薛志紅，楊春燕，余 陽

(1.安徽新華學院 藥學院，安徽 合肥 230088；2.昆明植物研究所，云南 昆明 650204)

甘青虎耳草(SaxifragatanguticaEngl.)作為一種經(jīng)典藏藥，為多年生草本植物，高約3～30 cm，在甘肅、青海、四川以及西藏等地廣泛分布，全草入藥，性涼味苦，對風熱退燒、傾瀉肝膽以及咳嗽，炎癥等方面有一定的治療作用。[1]有研究表明，甘青虎耳草中含有豐富的黃酮等化學成分，在抑菌、抗炎、抗病毒以及抗腫瘤方面具有顯著效果。[2-4]亦有研究報道，甘青虎耳草能夠有效抑制人的胃癌細胞生長，促進胃癌細胞的凋亡，在抑制甲狀腺瘤的抑制方面，效果也非常顯著。[5-6]當前甘青虎耳草總黃酮化合物在抗癌、抗病毒等活性方面，現(xiàn)已成為廣大醫(yī)藥工作者研究的重點。

本文通過響應面分析方法，對甘青虎耳草的黃酮提取方法進行優(yōu)化，同時對其所含總黃酮進行抗腫瘤實驗，旨在發(fā)現(xiàn)有抗腫瘤活性的成分，為甘青虎耳草的研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實驗材料與試劑

甘青虎耳草(干燥，全株購買自亳州藥材市場)、蘆丁(北京索萊寶科技有限公司，批號：10082-2020707)、乙醇(分析純，上海國藥集團化學試劑有限公司)。環(huán)磷酰胺(CTX，北京華邁科生物技術有限責任公司)，荷瘤小鼠(BALB/c，4T1(小鼠乳腺癌細胞)25只，MCF-7(人非小細胞肺癌細胞)25只，小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.1.2 實驗儀器

電子天平(型號：Sartorius BT；廠家：濟南歐萊博科學儀器有限公司)、離心機(型號：GT10-1；廠家：江蘇大周過濾科技有限公司)、紫外分光光度計(型號：UV-9000；廠家：上海元析儀器有限公司)、BK型超聲波萃取器(巴克超聲波科技有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 黃酮提取工藝

將干燥的甘青虎耳草經(jīng)過粉碎(100目)之后，使用超聲波萃取器進行提取，隨后使用離心機進行離心(4000 r/min)，將燒瓶中的上清液定容，通過紫外分光光度計測其吸光度，計算甘青虎耳草總黃酮的提取收率。

1.2.2 黃酮含量測定

(1)標準曲線繪制

精確稱取干燥(120℃)至恒重的蘆丁(10 mg)作為對照品，將其置于100 mL的容量瓶中定容(75%乙醇，0.1g/L)。同時分別精密量取0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0mL定容的對照品，分別置于容量瓶中，搖勻放置10 min，參照趙楊[7]等方法得回歸方程：y = 12.54 x-0.34(r = 0.9998)。

(2)甘青虎耳草總黃酮的含量測定

精確稱量干燥的甘青虎耳草樣品放置100mL的燒瓶種，加入75%的乙醇，加熱回流、抽濾，收集濾液，用75%的乙醇將其定容至50mL，得到總黃酮提取液。量取1.0 mL的甘青虎耳草總黃酮提取液，通過上述方法得樣品溶液待測，得樣品吸光度，最終算出總黃酮的質(zhì)量濃度，計算含量，公式如下。

Y =(c* n*V / m)*100%

式中：Y：縱坐標；c：總黃酮質(zhì)量濃度；m：干燥的甘青虎耳草質(zhì)量；n：稀釋倍數(shù)；V：樣品體積

1.2.3 單因素實驗

以總黃酮提取率為考察指標，乙醇作為提取溶劑，按上述提取過程，分別對提取時間、液料比、超聲波功率進行單因素實驗。提取時間設置5個水平(30 min、60 min、90 min、120 min、150 min)；液料比設置5個水平(10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1)；超聲功率設置5個水平(30 W、60 W、120 W、240 W、360 W)

