趙粉琴 丁曉南 安明霞 張小花 賈學(xué)玲

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)(蘭州，73000)；2.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院

卵巢的內(nèi)分泌和生殖功能主要與卵巢內(nèi)原始卵泡貯備量有關(guān)，原始卵泡發(fā)育異常或者卵泡發(fā)育信號(hào)通路異常都會(huì)導(dǎo)致卵泡發(fā)育障礙，出現(xiàn)卵巢功能早衰(POF)或者早發(fā)性卵巢功能不足(POI)[1]。原始卵泡儲(chǔ)量與個(gè)體的生育年限成正比[2]，自然絕經(jīng)[3]或者醫(yī)源性因素[4]POF是耗竭或者原始卵泡閉鎖的結(jié)果。磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/叉頭盒框(Foxo3a)(PI3K/Akt/Foxo3a)通路對(duì)細(xì)胞的增殖、周期和衰老起中心調(diào)控作用[5]，也參與卵巢老化、卵泡發(fā)育和卵母細(xì)胞成熟的調(diào)控[6-7]，但是對(duì)原始卵泡“靜息”維持、發(fā)育啟動(dòng)研究較少。基于此，本研究采用7日齡大鼠卵巢組織體外培養(yǎng)，采用PI3K激動(dòng)劑和抑制劑分別刺激，觀察原始卵泡發(fā)育以及細(xì)胞周期蛋白表達(dá)，進(jìn)一步明確PI3K/AKT信號(hào)通路在原始卵泡激活的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物50只SPF 級(jí) SD 雌性大鼠，7日齡，體重6.5～10.5g，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[許可證號(hào)：SYXK(甘)2015-0005]。

1.1.2主要試劑RPMI1640培養(yǎng)液(Gibco公司)，胎牛血清(Gibco公司)，IGF-1(R&D system)、LY294002(sigma)、Akt(SantaCruz)、磷酸化Akt(SantaCruz)、Foxo3a(Abcam)磷酸化Foxo3a(Abcam)蛋白單克隆抗體。蛋白電泳儀(Bio-rad)、核酸定量測(cè)定儀(Thermo，Nanodrop 2000)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法及檢測(cè)指標(biāo)

1.2.1卵巢的培養(yǎng)及分組取7日齡SPF級(jí)雌性大鼠，處死后取出卵巢，PBS漂洗2次。將卵巢轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)皿，培養(yǎng)基為MEM，100μg/ml青霉素、100μg/ml 鏈霉素。將培養(yǎng)的卵巢隨機(jī)分為3組，對(duì)照組(n=10)：MEM培養(yǎng)基；PI3K激活劑組(n=10)：MEM培養(yǎng)基上加IGF-1 100ng/ml；PI3K抑制劑組(n=10)：MEM培養(yǎng)基上加 20μmol/L LY294002。培養(yǎng)基置370℃，5% CO2孵化箱中，每36h更換1次培養(yǎng)液，總共培養(yǎng)7d。

1.2.2HE染色觀察卵泡形態(tài)學(xué)取卵巢組織經(jīng)石蠟包埋，連續(xù)做4 μm切片，HE染色，酒精脫色，二甲苯固定，中性樹(shù)膠封片，靜置 12 h。鏡下觀察各級(jí)卵泡。

1.2.3TUNEL法觀察顆粒細(xì)胞凋亡按說(shuō)明書(shū)操作，(520±20)nm 的熒光顯微鏡下觀察綠色顆粒；在460 nm DAPI染色液觀察藍(lán)色顆粒，熒光顯微鏡照片以Merdg對(duì)調(diào)亡細(xì)胞疊加顯色。經(jīng)Image-Pro Plus 圖像分析軟件處理。光學(xué)顯微鏡下觀察，陽(yáng)性細(xì)胞(凋亡細(xì)胞)胞核為不均勻棕黃色，位于顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞上。每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)選取3張切片，每張切片在高倍視野下(×200)取5 個(gè)視野，計(jì)算5 個(gè)視野內(nèi)顆粒細(xì)胞凋亡及總細(xì)胞數(shù)量，調(diào)亡指數(shù)(AI)=陽(yáng)性細(xì)胞/總細(xì)胞數(shù)量×(%)。

1.2.4蛋白免疫印跡(WesternBlot)法檢測(cè)卵巢組織p-AKT、p-FOXO3a、CDK2、P27、BCL-2及TAP63的表達(dá)取培養(yǎng)5d大鼠卵巢組織，提取總RNA，蛋白變性，轉(zhuǎn)到PVDF 膜上，加入一抗(p-AKT、p-FOXO3a、CDK2、P27、BCL-2及TAP63，均為1∶1000 稀釋)孵育，40℃封閉過(guò)夜。二抗(1：2000 稀釋)孵育2 h，免疫熒光增強(qiáng)法顯色，與GAPDH 的灰度比值表示。

