易小哲，王夢(mèng)月，鄔 蘭，劉 霞，劉佳偉，農(nóng)熠瑛，陳士林，師玉華＊＊

（1. 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所青蒿素研究中心/中藥鑒定與安全性評(píng)估北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100700；2. 武漢理工大學(xué)化學(xué)化工與生命科學(xué)學(xué)院 武漢 430070；3. 湖北艾艾貼健康科技有限公司 黃岡 435300）

艾葉來(lái)源于菊科蒿屬植物艾（Artemisia argyi）的干燥葉，是我國(guó)的傳統(tǒng)中藥材。艾葉作為藥材正式記載始于《名醫(yī)別錄》[1]，具有悠久的藥用歷史，《中國(guó)藥典》記載其有溫經(jīng)止血，散寒止痛的效用[2]。此外，艾葉也是艾灸產(chǎn)品主要原料，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。艾的有效活性成分以揮發(fā)性的萜類化合物為主，具有抗菌抗炎、止咳平喘的藥理作用[3]。隨著艾葉和艾灸在醫(yī)藥和保健產(chǎn)品工業(yè)中的大量應(yīng)用，艾的品質(zhì)研究也受到了廣泛的關(guān)注。萜類活性成分作為艾葉中的次生代謝產(chǎn)物，是一類重要的天然產(chǎn)物，依賴于植物提取。因此，增加艾葉中萜類活性成分的含量對(duì)艾葉品質(zhì)的提升有著關(guān)鍵作用。因此，篩選和鑒定艾中萜類生物合成途徑相關(guān)的調(diào)控因子研究將有助于解析其生物合成和積累分子機(jī)制，為艾中活性成分含量提升提供了分子生物學(xué)依據(jù)。

轉(zhuǎn)錄因子（transcription factors, TFs）是可以與DNA 序列以特定的方式結(jié)合調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)[4]。在高等植物中，TFs 是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要組成部分，參與調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育、次生代謝和脅迫反應(yīng)等重要生理過(guò)程[5-6]。WRKY 家族是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，主要在植物生長(zhǎng)發(fā)育和響應(yīng)逆境脅迫中發(fā)揮重要作用[7]。WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子含有約60個(gè)氨基酸殘基序列組成的高度保守結(jié)構(gòu)域，稱為WRKY 結(jié)構(gòu)域，其N 端是WRKYGQK 保守序列，被稱為WRKY 七肽結(jié)構(gòu)；C 端則是具有一個(gè)典型的鋅指結(jié)構(gòu)，由CX4-5-C-X22-23-H-X1-H 或C-X7-C-X23-H-X1-C 組 成[8]。WRKY 結(jié)構(gòu)域是WRKY 蛋白與DNA 分子結(jié)合的主要位點(diǎn)，主要通過(guò)與目標(biāo)基因啟動(dòng)子區(qū)的W-box 結(jié)合來(lái)調(diào)控目的基因的轉(zhuǎn)錄[9]。WRKY 家族根據(jù)含WRKY 結(jié)構(gòu)域的數(shù)量和鋅指結(jié)構(gòu)的類型劃分為I、II、III三類，具有兩個(gè)WRKY 結(jié)構(gòu)域的蛋白為組I；具有一個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域且具有C2H2 結(jié)構(gòu)（C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H）為組II，具有一個(gè)WRKY 結(jié)構(gòu)域且具有C2HC 結(jié)構(gòu)（C-X7-C-X23-H-X1-C）的為組III。其中組II中又根據(jù)保守氨基酸的差異細(xì)分為IIa、IIb、IIc、IIf、IIe 五類[10]。WRKY 家族轉(zhuǎn)錄因子參與了多種激素的信號(hào)通路，例如茉莉酸（Jasmonic acid，JA）、水楊酸（Salicylic acid，SA）和脫落酸（Abscisic acid，ABA）等激素信號(hào)，從而影響植物生長(zhǎng)發(fā)育和次生代謝等[11]。例如，擬南芥的AtWRKY70 是SA 與JA 介導(dǎo)抗病信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的調(diào)控因子，是SA 誘導(dǎo)基因的激活劑和JA 響應(yīng)基因的阻遏物[12]；丹參SmWRKY14被鑒定為受JA、ABA、赤霉素（Gibberellin，GA）等植物激素及機(jī)械損傷強(qiáng)烈誘導(dǎo)的WRKY基因，并且與丹參酮合成關(guān)鍵酶基因DXS、GGPPS、CPS的表達(dá)模式相似，可能參與到了丹參的萜類次生代謝產(chǎn)物的生物合成中[13]；小麥TaWRKY40-D可能參與JA 和ABA 途徑來(lái)正調(diào)節(jié)小麥的葉片衰老過(guò)程的WRKY 蛋白[14]。其中，JA 是高等植物內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一種內(nèi)源性植物激素，通過(guò)調(diào)控與植物抗逆有關(guān)基因的表達(dá)，緩解植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中受到的生物與非生物脅迫，是一種重要的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑[15]。研究表明JA 在調(diào)節(jié)植物抗逆的過(guò)程中，會(huì)增加次生代謝產(chǎn)物的積累[16]，而藥用植物中的次生代謝產(chǎn)物通常是其有效成分[17]。很多WRKY 家族轉(zhuǎn)錄因子在JA 信號(hào)誘導(dǎo)的藥用植物次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成和積累過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[18]。例如，Suttipanta 等[19]通過(guò)在長(zhǎng)春花中過(guò)表達(dá)一個(gè)受JA 誘導(dǎo)的WRKY 蛋白CrWRKY1，發(fā)現(xiàn)其能上調(diào)長(zhǎng)春花中萜類抗癌活性成分吲哚生物堿（terpene indole alkaloids ，TIA）合成基因的表達(dá)，增加TIA 的含量；Li 等[20]發(fā)現(xiàn)在紅豆杉懸浮細(xì)胞中，由外源茉莉酸甲酯（Methyl Jasmonate，MeJA）特異性誘導(dǎo)的TcWRKY1 蛋白的過(guò)表達(dá)能夠增強(qiáng)紫杉醇生物合成中的關(guān)鍵酶DBAT 的表達(dá)；Chen 等[21]發(fā)現(xiàn)青蒿素腺毛中特異表達(dá)的WRKY1基因（AaGSW1）是JA/ABA 響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子，且能夠正向調(diào)節(jié)CYP71AV1和AaORA的表達(dá)，從而提高青蒿素含量。因此，WRKY 家族轉(zhuǎn)錄因子在JA響應(yīng)和藥用活性成分累積中具有重要作用。