1.2.4 響應面實驗

在單因素實驗的基礎上，采用Design expert 軟件的Box-Benhnken設計響應面實驗，將甘青虎耳草總黃酮提取的三因素確定為提取時間(A)、液料比(B)、超聲波功率(C)，同時以甘青虎耳草總黃酮百分含量(Y)為目標，具體的實驗因素水平編碼詳見表1。

表1 因素與水平設計表

1.2.5 甘青虎耳草總黃酮的制備

按照上述甘青虎耳草總黃酮優(yōu)化后的提取方法，進行總黃酮提取，最后得到棕黃色的甘青虎耳草總黃酮。通過蘆丁作為對照品，用硝酸鋁法測得甘青虎耳草總黃酮的純度為86.34%。

1.2.6 甘青虎耳草總黃酮急性毒性實驗[5]

通過霍恩氏法進行甘青虎耳草總黃酮的急性毒性實驗，采取1.0 g/kg的劑量對實驗小鼠灌胃，進行預實驗，觀察小鼠在24 h內(nèi)的生命活動狀況(小鼠進食、飲水、活動、背毛、體重、精神狀態(tài)、存活動物數(shù)、死亡等)，為發(fā)現(xiàn)小鼠出現(xiàn)任何不良癥狀，也沒有中毒以及死亡出現(xiàn)。實驗采用1.0、2.0、4.0、10.0 g/kg的劑量進行急性毒性實驗，通過24 h對小鼠進行3次灌胃，觀察2周。

1.2.7 甘青虎耳草總黃酮的體內(nèi)抗腫瘤實驗

荷瘤小鼠(BALB/c，4T1(小鼠乳腺癌細胞))25只以及MCF-7(人非小細胞肺癌細胞)25只，分別精確稱其質(zhì)量，隨機分為5組：甘青虎耳草總黃酮低劑量組(灌胃給藥50 mg/kg，每日一次)、中劑量組(灌胃給藥100 mg/kg，每日一次)、高劑量組(灌胃給藥200 mg/kg，每日一次)、CTX組(環(huán)磷酰胺，腹腔注射，20 mg/kg，隔日一次)及空白對照組(灌胃等體積生理鹽水)，用藥劑量大小參照周敏等實驗方法。[8]連續(xù)給藥10天，斷頸處死小鼠，分離腫瘤，稱其腫瘤質(zhì)量。通過公式：抑瘤率(%)=(C-T)/ C×100%，其中，C為對照組的平均腫瘤質(zhì)量，T為給藥組的平均腫瘤質(zhì)量。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 提取時間對甘青虎耳草總黃酮含量的影響

將甘青虎耳草提取的溫度、液料比保持不變，分別考察其提取時間(30 min、60 min、90 min、120 min、150 min)對總黃酮含量的影響，實驗結果見圖1(A)。隨著甘青虎耳草提取時間的增加，甘青虎耳草總黃酮的含量出現(xiàn)先增加隨后降低的現(xiàn)象，在120 min時，達到含量的峰值。對其原因分析可能是：a.在隨著時間延長，總黃酮發(fā)生了降解反應，使得其含量降低；b.隨著提取時間延長時，提取物中的雜質(zhì)含量也同時增加，導致甘青虎耳草總黃酮的總含量降低。

2.1.2 液料比對甘青虎耳草總黃酮含量的影響

將甘青虎耳草提取時間、提取溫度保持不變，考察液料比(10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1)對甘青虎耳草總黃酮含量的影響，具體實驗結果見圖1(B)。隨著甘青虎耳草液料比的增加，總黃酮含量也隨之逐漸增大，實驗發(fā)現(xiàn)當液料比在40∶1時，達到最大值，繼續(xù)增加溶劑的量，總黃酮的含量沒有明顯變化，最終確定其提取的液料比為40∶1。

2.1.3 超聲波功率對甘青虎耳草總黃酮含量影響

將甘青虎耳草液料比、提取時間保持不變，分別考察提取時超聲波功率(30 W、60 W、120 W、240 W、360 W)對甘青虎耳草總黃酮含量的影響，實驗結果見圖1(C)。實驗發(fā)現(xiàn)，隨著超聲功率不斷增加，甘青虎耳草總黃酮含量也明顯升高，但是當提取功率達到240 W時，提取的效率出現(xiàn)顯著下降。其原因可能是較高的提取功率使得其黃酮類成分被破壞分解。[8]

