崔 悅，王文正，范琢玉，湯鑫淼，馮 波，關(guān) 皎，朱鶴云

(吉林醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院，吉林 吉林 132013)

黃芪桂枝五物湯出自漢代張仲景所著的《金匱要略》，方中含黃芪、桂枝、芍藥、生姜和大棗五味藥材，具有益氣溫經(jīng)，補(bǔ)氣通陽，和血通痹等功效?，F(xiàn)代臨床主要是用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病、頸椎病、腦血栓以及心絞痛等[1-5]。黃芪桂枝五物湯君臣佐使配伍明確，其中黃芪為君，桂枝為臣，芍藥為佐，生姜、大棗為使。各藥味分工明確，相輔相成，極大地發(fā)揮了各自藥效。在黃芪桂枝五物湯中，桂枝為臣藥，起到了解表和營(yíng)、通陽散寒的作用。桂枝為樟科植物肉桂Cirmarnomum cassia Presl的干燥嫩枝，其主要化學(xué)成分包括：有機(jī)酸類化合物、萜類化合物、黃酮類化合物、糖苷類和苷元化合物等[6]。文獻(xiàn)報(bào)道，桂枝具有多種藥理活性，能夠緩和腸胃刺激、強(qiáng)心、抗炎、抗血小板凝集和改善微循環(huán)等。在臨床實(shí)踐中桂枝可以用于組成多種中藥經(jīng)典方劑，廣泛應(yīng)用于臨床各科疾病的治療[7-10]。桂皮酸是桂枝中的主要活性成分，研究表明，桂皮酸具有解熱、鎮(zhèn)痛、抑菌、抗氧化、抗病毒、保護(hù)血管、利尿等作用。目前，桂枝中桂皮酸的含量測(cè)定方法主要為HPLC法[11-13]。近年來，超快速液相色譜法(ultra-fast liquid chromatography，UFLC)由于具有分離速度快、分析時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛地應(yīng)用到了中藥成分的含量測(cè)定中[14-15]。本研究建立了一種快速準(zhǔn)確的方法用于對(duì)黃芪桂枝五物湯和桂枝水提物中桂皮酸的含量測(cè)定，為黃芪桂枝五物湯的質(zhì)量控制和配伍規(guī)律研究提供一定參考。

1 材料和方法

1.1 儀器與材料

超快速液相色譜儀(Prominence UFLC型，日本島津公司)；超聲儀(KQ-250DE型，昆山市超聲儀器有限公司)；電子天平(CPA 225D型，德國(guó)賽多利斯儀器有限公司)；粉碎機(jī)(FW80型，天津市泰斯特儀器有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(N-1300型，日本東京理化器械株式會(huì)社)；渦旋混勻器(Vortex 3型，德國(guó)IKA公司)。

甲醇、乙腈(美國(guó)Thermo Fisher)，甲酸(天津大茂化學(xué)試劑廠)，純凈水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司)。除甲醇、乙腈、甲酸為色譜級(jí)外，其他均為分析純。桂皮酸對(duì)照品(>98%，成都普菲德生物技術(shù)有限公司官，批號(hào)：18092601)。黃芪、桂枝、芍藥、生姜、大棗(吉林大藥房)，以上藥材經(jīng)吉林醫(yī)藥學(xué)院李景華副教授鑒定均為藥材真品。

1.2 色譜條件

Shim-Pack XR-ODS柱(75 mm×3.0 mm，2.2 mm，日本島津)；色譜柱溫度：35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：290 nm；流速：0.4 mL/min；進(jìn)樣體積：5 μL；流動(dòng)相：0.1%磷酸水溶液(A)-乙腈(B)；梯度洗脫程序如下：0～5 min，10%～25%B；5～10 min，25%～35%B；10～15 min，35%～40%B。桂皮酸對(duì)照品、桂枝水提物樣品、黃芪桂枝五物湯樣品及缺少桂枝的陰性樣品色譜圖見圖1。

1.3 黃芪桂枝五物湯的制備

取黃芪藥材9 g、桂枝藥材9 g、白芍藥材9 g、生姜藥材18 g、大棗藥材4枚于1 L圓底燒瓶，向其中加入10倍量體積的水加熱回流2次，每次1 h。過濾后合并兩次濾液，并使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮到50 mL，4 ℃保存待用。

1.4 桂枝水提物的制備

取桂枝藥材9 g于1 L圓底燒瓶，其余操作同“1.3”。

1.5 陰性樣品溶液的制備

取黃芪藥材9 g、白芍藥材9 g、生姜藥材18 g、大棗藥材4枚于1 L圓底燒瓶，其余操作同“1.3”。

1.6 溶液的制備

1.6.1對(duì)照品溶液的制備

取桂皮酸對(duì)照品適量于5 mL容量瓶中，以甲醇為溶劑進(jìn)行溶解并定容至刻度，得1.0 g/L桂皮酸對(duì)照品溶液，4 ℃保存待用。

1.6.2待測(cè)溶液的制備

分別取“1.3”“1.4”“1.5”項(xiàng)下各提取物0.5 mL，于不同50 mL錐形瓶中，向其中加入甲醇溶液25 mL，采用超聲法提取30 min，續(xù)濾液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，得各待測(cè)溶液。

1.7 分析方法的驗(yàn)證

1.7.1線性關(guān)系

取“1.6.1”項(xiàng)下桂皮酸對(duì)照品溶液適量于5 mL量瓶中，以甲醇為溶劑制得桂皮酸對(duì)照品溶液，濃度依次為0.5、1、2、4、10、20 mg/L，進(jìn)樣分析。線性回歸計(jì)算時(shí)，橫坐標(biāo)X為對(duì)照品濃度(mg/L)，縱坐標(biāo)Y為峰面積，得回歸方程。