1.2.5免疫組化法檢測(cè)卵巢組織內(nèi)p-AKT、p-FOXO3a、CDK2、P27、BCL-2及TAP63蛋白的在卵巢表達(dá)情況取固定好卵巢組織，切片，脫水。正常山羊血清封閉液室溫作用30 min。倒掉封閉液后，滴加一抗工作液(1：100)，40℃孵育過(guò)夜。分別滴加生物素化二抗(SP試劑盒)、三抗，分別室溫作用30 min，再滴加DAB顯色液(1：20)室溫避光作用5 min，蘇木素復(fù)染，酒精脫水，中性樹(shù)膠封片。

1.2.6qRT-PCR檢測(cè)PI3K、Akt、Foxo3a、Bcl-2、p27、Cdk2和Tap63mRNA表達(dá)量收集3組培養(yǎng)3，5，7d后的大鼠卵巢組織各3個(gè)樣本，以RNA抽提試劑盒提取RNA。按照試劑盒要求進(jìn)行qRT-PCR，以Gapdh為內(nèi)參照。引物序列見(jiàn)表1。Real-time PCR用SDS2.1軟件進(jìn)行，選擇相對(duì)定量模式，每個(gè)標(biāo)本均作3個(gè)復(fù)孔，分析各孔Ct值，計(jì)算出標(biāo)化后的-ΔCt值，目的基因的相對(duì)表達(dá)量2-ΔCt表示，含義是每個(gè)樣本的基因的表達(dá)相對(duì)于內(nèi)參Gapdh基因表達(dá)的倍數(shù)。再以通過(guò)公式2-ΔCt計(jì)算出得樣本基因相對(duì)表達(dá)量，最后使用計(jì)算得到的相應(yīng)基因的值。

表1 PCR引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 卵巢組織病理學(xué)

對(duì)照組可見(jiàn)的初級(jí)卵泡有卵母細(xì)胞，內(nèi)見(jiàn)圓形的細(xì)胞核，包繞的顆粒細(xì)胞排列規(guī)則。激動(dòng)劑組可見(jiàn)初級(jí)卵泡有卵母細(xì)胞，顆粒細(xì)胞1層和2層，細(xì)胞排列整齊；抑制劑組可見(jiàn)初級(jí)卵泡，卵母細(xì)胞凋亡細(xì)胞核消失。見(jiàn)圖1(1458頁(yè))。

2.2 卵巢凋亡率

凋亡細(xì)胞是卵泡的卵母細(xì)胞及顆粒細(xì)胞，熒光顯示凋亡細(xì)胞為綠色顆粒。與對(duì)照組比較，激動(dòng)劑組和抑制組熒光增強(qiáng)，區(qū)域增大，卵巢凋亡率分別為(8.78±3.67)%、(12.33±5.29)%，較對(duì)照組(4.11±2.15)%均明顯升高(P<0.05)；與抑制劑組比較，激動(dòng)劑組熒光減弱，區(qū)域縮小，卵巢組織凋亡率降低(P<0.05)。見(jiàn)圖2(1458頁(yè))。

2.3 培養(yǎng)5d大鼠卵巢組織內(nèi)蛋白表達(dá)

2.3.1p-AKT、p-FOXO3A和CDK2蛋白含量比較激動(dòng)劑組大鼠卵巢組織p-AKT、p-FOXO3A和CDK2蛋白表達(dá)增加(P<0.01，0.05)，而抑制劑組大鼠卵巢蛋白表達(dá)減少(P<0.01，0.05)。見(jiàn)表2、圖3，4(1459頁(yè))。

表2 各組卵巢組織p-AKT、p-FOXO3A和CDK2蛋白表達(dá)的比較

2.3.2各組卵巢組織內(nèi)P27、BCL-2和TAP63蛋白含量比較見(jiàn)表3、圖5，6(1460頁(yè))。結(jié)果顯示IGF-1對(duì)大鼠卵巢組織BCL-2和TAP63蛋白表達(dá)有促進(jìn)作用，對(duì)P27有抑制作用(P<0.05)，而LY294002對(duì)BCL-2和TAP63蛋白表達(dá)有抑制作用、對(duì)P27有促進(jìn)作用(P<0.05)。

表3 各組卵巢組織P27、BCL-2和TAP63蛋白表達(dá)的比較

2.4 卵巢組織不同時(shí)間段PI3K、Akt、Foxo3a、Bcl-2、p27、Cdk2和Tap63 mRNA相對(duì)表達(dá)量

激動(dòng)劑組大鼠卵巢組織PI3K、Akt、Foxo3a、Bcl-2、p27、Cdk2和Tap63mRNA相對(duì)表達(dá)增加，優(yōu)于對(duì)照組和抑制劑組(P<0.05)，且以第5天最顯著(P<0.05)，之后逐漸下降，第7天達(dá)到最低(P<0.05)。見(jiàn)表4。

組別 只Cdk23d 5d 7d Tap633d 5d 7d 對(duì)照組 31.47±0.640.91±0.322.23±1.601.14±0.130.50±0.020.20±0.03激動(dòng)劑組 311.40±4.35*4.83±1.28*12.18±4.91*3.12±0.70*5.79±2.48*10.24±1.51*抑制劑組 30.58±0.08#0.29±0.11#0.16±0.07#0.21±0.04#0.67±0.02#0.07±0.06#