圖1 各單因素實驗對甘青虎耳草總黃酮的影響

2.2 響應面分析法優(yōu)化提取工藝

2.2.1 回歸模型的建立及結果分析

依據(jù)Box-Benhnken方法，經(jīng)過單因素實驗后，將甘青虎耳草提取時間、液料比、超聲波功率作為自變量，甘青虎耳草總黃酮的收率作為應變量(響應值)，實施三因素三水平進行響應面實驗分析。最終得到優(yōu)化實驗組(17組)，實驗數(shù)據(jù)見表2。同時，多元回歸擬合結果見表3。

表2 實驗設計及結果

編號編碼水平A提取時間(min)B液料比(g.g-1)C超聲功率(W)甘青虎耳草總黃酮收率(mg/g)800139.05900-141.2110-1-1-140.231100041.221211038.211301-140.1214-10-141.221500041.0916-11040.661701139.02

表3 回歸分析結果

經(jīng)Design-Expert 8.0.6對實驗數(shù)據(jù)進行回歸擬合，最終得甘青虎耳草總黃酮的(Y)對實驗因素的回歸方程：Y(總黃酮百分含量)=41.28+0.10 A+0.24 B+0.053 C-0.41 AB+0.09 AC-0.11 BC-1.44 A2-0.69 B2-6.0 C2。上式中，在實驗設計上，對提取時間、液料比及超聲波功率，均通過編碼處理，式中各相關因素系數(shù)的絕對值大小，反應了各個單因素對響應值的影響，同時系數(shù)的正負反映了各因素對響應值的正負影響關系。[10]

通過表3，A、B、C的二次項可知，提取時間與液料比及提取時間與超聲功率的交互項(P<0.0001)，表明分別對甘青虎耳草總黃酮的提取工藝影響成顯著。

2.2.2 響應面結果分析

依據(jù)回歸分析結果顯示，分別作出響應面圖，如圖4所示，I、II、III三組圖直觀的反映了提取時間、液料比及超聲功率3個單因素之間的相互作用對總黃酮含量響應值的影響程度。[11]其中，等高線的形狀也在一定程度上反映交互效應的強弱程度。[12]

響應面圖是響應值Y對應與A、B、C三實驗因素組成的三維空間曲面圖以及在二維平面上的等高線圖，其Y數(shù)值能夠非常直觀的對A、B、C三實驗因素及兩者之間的交互作用的影響。其中，等高線的形狀在一定程度上對應其交互效應的強弱情況，橢圓形狀顯示出相關因素之間的交互作用明顯，但圓形則表現(xiàn)出交互作用不顯著。

依據(jù)表3的回歸分析中的P值情況，通過圖2(I)可以看出，液料比與提取時間之間的交互作用呈極顯著水平，等高線呈橢圓形狀。同時，當超聲功率一定時，隨液料比與提取時間之間的上升，甘青虎耳草總黃酮的提取得率，表現(xiàn)出先迅速上升后緩慢下降的趨勢，在一定程度上說明兩者交互因素能夠對總黃酮的提取效果產(chǎn)生顯著影響，液料比在40∶1附近數(shù)值對提取收率有顯著影響。通過圖2(II)顯示，提取因素中的超聲功率與提取時間交互作用，表現(xiàn)為顯著水平，等高線呈橢圓形。當液料比為一固定值時，若超聲功率與提取時間不斷增加，甘青虎耳草總黃酮的提取率表現(xiàn)出先緩慢上升隨后出現(xiàn)逐漸降低的趨勢，顯示提取的超聲功率與提取時間存在較小波動，對總黃酮的提取率產(chǎn)生的影響較小。通過圖2(III)可知，甘青虎耳草提取的超聲功率與提取液料比之間的交互作用，為顯著水平，等高線表現(xiàn)出橢圓形，在提取時間固定時，隨著超聲功率與液料比因素數(shù)值上升，總黃酮含量表現(xiàn)出先顯著升高，隨后快速下降的趨勢，超聲功率在160W之后，對甘青虎耳草總黃酮的提取收率有較大影響。

