周珈 綜述，申麗娟，劉野 審校

1.昆明醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，云南 昆明 650500；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南 昆明 650118

接種疫苗是預(yù)防傳染病的有效方法。蛋白亞單位疫苗雖具有良好的安全性，但其免疫原性較弱，需要佐劑輔助增強(qiáng)其免疫反應(yīng)。疫苗佐劑按其設(shè)計(jì)原理不同，主要分為兩類：①免疫調(diào)控佐劑，如免疫刺激分子［細(xì)菌毒素、細(xì)胞因子和Toll樣受體（Tolllike receptor，TLR）］，通過與特異性受體相互作用刺激免疫反應(yīng)；②疫苗遞送型佐劑，包括聚合物納米顆粒、脂質(zhì)體等，可保護(hù)包裹疫苗在其體內(nèi)，使抗原不被降解，增強(qiáng)抗原遞送的靶向性，增強(qiáng)免疫應(yīng)答。在過去的幾十年中，納米佐劑的研發(fā)已成為疫苗研究領(lǐng)域的重要方向之一，已有報(bào)道顯示，其可改善免疫增強(qiáng)活性分子的靶向性并克服生物學(xué)障礙［1］。在智能納米醫(yī)學(xué)的發(fā)展中，納米粒子表面修飾的工程化將為粒子特定和精確的功能提供更大的控制范圍。

本文對(duì)納米粒子表面修飾在疫苗佐劑中的應(yīng)用作一綜述。

1 佐劑在先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中的作用

抗原進(jìn)入人體后，免疫系統(tǒng)會(huì)做出反應(yīng)將其清除，而免疫系統(tǒng)的反應(yīng)可快可慢?？焖俜磻?yīng)的先天免疫系統(tǒng)是機(jī)體的第一道防線，而適應(yīng)性免疫系統(tǒng)雖反應(yīng)緩慢，卻提供持久的免疫保護(hù)。補(bǔ)體系統(tǒng)和巨噬細(xì)胞參與先天免疫。適應(yīng)性免疫反應(yīng)則主要通過抗原介導(dǎo)的具有抗原特異性表面受體的T細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的刺激引發(fā)［2］。CD4+T輔助細(xì)胞（T helper cell）和CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）是兩種不同類型的T細(xì)胞，Th細(xì)胞又分為不同的Th1和Th2細(xì)胞亞群。ALSON等［3］發(fā)現(xiàn)，用破傷風(fēng)類毒素進(jìn)行預(yù)處理，再接種基于腫瘤細(xì)胞的疫苗可使腫瘤生長(zhǎng)退化，并提高小鼠存活率。破傷風(fēng)類毒素的預(yù)處理增強(qiáng)了脾臟免疫功能，提高了淋巴細(xì)胞的增殖率及脾細(xì)胞的IFNγ、TNF-α和IL-4抗原特異性分泌水平，從而提高了免疫反應(yīng)。用破傷風(fēng)類毒素進(jìn)行預(yù)處理可增加記憶T細(xì)胞向腫瘤部位和脾臟的遷移。在破傷風(fēng)類毒素和基于腫瘤細(xì)胞疫苗組合疫苗接種的小鼠中，也發(fā)現(xiàn)抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞毒殺傷效率更高。先天免疫細(xì)胞表達(dá)模式識(shí)別受體（pattern recognition receptor，PRR），有助于檢測(cè)病原菌。C型凝集素樣受體（C-type lectin，CLR）、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體（nucleotide-binding domain leucine-rich repeat，NLR）、TLR和視黃酸誘導(dǎo)基因1樣受體（retinoic acid inducible gene-1-like receptor，RLR）是不同系列的PRR。TLR和CLR存在于抗原呈遞細(xì)胞（antigen presenting cells，APC）表面，而NLR和RLR位于細(xì)胞內(nèi)。病原相關(guān)分子模式（pathogen associated molecular pattern，PAMP）是存在于真菌、病毒、細(xì)菌和寄生蟲等病原微生物中的分子模式［3］。一般來說，佐劑通過免疫細(xì)胞中的PRR激活先天免疫系統(tǒng)。大多數(shù)免疫刺激佐劑作為PRR的配體，通過直接增強(qiáng)激活途徑導(dǎo)致細(xì)胞因子的分泌［4-6］。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）作為TLR的配體，能夠激活TLR4，poly（I：C）激活TLR3，鞭毛蛋白可被TLR5識(shí)別，咪唑喹啉可被TLR7／8識(shí)別，胞嘧啶-鳥嘌呤寡脫氧核苷酸可被TLR9識(shí)別［5］。