目前，艾的分子生物學(xué)研究開(kāi)展尚淺，WRKY 家族轉(zhuǎn)錄因子的鑒定及其功能還沒(méi)有報(bào)道。本研究擬以艾的外源MeJA 處理轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)為基礎(chǔ)，系統(tǒng)鑒定艾的WRKY 家族轉(zhuǎn)錄因子，并通過(guò)其蛋白理化性質(zhì)、進(jìn)化關(guān)系、保守基序等特征分析和JA脅迫下的基因表達(dá)模式分析，篩選在外源MeJA 處理下差異表達(dá)的WRKY基因，為艾葉WRKY 家族轉(zhuǎn)錄因子鑒定和參與MeJA 誘導(dǎo)的艾葉中萜類等活性成分的累積機(jī)理研究提供分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料及處理

本研究所用艾（A. argyi）采自湖北蘄春縣張榜鎮(zhèn)蘄艾種植基地，將新鮮的根狀莖移栽至中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所溫室中培育。選擇來(lái)自一株植物的根莖繁殖的、長(zhǎng)勢(shì)一致的90天齡幼苗作為試驗(yàn)材料。分別用100 μmol·L-1的MeJA 溶液（98% MeJA，Sigma，W341002-SAMPLE-K，以含0.098%無(wú)水乙醇的去離子水為溶劑）和空白溶液（含0.098%無(wú)水乙醇的去離子水）噴施葉片，取噴灑后12 h的葉片，每3株一組，取三組重復(fù)。樣品在液氮中速凍，-80℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 RNA提取和cDNA合成

稱取葉片樣本100 mg，充分研磨后利用EasyPure? Plant RNA Kit（ER301-01，TransGen Biotech）試劑盒提取總RNA；采用微量紫外分光光度計(jì)NanoDrop 2000 檢測(cè)RNA 樣品的濃度、OD260/OD280 以及OD260/OD230 值；取檢測(cè)合格的RNA 樣本進(jìn)行cDNA 第一鏈合成，按照TransScript? One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix（AT311-02，TransGen Biotech）試劑盒的操作方法進(jìn)行；cDNA放置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 AarWRKY序列的篩選和鑒定