圖2

2.2.3 驗證性實驗

通過對實驗模型進行分析，甘青虎耳草總黃酮提取工藝參數(shù)為：超聲時間為120 min；液料比為40∶1；超聲功率為240 W，同時，在此實驗條件下對甘青虎耳草總黃酮進行提取，理論收率為43.2 mg/g，依據(jù)此實驗條件進行多次平行驗證性實驗，得到收率為42.6 mg/g，與理論預測值對比，RSD < 5%，相對誤差值較小。

2.2.4 急毒性實驗結果與分析

急毒性實驗結果表明，實驗小鼠生命體征良好，無中毒及死亡現(xiàn)象發(fā)生。具體數(shù)值詳見表4所示。

表4 甘青虎耳草急毒性實驗結果

2.2.5 荷瘤小鼠腫瘤的抑制效果與分析

通過表5結果可以看出，甘青虎耳草總黃酮給藥后，荷瘤小鼠腫瘤(MCF-7)各組小鼠的體質(zhì)量正常，CTX組、低劑量組、中劑量組以及高劑量組分別對照組相比，沒有統(tǒng)計學差異(P>0.05)，其中，高劑量組的終止體質(zhì)量與對照組終止體質(zhì)量相比，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，高劑量組的瘤質(zhì)量與對照組瘤質(zhì)量相比，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。

表5 甘青虎耳草總黃酮對荷瘤小鼠腫瘤(MCF-7)的抑制效果

通過表6結果可以看出，甘青虎耳草總黃酮給藥后，荷瘤小鼠腫瘤(4T1)各組小鼠的體質(zhì)量正常，CTX組、低劑量組、中劑量組以及高劑量組分別對照組相比，沒有統(tǒng)計學差異(P>0.05)，其中，高劑量組的終止體質(zhì)量與對照組終止體質(zhì)量相比，具有統(tǒng)計學差異(*P<0.05)，高劑量組的瘤質(zhì)量與對照組瘤質(zhì)量相比，具有統(tǒng)計學差異(#P<0.05)。

表6 甘青虎耳草總黃酮對荷瘤小鼠腫瘤(4T1)的抑制效果

2.2.5 荷瘤小鼠給藥后腫瘤大小對比分析

荷瘤小鼠(MCF-7、4T1)連續(xù)給藥10天后，斷頸處死小鼠，分離腫瘤，甘青虎耳草總黃酮高劑量組、CTX組與對照組對比，效果顯著，詳見圖3所示。

圖3 荷瘤小鼠(MCF-7、4T1)給藥后代表性腫瘤圖像

3 討論

近年來，關于甘青虎耳草化學成分的研究報道較多，特別是作為主要藥用成分之一的總黃酮，由于具有較好的抗炎、抗腫瘤等作用，也越來越受到關注。[13-14]

本實驗通過Box-Behnken實驗設計及響應面具體分析，建立了甘青虎耳草總黃酮數(shù)學模型，對比了提取時間、液料比及超聲功率三個單因素對甘青虎耳草總黃酮收率的相關影響，通過單因素、響應面實驗，最終得出甘青虎耳草總黃酮的最佳提取工藝為：超聲時間、超聲功率、液料比分別為120 min、240 W及40∶1(g.g-1)，理論收率為43.2 mg/g，依據(jù)此實驗條件，最終驗證性實驗得到收率為42.6 mg/g，與預測值有較好的相符性。

本實驗有效避免了傳統(tǒng)提取方法中較高溫度對總黃酮成分的破壞作用。同時，實驗通過對荷瘤小鼠的體內(nèi)抑瘤實驗，對甘青虎耳草生物活性物質(zhì)的抗腫瘤作用進行分析研究，發(fā)現(xiàn)甘青虎耳草總黃酮有較好的抗腫瘤活性，為抗腫瘤藥物的完善，提供一定的參考價值，同時為甘青虎耳草資源的綜合利用提供參考依據(jù)。