因此，與PRR的各種配體結(jié)構(gòu)相似的佐劑可激活各自的受體，從而刺激先天免疫。而單磷酰脂類A引發(fā)Th1反應(yīng)，霍亂毒素刺激Th2反應(yīng)。Th1反應(yīng)涉及細(xì)胞介導(dǎo)的免疫，而Th2細(xì)胞激活體液反應(yīng)以中和細(xì)胞外抗原。

2 佐劑的作用方式

佐劑可通過免疫調(diào)節(jié)、抗原提呈、靶向作用、抗原儲(chǔ)存作用以及誘導(dǎo)CD8+細(xì)胞毒T細(xì)胞應(yīng)答中的一種或幾種來發(fā)揮作用。不同類型的佐劑其作用方式不同導(dǎo)致了免疫調(diào)節(jié)能力的差異性。

2.1 抗原儲(chǔ)存作用 如明礬或油基乳劑這樣的佐劑為短期儲(chǔ)存抗原，具有緩慢釋放抗原和抗降解作用，從而達(dá)到持久刺激免疫系統(tǒng)，通過靶向抗原至APC顯示其佐劑活性，導(dǎo)致主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）分子增強(qiáng)抗原在APC上的提呈，并刺激適應(yīng)性免疫反應(yīng)［7］。然而，佐劑在增強(qiáng)MHC分子抗原提呈以促進(jìn)適應(yīng)性免疫反應(yīng)中的作用尚未得到明確評(píng)價(jià)。

2.2 免疫調(diào)節(jié)作用 免疫調(diào)節(jié)佐劑指先于或同時(shí)與抗原免疫機(jī)體時(shí)，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗原的特異性免疫應(yīng)答，并通過細(xì)胞因子觸發(fā)免疫系統(tǒng)。首先，佐劑通過增加某些細(xì)胞因子的濃度而降低其他細(xì)胞因子的濃度來影響免疫類型［8］。IFNγ、IL-2和IL-12與Th1應(yīng)答和細(xì)胞介導(dǎo)免疫相關(guān)，而IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13與Th2應(yīng)答和體液免疫相關(guān)?？ń槊纭⒓?xì)菌內(nèi)毒素、脂質(zhì)A衍生物、單磷酰脂質(zhì)A通過刺激Th1反應(yīng)發(fā)揮作用［9］。

2.3 靶向作用 含糖類佐劑如皂苷、殼聚糖、中藥多糖等具有通過APC向免疫效應(yīng)細(xì)胞提呈抗原的能力。將免疫原吸附于殼聚糖聚合物或其他糖類時(shí)，可增加抗原對(duì)巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的傳送。殼聚糖及衍生物作為佐劑對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用主要表現(xiàn)在：增強(qiáng)疫苗的穿透、吸收和保護(hù)作用；免疫刺激性活動(dòng)。殼聚糖的胺基在酸性介質(zhì)中帶正電荷，并與帶負(fù)電荷的黏膜表面或其他大分子（如遺傳物質(zhì)）產(chǎn)生強(qiáng)烈的靜電作用?；跉ぞ厶堑淖魟┫到y(tǒng)已被證明具有15種黏液黏附性質(zhì)，并具有獨(dú)特的能力，可打開上皮細(xì)胞間的緊密連接，并通過另一種有效的抗原傳遞途徑促進(jìn)抗原轉(zhuǎn)運(yùn)，從而刺激強(qiáng)大的黏膜免疫反應(yīng)。大量研究證實(shí)，殼聚糖的黏附特性能夠延長(zhǎng)制劑在黏膜部位的停留時(shí)間，包括鼻黏膜、胃腸道和生殖道黏膜［10-11］。細(xì)菌菌殼（bacterial ghost，BG）是一種具有顯著天然佐劑特性的疫苗傳遞系統(tǒng)。BG是革蘭陰性菌的空細(xì)菌殼，缺乏細(xì)胞質(zhì)，但保留了其表面形態(tài)和結(jié)構(gòu)特征［12］。專業(yè)的APC可通過模式識(shí)別受體識(shí)別BG的表面成分，使其成為通過口腔、眼、鼻或氣道黏膜給藥的理想系統(tǒng)。疫苗佐劑和給藥系統(tǒng)是通過黏膜途徑在體內(nèi)誘導(dǎo)有效免疫反應(yīng)的最佳選擇。殼聚糖衍生物納米顆粒是最有前途的黏膜疫苗載體，可保護(hù)抗原不被降解，增加抗原在黏膜表面的停留時(shí)間，通過配體受體相互作用將抗原靶向至M細(xì)胞，在免疫系統(tǒng)中大量遞送抗原，有效誘導(dǎo)系統(tǒng)和黏膜免疫［13］。