1.7.2精密度試驗(yàn)

取“1.6.1”項(xiàng)下桂皮酸對(duì)照品溶液(4 mg/L)，按“1.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣(n=6)。計(jì)算桂皮酸峰面積的RSD。

1.7.3穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批次黃芪桂枝五物湯和桂枝水提物，按“1.6.2”項(xiàng)下方法處理，于室溫放置，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算其峰面積的RSD。

1.7.4重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批次的黃芪桂枝五物湯和桂枝水提物各6份，按“1.6.2”項(xiàng)下制得待測(cè)溶液，進(jìn)樣分析并計(jì)算桂皮酸的含量和RSD。

1.7.5回收率試驗(yàn)

精密量取已知含量的黃芪桂枝五物湯樣品(桂皮酸含量為0.132 mg/mL)和桂枝水提物樣品(桂皮酸的含量為0.193 g/L)各9份，每份0.25 mL，分別向各樣品中加入相當(dāng)于樣品中桂皮酸苷含量80%、100%、120%的對(duì)照品溶液各3份，按“1.6.2”項(xiàng)下方法制得待測(cè)溶液，進(jìn)樣分析，并計(jì)算桂皮酸的回收率和RSD。

1.8 含量測(cè)定

按“1.6.2”項(xiàng)下方法分別制備6批黃芪桂枝五物湯和黃芪水提物待測(cè)溶液，進(jìn)樣分析并計(jì)算桂皮酸含量。

2 結(jié) 果

2.1 分析方法驗(yàn)證

2.1.1線性關(guān)系

經(jīng)線性回歸計(jì)算桂皮酸的回歸方程為

Y=8.1×104X-1.6×104(r=0.999 7)

即桂皮酸在0.5～20 mg/L線性關(guān)系良好。

2.1.2精密度試驗(yàn)

經(jīng)計(jì)算桂皮酸峰面積的RSD為0.42%，即儀器具有良好的精密度。

2.1.3穩(wěn)定性試驗(yàn)

經(jīng)計(jì)算黃芪桂枝五物湯和黃芪水提物中桂皮酸峰面積的RSD分別為0.19%和1.1%，說明上述樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.4重復(fù)性試驗(yàn)

經(jīng)計(jì)算黃芪桂枝五物湯和桂枝水提物中桂皮酸含量的平均值分別為0.132 mg/L(RSD=2.1%)、0.183 mg/L(RSD=1.4%)，即方法具有良好的重復(fù)性。

2.1.5桂皮酸的回收率

黃芪桂枝五物湯樣品中桂皮酸的平均RSD為0.9%,平均回收率為98.1%;桂枝提取液樣品中桂皮酸的平均RSD為0.97%,平均回收率為的98.6%。

2.2 含量測(cè)定

6批黃芪桂枝五物湯和桂枝水提物中桂皮酸含量結(jié)果見表1。

表 1 黃芪桂枝五物湯和桂枝提取液中桂皮酸的含量(%)

3 討 論

3.1 流動(dòng)相的優(yōu)化

流動(dòng)相的種類對(duì)于待測(cè)物的分離和分析具有重要意義。適宜的流動(dòng)相種類和比例有助于待測(cè)物的分析與測(cè)定。本研究參考已有文獻(xiàn)，分別考察了甲醇-水、甲醇-0.2%醋酸水、乙腈-水、乙腈-0.2%甲酸水、乙腈-0.1%磷酸水共5種流動(dòng)相體系，結(jié)果表明，乙腈-0.1%磷酸水作為流動(dòng)相時(shí)能夠獲得較好的分離效果，分析時(shí)間為15 min，且藥材中無其他色譜峰的干擾。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

實(shí)驗(yàn)中對(duì)檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行了考察，二極管陣列檢測(cè)器可進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，并可獲得所測(cè)成分的最大吸收波長(zhǎng)，有助于待測(cè)物的檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：桂皮酸的吸收峰位于290 nm，為最大吸收波長(zhǎng)。綜合考慮雜質(zhì)色譜峰影響、基線、色譜峰峰形、最大吸收等因素，最終選擇290 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 黃芪桂枝五物湯和桂枝水提物中桂皮酸含量比較

通過對(duì)6批黃芪桂枝五物湯和桂枝水提物中桂皮酸含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比于桂枝水提物，黃芪桂枝五物湯中桂皮酸的含量減少，即配伍以后合煎液中桂皮酸的含量低于單煎液，也就是說黃芪桂枝五物湯中桂皮酸的提取減弱。課題組前期研究表明，相比于黃芪水提物，黃芪桂枝五物湯中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量明顯增加，有正向促進(jìn)作用。綜合本實(shí)驗(yàn)與其他文獻(xiàn)研究結(jié)果可以看出：在某些情況下，配伍可促進(jìn)有效成分的溶出，也可能抑制有效成分的溶出，具體的機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

綜上，本研究建立了一種快速、準(zhǔn)確、靈敏的UFLC法測(cè)定黃芪桂枝五物湯和桂枝水提物中桂皮酸的含量。結(jié)果表明，黃芪桂枝五物湯相比于桂枝水提液中桂皮酸的含量減少，可為黃芪桂枝五物湯的進(jìn)一步研究與開發(fā)提供參考依據(jù)。