本研究基于課題組已有的艾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的unigene 序列，采用ITAK[22]數(shù)據(jù)庫(kù)（http://itak.feilab.net/）進(jìn)行候選WRKY基因的預(yù)測(cè)。利用ORFfinder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）預(yù)測(cè)候選基因的包含起始密碼子和終止密碼子的完整的開(kāi)放閱讀框（Open Reading Frame，ORF），選取其中最長(zhǎng)的ORF并使用標(biāo)準(zhǔn)密碼子翻譯表翻譯成全長(zhǎng)蛋白序列。然后，使用PFAM[23]（http://pfam.xfam.org/）和WRKY 域（WRKY：PF03106）的隱馬爾可夫模型（Hidden Markov Model，HMM）驗(yàn)證保守結(jié)構(gòu)域并去除假陽(yáng)性序列。

AarWRKY 蛋白的理化性質(zhì)采用ExPASy ProtParam[24]（http://cn. expasy. org/tools）進(jìn)行分析。AarWRKY蛋白的亞細(xì)胞定位使用WoLF PSORT[25]（http://www.genscript.com/psort/wolf_psort.html）預(yù)測(cè)。

1.4 AarWRKY 的分類、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和保守結(jié)構(gòu)域分析

基于艾中WRKY 蛋白的WRKY 保守結(jié)構(gòu)域?qū)arWRKY進(jìn)行分類。AarWRKY 的WRKY 結(jié)構(gòu) 域 在Jalview 軟件中進(jìn)行可視化分析[26]。使用MEGA7[27]中的MUSCLE 和Neighbor-Joining 方法（參數(shù)設(shè)置：進(jìn)化模 型 為Poisson model；Bootstrap 重 復(fù)=1000）構(gòu) 建AarWRKY蛋白序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。利用在線保守基序預(yù)測(cè)網(wǎng)站MEME[28]（https://meme-suite.org/meme/tools/meme）（motif參數(shù)設(shè)置為10）驗(yàn)證AarWRKY 蛋白的保守基序。利用TBtools[29]可視化分析AarWRKY 蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)和保守基序。

1.5 表達(dá)模式分析與差異基因篩選

提取6個(gè)外源MeJA處理組（MeJA）和對(duì)照組（CK）下的葉片RNA-seq 數(shù)據(jù)中AarWRKY基因的表達(dá)量（Fragments Per Kilobase Million，F(xiàn)PKM）數(shù)據(jù)，經(jīng)row scale 進(jìn)行均一化處理，并運(yùn)用TBtools 軟件繪制熱圖，以系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行聚類和差異表達(dá)分析。以MeJA組和CK 組的AarWRKY基因的表達(dá)量（FPKM）數(shù)據(jù)的差異倍數(shù)（fold change）≥2.0 為閾值篩選差異表達(dá)的AarWRKY基因。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

以Actin為內(nèi)參基因[30]，通過(guò)Primer Premier 5.0 軟件分別設(shè)計(jì)差異表達(dá)基因AarWRKY3、16、18、20、30、37的實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR）引物（表1），并利用Primer-BLAST（http://ncbi.nlm.nih.gov./tools/primer-BLAST）進(jìn)行引物序列特異性分析。引物由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)采用TransStart? Green qPCR SuperMix UDG（AQ111-01，TransGen Biotech）試劑盒，具體操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。qRT-PCR 體系為20 μl：2×TransStart TipTop Green qPCR SuperMix10.0 μl，正向引物（10 μM）0.30 μL，反向引物（10 μM）0.30 μL，cDNA 1.0 μL，ddH2O 8.4 μL，配制過(guò)程在冰上完成。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性10 min；95℃、10 s，60℃、15 s，72℃、20 s，40 個(gè)循環(huán)；熔解曲線分析程序：95℃、15 s，60℃、1 min，95℃、15 s。每個(gè)樣品設(shè)置3 個(gè)技術(shù)重復(fù)，并設(shè)陰性對(duì)照。

表1 qRT-PCR引物序列

1.7 基因蛋白功能和互作網(wǎng)絡(luò)分析

基于擬南芥同源蛋白，我們使用STRING.4[31]（https://string-db.org/）預(yù)測(cè)外源MeJA 處理下的差異表達(dá)AarWRKY 的同源蛋白和其相互作用網(wǎng)絡(luò)。使用BLASTP 鑒定和確定AarWRKY 蛋白在Arabidopsis thaliana中的同源蛋白，選取比對(duì)的蛋白中e-value 值最小的蛋白作為AarWRKY 蛋白在Arabidopsis thaliana中的同源蛋白來(lái)構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果與分析

