR5，因此在臨床治療工作中，TRAIL、DR4、DR5可以作為有意義的治療靶點(diǎn)，例如在炎癥病變的治療中，可使用TRAIL、DR4、DR5拮抗劑抑制其活化，減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生，從而降低或避免組織損傷但不影響抗病毒作用，對于延緩或阻止病毒感染具有十分重要的意義；而在腫瘤的治療中可使用TRAIL、DR4、DR5激動劑，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的凋亡，達(dá)到消減腫瘤的作用。