3 納米粒子表面修飾及其在疫苗佐劑中的應(yīng)用

納米粒子是指粒度1～1 000 nm的顆粒，具有相鄰的界面層［14］。納米材料具有良好的生物相容性、黏膜吸附性、生物降解性、易加工和修飾、促進(jìn)功能分子進(jìn)入細(xì)胞、保護(hù)DNA和蛋白質(zhì)不被降解等優(yōu)點(diǎn)。通過物理、化學(xué)方法對(duì)粒子表面進(jìn)行改性，改善了納米粒子的分散性，提高了微粒表面活性，使微粒表面產(chǎn)生新的性能。納米技術(shù)在醫(yī)學(xué)中的出現(xiàn)改善了藥物的溶解性、膜滲透性、藥物靶向性和控釋性［15-16］。但在復(fù)雜的生物系統(tǒng)中，納米醫(yī)學(xué)面臨著清除速度快、缺乏適當(dāng)?shù)南嗷プ饔谩⒎翘禺惏邢蛐?、無法進(jìn)入靶細(xì)胞和組織核心等障礙［17-18］。因此，粒子的表面修飾為專門定制功能和開發(fā)智能納米粒子提供了另一個(gè)控制維度。

3.1 金屬納米棒表面修飾 為增強(qiáng)疫苗引發(fā)的免疫應(yīng)答，通過使用能激活免疫細(xì)胞的化學(xué)分子對(duì)納米材料進(jìn)行表面修飾。疫苗引發(fā)的免疫不僅依賴于抗原的攝取，還依賴于免疫細(xì)胞的激活。激活的免疫細(xì)胞會(huì)引發(fā)更強(qiáng)的免疫反應(yīng)。納米銀是目前報(bào)道的唯一可以抑制HIV的納米材料，LIU等［19］基于銀納米棒對(duì)其進(jìn)行聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和聚乙二醇（PEG）表面修飾，可顯著提高HIV疫苗的關(guān)鍵免疫能力。雖然單獨(dú)使用PVP或?qū)ζ溥M(jìn)行表面修飾均能在體外有效激活免疫細(xì)胞，但納米材料表面修飾可形成多價(jià)效應(yīng)，促進(jìn)分子的功能。因此與單獨(dú)使用PVP相比，PEG修飾的PVP納米材料能更好地增強(qiáng)免疫應(yīng)答，延長(zhǎng)了納米材料在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間，優(yōu)化了材料的生物相容性。通過對(duì)納米材料進(jìn)行表面修飾以達(dá)到預(yù)期的免疫調(diào)節(jié)功能，從而優(yōu)化疫苗誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)。MI等［20］首次提出添加葉酸的金納米棒在較低電場(chǎng)強(qiáng)度下可實(shí)現(xiàn)更高的抗瘤效果。葉酸對(duì)具有良好生物相容性的PEG-金納米棒表面進(jìn)行進(jìn)一步修飾，可對(duì)A375黑素瘤細(xì)胞進(jìn)行特異性靶向識(shí)別，有效抑制黑色素瘤的增殖。

3.2 聚合物納米粒子 聚乳酸-乙醇酸（PLGA）納米粒子和表面修飾的PLGA納米粒子因其可控釋放特性和生物相容性而被廣泛用作抗原或藥物載體［21］。然而，大多數(shù)PLGA納米顆粒的抗原加載效率和調(diào)節(jié)能力較低。表面陽離子聚合物修飾可通過表面吸附提高PLGA納米粒子的抗原加載效率［22］。WUSLMAN等［23］和LIU等［24］研究了殼聚糖修飾的PLGA納米粒子（CS-AHPP／OVA）、聚乙烯亞胺修飾的PLGA納米粒子（PEI-AHPP／OVA）和ε-聚-L-賴氨酸修飾的PLGA納米粒子（εPL-AHPP／OVA）。通過對(duì)表面陽離子聚合物改性后，AHP和OVA負(fù)載的PLGA納米粒子（AHPP／OVA）帶正電荷，并保持了結(jié)構(gòu)完整性。通過表面陽離子聚合物改性，改善了其抗原負(fù)載能力和納米粒子的穩(wěn)定性，增加的正表面電荷導(dǎo)致更大的OVA吸附能力。AHPP／OVA、CS-AHPP／OVA、PEI-AHPP／OVA和εPL-AHPP／OVA制劑顯著促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖并增加了CD4+／CD8+T細(xì)胞的比例。此外，AHPP／OVA、PEI-AHPP／OVA和εPL-AHPP／OVA制 劑 誘 導(dǎo) 了 細(xì) 胞 因 子（TNF-α、IFNγ、IL-4和IL-6）抗體（IgG）和抗體亞型的分泌（免疫小鼠中的IgG1和IgG2a）。表明以上制劑產(chǎn)生了強(qiáng)烈的Th1偏向免疫應(yīng)答。