2.1 艾AarWRKY轉(zhuǎn)錄因子鑒定和蛋白理化性質(zhì)分析

本研究通過(guò)ITAK 數(shù)據(jù)庫(kù)從艾葉的RNA-seq 數(shù)據(jù)中共預(yù)測(cè)獲得69 個(gè)WRKY候選基因，選定候選基因的最長(zhǎng)的完整的ORF，翻譯出全長(zhǎng)蛋白序列，通過(guò)HMM去除冗余和錯(cuò)誤序列后，共鑒定出37 個(gè)WRKY 蛋白，將其重命名為AarWRKY1-AarWRKY37。AarWRKY蛋白的理化性質(zhì)結(jié)果表明（表2），AarWRKY 基因編碼的氨基酸長(zhǎng)度為119-547 aa；蛋白分子量為13426.3-59781 Da；理論等電點(diǎn)（isoelectric point，PI）大小為4.86-10.03。在37 個(gè)AarWRKY 蛋白中，有6 個(gè)蛋白（AarWRKY2，AarWRKY3，AarWRKY10，AarWRKY16，AarWRKY32，AarWRKY37）為穩(wěn)定蛋白（不穩(wěn)定指數(shù)，Instability index ＜40），其余蛋白都是不穩(wěn)定蛋白。所有AarWRKY 蛋白都是親水性蛋白（平均親水性，GRAVY ＜0）。脂肪族指數(shù)（Fatty coefficient）為43.5-74.8。蛋白質(zhì)序列亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果表明，大多數(shù)的AarWRKY蛋白都可能定位于細(xì)胞核，僅有3個(gè)蛋白序列可能定位在細(xì)胞質(zhì)或葉綠體中。

表2 艾葉AarWRKY蛋白的理化信息及特征

2.2 艾AarWRKY家族的WRKY保守結(jié)構(gòu)分析與分類

本研究對(duì)已鑒定的艾中37個(gè)AarWRKY 蛋白的保守WRKY 結(jié)構(gòu)域進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)分析（圖1），結(jié)果發(fā)現(xiàn)大部分AarWRKY 蛋白中WRKY 的七肽序列和鋅指序列非常保守，但也存在一些氨基酸殘基的變異，如組IIc 中的AarWRKY19 的WRKY 七肽結(jié)構(gòu)中的氨基酸殘基被替換為“WRKYGKK”；組IId 中的AarWRKY12 和AarWRKY14 的WRKY 七肽結(jié)構(gòu)中的氨基酸殘基被替換為“WKKYGEK”。參照擬南芥的WRKY 家族分類原則，按照WRKY 保守結(jié)構(gòu)域特征對(duì)AarWRKY 蛋白進(jìn)行分類。34 個(gè)AarWRKY 蛋白分為Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ三組，其中Ⅰ組有8 個(gè)成員，Ⅱ組有22 個(gè)成員，Ⅲ組有4個(gè)成員。Ⅱ組又進(jìn)一步細(xì)分為Ⅱa（1個(gè)），Ⅱb（2 個(gè)），Ⅱc（6 個(gè)），Ⅱd（6 個(gè)）和Ⅱe（7 個(gè)）。但是AarWRKY3、AarWRKY17 和AarWRKY37 三個(gè)蛋白未能歸類，氨基酸比對(duì)結(jié)果分類發(fā)現(xiàn)AarWRKY3 和AarWRKY17 屬于組II，但無(wú)a、b、c、d、e 組的特征氨基酸殘基；而AarWRKY37 只含有保守的“WRKYGQK”的七肽結(jié)構(gòu)，鋅指結(jié)構(gòu)域缺失。

圖1 AarWRKY蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析和家族分類

2.3 艾AarWRKY蛋白系統(tǒng)發(fā)育分析和保守基序分析

本研究進(jìn)一步利用37個(gè)AarWRKY 的全長(zhǎng)蛋白構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，并通過(guò)MEME 分析蛋白的保守基序分布情況。根據(jù)AarWRKY 的全長(zhǎng)蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖2A），同一亞家族的AarWRKY 蛋白序列基本被聚類到了一個(gè)分支或相近的分支上。如組I、組IIa、組IIc 和組III。但是，也有不同的亞家族成員聚類到同一分支上的現(xiàn)象，如IIc 的部分蛋白（AarWRKY4、AarWRKY7、AarWRKY37）和IIe 組的部分蛋白（AarWRKY16、AarWRKY21、AarWRKY28、AarWRKY31）與組I 聚集在一類中；剩余的IIc 蛋白（AarWRKY1、AarWRKY2、AarWRKY13、AarWRKY19）與IIa 和IIb 聚集在一起；IId 組則和剩余的IIe 組蛋白（AarWRKY23、AarWRKY27、AarWRKY33）聚在一個(gè)分支上。而未被分類的AarWRKY3 和AarWRKY17 與組III 具有C2HC 結(jié)構(gòu)的WRKY 蛋白的親緣關(guān)系更近，被分類到了組III 中；AarWRKY37 與組IIc 的成員聚到了一個(gè)分支上，它們的親緣關(guān)系更近。