3 討論

卵巢的顆粒細(xì)胞是卵母細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞，與卵母細(xì)胞相互作用共同調(diào)節(jié)卵泡成熟、排卵和受精過(guò)程[8]。原始卵泡則是卵泡發(fā)育的起點(diǎn)，原始卵泡激活調(diào)控異常就會(huì)出現(xiàn)卵泡閉鎖，影響原始卵泡儲(chǔ)備量，導(dǎo)致卵巢早衰[9]。在卵母細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中，激活PI3K會(huì)使Akt磷酸化，向卵母細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移使叉頭框蛋白(FOX)家族成員之一的Foxo3a過(guò)度磷酸化，一方面解除對(duì)原始卵母細(xì)胞抑制作用，原始卵泡被激活，而過(guò)度過(guò)早發(fā)育，原始卵泡儲(chǔ)備量減少，導(dǎo)致POF發(fā)生[10-12]，另一方面激活PI3K/Akt/Foxo3a信號(hào)通路，可以使休眠的原始卵泡被激活，進(jìn)入生長(zhǎng)階段，發(fā)育成有能力的卵母細(xì)胞[13]。

卵巢整體性的環(huán)境變化顯然對(duì)于卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育有著明顯的影響，然而相關(guān)研究目前較為欠缺[14]。為了證實(shí)PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)原始卵泡發(fā)育的影響作用，本研究采用7日齡大鼠卵巢組織體外培養(yǎng)，研究方法仍然借鑒[15-18]培養(yǎng)方法，使用PI3K/Akt信號(hào)通路激活劑和抑制劑進(jìn)行干預(yù)，研究發(fā)現(xiàn)PI3K通路激活劑(IGF-1)促進(jìn)原始卵泡生長(zhǎng)，同時(shí)卵巢組織p-AKT、p-Foxo3a、CDK2、TAP63和Bcl-2蛋白高表達(dá)，尤其是在培養(yǎng)第5天卵巢組織PI3K、Akt和Foxo3a達(dá)到高峰，第7天卵巢組織CDK2、TAP63和Bcl-2蛋白表達(dá)達(dá)到高峰，之后逐漸下降。而卵巢內(nèi)p27蛋白低表達(dá)，在培養(yǎng)第7天達(dá)到最低。說(shuō)明PI3K/Akt/Foxo3a通路激活劑(IGF-1)促進(jìn)卵泡發(fā)育存在時(shí)間節(jié)點(diǎn)性，PI3K激活劑(IGF-1)促進(jìn)卵泡發(fā)育在培養(yǎng)第5天作用最強(qiáng)，之后降低，而細(xì)胞周期蛋白CDK2和TAp63主要與促進(jìn)細(xì)胞周期凋亡[19-20]有關(guān)，所以其表達(dá)較PI3K/Akt/Foxo3a信號(hào)通路有滯后現(xiàn)象。原始卵泡中FOXO3a磷酸化啟動(dòng)p27Kip1，促進(jìn)原始卵泡發(fā)育，所以p27Kip1對(duì)保持原始卵泡的休眠狀態(tài)至關(guān)重要[21]，POF卵巢組織出現(xiàn)p27低表達(dá)[22]。本研究結(jié)果與Wang等[23]研究在p27缺陷(p27(-/-)小鼠中，卵巢中過(guò)度激活的卵泡池大部分被耗盡，導(dǎo)致卵巢早衰。p27負(fù)向調(diào)控細(xì)胞周期依賴(lài)性蛋白激酶抑制因子(CDKI)，抑制原始卵泡發(fā)育啟動(dòng)以及閉鎖，保持原始卵泡儲(chǔ)量[24-25]。同時(shí)預(yù)測(cè)卵泡的發(fā)育以及成熟應(yīng)該與卵母細(xì)胞內(nèi)cAMP的水平有關(guān)[26]，有待于以后的研究。

綜上所述，卵巢功能的下降是導(dǎo)致現(xiàn)代女性不孕的重要病因之一[27]。探討促進(jìn)卵泡發(fā)育，抑制其閉鎖的分子機(jī)制就顯得尤為重要。PI3K/AKT信號(hào)通路在卵母細(xì)胞生長(zhǎng)、生存和卵母細(xì)胞質(zhì)量方面有著重要作用。他們共同協(xié)調(diào)著卵泡的生長(zhǎng)、發(fā)育、成熟過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)可能由于卵泡發(fā)育環(huán)境改變，卵巢體外培養(yǎng)，組織缺氧壞死，卵母細(xì)胞凋亡，個(gè)別卵巢組織破碎，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。有待于以后實(shí)驗(yàn)中采用卵母細(xì)胞培養(yǎng)，進(jìn)一步觀察PI3K/Akt 信號(hào)通路激動(dòng)劑對(duì)大鼠原始卵泡發(fā)育的影響。