3.3 脂質(zhì)體 傳統(tǒng)脂質(zhì)體的局限性之一是其在血液中的循環(huán)時(shí)間短，因?yàn)橐妆粰z測(cè)為外來物質(zhì)，并被免疫系統(tǒng)降解。研究發(fā)現(xiàn)，葉酸、多肽、蛋白、糖基作為配體對(duì)脂質(zhì)體進(jìn)行表面修飾時(shí)，可增強(qiáng)脂質(zhì)體穩(wěn)定性，延長(zhǎng)其在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間，提高生物利用度［25］。OBEROI等［26］證明，包含TLR4激動(dòng)劑CRX-601佐劑的PEG修飾的脂質(zhì)體與甲基乙二醇?xì)ぞ厶墙M合，可增強(qiáng)鼠對(duì)流感疫苗免疫的舌下免疫反應(yīng)。在鼠流感疫苗模型中，研究者通過對(duì)脂質(zhì)體進(jìn)行磷脂-PEG共軛物和殼聚糖表面修飾，使機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，與未修飾的脂質(zhì)體相比，攜帶CRX-601佐劑表面修飾的脂質(zhì)體疫苗可顯著改善流感特異性應(yīng)答，實(shí)現(xiàn)強(qiáng)效的黏膜和全身免疫反應(yīng)。HAERI等［27］通過對(duì)脂質(zhì)體進(jìn)行表面改性，如PEG脂質(zhì)體、配體靶向脂質(zhì)體和多功能脂質(zhì)體，克服了傳統(tǒng)脂質(zhì)體缺陷。在腫瘤疫苗佐劑應(yīng)用中能夠靶向病變細(xì)胞，具有高度的特異性，從而避免損傷健康組織。

3.4 聚多巴胺修飾的納米顆粒 近年來，聚多巴胺（PDA）的發(fā)現(xiàn)為納米顆粒作為藥物載體的表面功能化和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用提供了新的思路。其聚合產(chǎn)物PDA能夠附著在幾乎所有材料表面，包括金屬、陶瓷、半導(dǎo)體和合成聚合物［28］。PDA改性使納米顆粒具有更強(qiáng)的親水性、良好的生物相容性、適當(dāng)?shù)纳锝到庑?、?qiáng)的光熱轉(zhuǎn)換能力和活性氧清除能力。因其獨(dú)特的多功能，PDA修飾的納米顆粒在腫瘤治療、抗菌、疫苗和佐劑、組織修復(fù)等領(lǐng)域引起了廣泛關(guān)注［29］。LIU等［30］通過對(duì)聚乳酸-乙醇酸聚合物進(jìn)行PDA表面修飾使聚乳酸-乙醇酸聚合物具有模擬病原體的結(jié)構(gòu)，這種新型疫苗佐劑增強(qiáng)了細(xì)胞因子的分泌和免疫細(xì)胞的招募，在體內(nèi)可誘導(dǎo)更強(qiáng)的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。

4 小結(jié)與展望

佐劑的使用是提高亞單位疫苗免疫原性的理想方式。納米粒子的表面修飾是對(duì)佐劑的免疫調(diào)節(jié)和靶向作用進(jìn)行優(yōu)化的良好策略。納米顆粒的大小和形態(tài)在抗原的傳遞中起重要作用，也極大影響了顆粒在體內(nèi)的分布。通過控制納米顆粒的尺寸、形狀和表面特性，以及控制反應(yīng)條件等方法優(yōu)化納米粒子，在不引起副作用和毒性的基礎(chǔ)上增強(qiáng)免疫反應(yīng)，才能將佐劑應(yīng)用于臨床和實(shí)現(xiàn)商品化。