蛋白保守基序分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖2B），保守基序表現(xiàn)出組間或者亞組間的特異性。其中motif1是WRKY七肽保守域到鋅指結(jié)構(gòu)的第一個(gè)半胱氨酸（Cysteine，C），motif2 是鋅指結(jié)構(gòu)的C-H-H（C）部分，motif1+motif2 的組合均存在于除AarWRKY37 之外的其他蛋白中，由于AarWRKY37 的WRKY 保守結(jié)構(gòu)域僅包含保守的“WRKYGQK”的七肽結(jié)構(gòu)，因此在MEME 的預(yù)測(cè)中，AarWRKY37 的蛋白序列沒(méi)有發(fā)現(xiàn)motif1 和motif2。保守基序的特異性表現(xiàn)在：組I 中的AarWRKY 蛋白序列在N 段還含有保守的motif3 +motif10組合，這是組I的AarWRKY 蛋白特有的另一組WRKY 保守結(jié)構(gòu)域；IIb 亞家族含有特有的motif9 基序；motif6 僅在IId 亞家族中被發(fā)現(xiàn)；motif5則主要分布在組III的蛋白序列中。

圖2 艾AarWRKY蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)和保守基序分布

2.4 外源MeJA 脅迫下AarWRKY 基因的表達(dá)模式分析和差異表達(dá)基因篩選

本研究基于外源MeJA 處理（MeJA）組和對(duì)照（CK）組 的RNA-seq 數(shù)據(jù)，分析外源MeJA 處理下AarWRKY家族基因的表達(dá)模式（圖3）?；虮磉_(dá)熱圖的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在MeJA 的影響下，IIc 亞家族的WRKY基因幾乎都上調(diào)；而IIb 亞家族的兩個(gè)基因AarWRKY11和AarWRKY30的表達(dá)均下調(diào)。而其它亞家族的基因并沒(méi)有體現(xiàn)上調(diào)或下調(diào)的整體性差異。我們以差異倍數(shù)（fold change）＞2.0 為閾值篩選在MeJA 處理下上調(diào)和下調(diào)的差異表達(dá)基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MeJA 處理下AarWRKY3（CK 表達(dá)量0）、AarWRKY20（MeJA 上調(diào)3.76倍）、AarWRKY37（CK 表達(dá)量0）三個(gè)基因?yàn)樯险{(diào)差異基因；AarWRKY16（MeJA 表達(dá)量0）、AarWRKY18（MeJA下調(diào)2.30 倍）、AarWRKY 30（MeJA 下調(diào)2.15 倍）三個(gè)基因?yàn)橄抡{(diào)差異基因。進(jìn)一步利用qRT-PCR 測(cè)定這6個(gè)差異表達(dá)基因的表達(dá)情況，結(jié)果表明（圖4），6 個(gè)差異表達(dá)基因在MeJA 組和CK 組的趨勢(shì)均與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致，驗(yàn)證了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。因此，這6 個(gè)AarWRKY家族基因可能參與艾對(duì)外源MeJA 處理的應(yīng)答。

圖4 外源MeJA處理后艾中AarWRKY差異表達(dá)基因的qRT-PCR分析

2.5 差異表達(dá)的AarWRKY蛋白的功能預(yù)測(cè)

為了進(jìn)一步探究AarWRKY 差異基因在MeJA 處理下的調(diào)控作用，我們使用STRING 預(yù)測(cè)了這6 個(gè)AarWRKYs 在擬南芥中的同源蛋白（表3），并分析它們和MeJA 處理相關(guān)蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)（圖5）。蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)關(guān)系分析結(jié)果預(yù)測(cè)了2 個(gè)上調(diào)蛋白AarWRKY3（與擬南芥WRKY70 同源）和AarWRKY20（與擬南芥WRKY33同源）與JA 信號(hào)的受體蛋白JAZ1直接作用，也與JA信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的重要調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子MYC2 和酶COI1 有相互作用關(guān)系，且在JA 信號(hào)的脅迫下存在共表達(dá)關(guān)系。 此外，上調(diào)蛋白AarWRKY37（與擬南芥WRKY75 同源）和3 個(gè)下調(diào)蛋白 AarWRKY16（ 與 擬 南 芥 WRKY3 同 源）、AarWRKY18（與擬南芥WRKY32 同源）、AarWRKY30（與擬南芥WRKY42 同源）雖然并沒(méi)有被預(yù)測(cè)與JA 信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中的重要蛋白具有相互關(guān)系，但都可能與JA信號(hào)調(diào)控的其它蛋白存在相互作用關(guān)系。如絲裂原活化蛋白激酶3（MPK3）與JA 信號(hào)蛋白、AarWRKY3、AarWRKY20 和AarWRKY16 可能共同參與在植物激素刺激下的防御網(wǎng)絡(luò)，但在該過(guò)程中AarWRKY3 的表達(dá)下調(diào)的，且與MPK3 的具體作用關(guān)系研究較少。AarWRKY30 和AarWRKY37 與磷酸鹽調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和JA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)蛋白ZAT6 存在相互作用。此外AarWRKY37 還可能與乙烯反應(yīng)蛋白EIN3 有相互關(guān)系。而以上的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中，AarWRKY3 和AarWRKY20 都參與到了其中。AarWRKY18 可能參與光敏色素和開(kāi)花時(shí)間調(diào)節(jié)蛋白（PFT1）相關(guān)的調(diào)控。

圖5 外源MeJA處理后艾中差異表達(dá)AarWRKY蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)分析

注：CK：空白溶劑對(duì)照組；MeJA：外源MeJA處理組。

表3 MeJA處理下差異表達(dá)AarWRKY蛋白的擬南芥同源蛋白及其功能

3 討論

艾是重要的藥用植物和經(jīng)濟(jì)作物。目前國(guó)內(nèi)艾的產(chǎn)品主要以艾葉、艾絨以及艾精油三種主要原材料為主，艾葉主要作為藥材使用，艾絨被制備成各種艾灸產(chǎn)品[32]，艾精油則在醫(yī)療保健、日化產(chǎn)品、農(nóng)業(yè)等方面廣泛運(yùn)用[1]。目前，國(guó)內(nèi)艾的整體產(chǎn)業(yè)規(guī)模已達(dá)到了上百億[33]。因此，研究艾葉中活性成分的合成調(diào)控機(jī)制對(duì)提升其藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值有重要影響[34]。WRKY 家族是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，主要在植物生長(zhǎng)發(fā)育和響應(yīng)逆境脅迫等重要生理過(guò)程中發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)，玉米ZmWRKY40在擬南芥中過(guò)表達(dá)可增強(qiáng)其抗旱性[35]；菊花DgWRKY4過(guò)表達(dá)能夠增強(qiáng)其耐鹽性[36]。這些研究都證實(shí)了WRKY 家族在植物應(yīng)對(duì)脅迫方面發(fā)揮著重要的作用。除此之外，WRKY 家族的一些轉(zhuǎn)錄因子也被證實(shí)能夠參與到長(zhǎng)春花、黃花蒿、紅豆杉、丹參和人參等藥用植物的重要次生代謝產(chǎn)物的生物合成中[37]。因此，WRKY 家族基因可能在艾的抗逆及次生代謝產(chǎn)物累積中也發(fā)揮重要作用。

本研究基于艾的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，鑒定出37 個(gè)AarWRKY基因。然而艾的基因組尚未發(fā)表，本研究?jī)H利用了艾的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對(duì)WRKY家族進(jìn)行鑒定，可能有一部分AarWRKY基因未被發(fā)現(xiàn)，許多物種在基因組水平上鑒定出了更多的WRKY基因，例如：De Paolis等[38]在黃花蒿（Artemisia annua）的基因組數(shù)據(jù)中鑒定了122 個(gè)WRKY基因；馬培杰等[39]在百脈根（Lotus corniculatus）的基因組數(shù)據(jù)中鑒定了79個(gè)WRKY基因。

根據(jù)WRKY 家族結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和系統(tǒng)進(jìn)化分析，34個(gè)AarWRKY 蛋白被歸類在I、II、Ⅲ組被證實(shí)的亞家族中。其中I組蛋白有8個(gè)，數(shù)量最多；II-a中蛋白僅有1個(gè)，數(shù)量最少。這與擬南芥[10]、葡萄[40]、菠蘿[41]等植物中WRKY 亞家族的蛋白數(shù)量排序一致。此外，3 個(gè)AarWRKY 蛋 白 （AarWRKY3、 AarWRKY17、AarWRKY37） 未 能 分 類 ，其 中 AarWRKY3、AarWRKY17 具有完整的WRKY 保守結(jié)構(gòu)域的的特征，未能分類的原因是其WRKY 保守結(jié)構(gòu)域的的特征均不符合現(xiàn)有研究中亞家族的分類的特征；AarWRKY37 的蛋白序列僅有WRKY 的七肽序列，后續(xù)鋅指結(jié)構(gòu)和保守氨基酸的特征未知，因此未能分類。保守基序分析表明，AarWRKY 的WRKY 七肽結(jié)構(gòu)和C2H2或C2HC的鋅指結(jié)構(gòu)中氨基酸相當(dāng)保守，37個(gè)AarWRKY 蛋白中僅有AarWRKY12、AarWRKY14和AarWRKY19 三個(gè)蛋白的七肽結(jié)構(gòu)發(fā)生了1 至2 個(gè)氨基酸的突變。此外，同一亞家族的也有相似的保守基序種類和數(shù)目，可能在功能上也更為相似。WRKY家族全長(zhǎng)蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)同一亞家族的大部分成員被聚到一支上，但也有部分成員和別的亞家族蛋白聚到一個(gè)分支，表現(xiàn)出更近的進(jìn)化關(guān)系。這可能是因?yàn)閃RKY 家族的分類是基于保守結(jié)構(gòu)域的數(shù)量和特點(diǎn)來(lái)劃分的，而系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的進(jìn)化分析則是基于全長(zhǎng)蛋白的序列比對(duì)完成的。據(jù)報(bào)道，在胡蘿卜（Daucus carota）[42]、浮萍（Spirodela polyrhiza）[43]和甘草（Glycyrrhiza glabra）[44]等物種中也存在不同亞家族混合聚在同一進(jìn)化分支的現(xiàn)象。越來(lái)越多的研究已經(jīng)證明了WRKY 的亞家族具有多重起源，Zhu 等人[45]對(duì)小麥的研究表明IIc 亞家族起源于I 組的N 端WRKY域；Zhang和Wang[8]提出將WRKY基因家族分為四個(gè)進(jìn)化枝，包括I+IIc組、IIa+b組、IId組和IIe組。本研究艾的WRKY 轉(zhuǎn)錄因子中也存在不同亞家族混合聚在同一進(jìn)化分支的現(xiàn)象，因此為WRKY 的亞家族具有多重起源的假說(shuō)也提供了新的依據(jù)。

茉莉酸是一類重要的植物激素，是植物對(duì)外界脅迫防御反應(yīng)和次生代謝物積累的重要調(diào)節(jié)劑。Schluttenhofer 等[46]在擬南芥和長(zhǎng)春花的WRKY轉(zhuǎn)錄因子研究中發(fā)現(xiàn)，在長(zhǎng)春花中至少有25%的CrWRKY對(duì)JA有反應(yīng)，其中75%的CrWRKY基因是已知的受JA調(diào)節(jié)的AtWRKY直系同源基因。本研究通過(guò)分析MeJA處理下AarWRKY的表達(dá)模式，尋找艾的WRKY家族中響應(yīng)JA 的轉(zhuǎn)錄因子。在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)熱圖分析結(jié)果中（圖3），部分AarWRKY基因的重復(fù)性在三個(gè)重復(fù)差異較大，這可能是由以下兩點(diǎn)造成的：①盡管我們已經(jīng)嘗試選擇生長(zhǎng)均勻的幼苗，但樣本重復(fù)之間的個(gè)體差異仍然存在；②RNA-seq 文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程中的技術(shù)錯(cuò)誤導(dǎo)致。因此，我們使用FPKM 值的平均值來(lái)分析基因表達(dá)差異并利用qRT-PCR 對(duì)篩選出的差異基因的表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證?；虻牟町惐磉_(dá)結(jié)果表明，外源MeJA誘導(dǎo)了艾的WRKY家族中一些基因的表達(dá)變化，其中有 3 個(gè)AarWRKY（AarWRKY3、AarWRKY20、AarWRKY37）的表達(dá)量上調(diào)了2 倍以上，而3 個(gè)AarWRKY（AarWRKY16、AarWRKY18、AarWRKY30）的表達(dá)量下調(diào)了2倍以上，共有6個(gè)基因（16%）在此閾值范圍內(nèi)對(duì)MeJA 有響應(yīng)。qRT-PCR 結(jié)果也驗(yàn)證了轉(zhuǎn)錄組表達(dá)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。這些結(jié)果表明這六個(gè)基因可能參與到JA的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中。進(jìn)一步，本研究利用擬南芥蛋白互作數(shù)據(jù)庫(kù)分析這6個(gè)差異表達(dá)的AarWRKY基因的蛋白可能參與的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示2 個(gè)上調(diào)基因AarWRKY3和AarWRKY20的蛋白可能直接與JA信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中的幾個(gè)重要蛋白（如JAZ1、MYC2）存在相互作用關(guān)系，這兩個(gè)蛋白的擬南芥同源蛋白也是目前研究較為深入的植物激素防御蛋白。其中，AtWRKY70 是SA 和JA 介導(dǎo)的植物對(duì)細(xì)菌病原體反應(yīng)過(guò)程中信號(hào)的聚合節(jié)點(diǎn)[12,46]；AtWRKY33 在灰葡萄孢（Botrytis cinerea）感染時(shí)同時(shí)靶向多個(gè)信號(hào)通路，直接與JA信號(hào)傳導(dǎo)受體JAZ1和JAZ5的啟動(dòng)子結(jié)合[48]。此外 ，AarWRKY16、AarWRKY18、AarWRKY30 和AarWRKY37 等蛋白還可能通過(guò)與EIN3（ethyleneinsensitive3） 、 PFT1 （PHYTOCHROME AND FLOWERING TIME 1） 、 ZAT6 （Zinc-Finger Transcription Factor）等蛋白直接或者間接的相互作用參與到JA、乙烯、光、抗逆等過(guò)程的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中[49-52]。JA 信號(hào)通路中的MYC2 蛋白是萜類次生代謝生物合成中重要的調(diào)控因子，它將JA信號(hào)整合到倍半萜合成酶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中并促進(jìn)倍半萜的產(chǎn)生[53]。Alfieri等[54]在南歐丹參（Salvia sclarea）的毛狀根中過(guò)表達(dá)擬南芥中的異源基因AtWRKY18、AtWRKY40和AtMYC2，發(fā)現(xiàn)了它們以協(xié)同作用的方式共激活萜類骨架合成中MEP 途徑的合成酶基因，從而促進(jìn)南歐丹參中松香烷二萜的積累。在本研究中，我們預(yù)測(cè)了在MeJA 處理下差異表達(dá)的AarWRKY 轉(zhuǎn)錄因子與MYC2蛋白可能有相互作用關(guān)系，說(shuō)明在艾中，AarWRKY 蛋白也可能通過(guò)與MYC2 等JA 信號(hào)調(diào)控蛋白進(jìn)行協(xié)同作用，參與到萜類的活性成分生物合成調(diào)控中。因此，我們能通過(guò)預(yù)測(cè)JA 等信號(hào)蛋白和WRKY 蛋白的相互作用，進(jìn)一步探究AarWRKY 蛋白參與調(diào)控萜類生物合成的機(jī)制。因此，通過(guò)蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)這些差異表達(dá)的AarWRKY 蛋白可能通過(guò)與JA等信號(hào)蛋白相互作用參與萜類生物合成的調(diào)控，后續(xù)還需要對(duì)這些候選AarWRKY基因進(jìn)行克隆和進(jìn)一步體內(nèi)外功能驗(yàn)證。

4 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，本研究從轉(zhuǎn)錄組水平首次系統(tǒng)對(duì)艾葉的WRKY基因進(jìn)行鑒定，并對(duì)理化性質(zhì)、保守結(jié)構(gòu)域特點(diǎn)，家族分類等進(jìn)行了系統(tǒng)分析。進(jìn)一步，通過(guò)基因差異表達(dá)分析和qRT-PCR 驗(yàn)證篩選到6 個(gè)JA 信號(hào)響應(yīng)的AarWRKY基因，并預(yù)測(cè)了這些基因與JA 信號(hào)調(diào)控蛋白協(xié)同作用參與萜類化合物的生物合成可能的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為后續(xù)研究中AarWRKY 蛋白的功能驗(yàn)證提供依據(jù)和方向。該研究為艾中WRKY家族基因的功能鑒定及其在響應(yīng)外源MeJA 處理中的作用研究提供了一定的基礎(chǔ)，也為闡明WRKY 轉(zhuǎn)錄因子在艾的揮發(fā)性萜類等有效成分的生物合成中的調(diào)控機(jī)制提供數(shù)據(jù)支撐。