王 瑾,孫鳳娟,王 飛,王紅梅,高潤利

(1.國民核生化災(zāi)害防護(hù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102205; 2.陸軍裝備部裝備項(xiàng)目管理中心，北京 100072)

有機(jī)磷農(nóng)藥(organophosphorus pesticides，OPP)和有機(jī)磷神經(jīng)性毒劑(organophosphorus nerve agents，OPNAs)屬于有機(jī)磷領(lǐng)域中重要的兩類化合物，主要通過不可逆抑制膽堿酯酶(cholinesterase，ChE)活性，使神經(jīng)突觸內(nèi)乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)過度蓄積，神經(jīng)系統(tǒng)的傳導(dǎo)功能受損，進(jìn)而產(chǎn)生一系列的毒害作用。OPP的毒性較低，因具有高效、便宜、對(duì)植物安全等優(yōu)勢，用于殺蟲、滅菌、除草等。OPNAs是由OPP發(fā)展而來的具有速效致死性的膦酸酯類物質(zhì)，典型代表有G類毒劑，如塔崩(GA)、沙林(GΒ)、梭曼(GD)、環(huán)沙林(GF)和V類毒劑，如維?？怂?VX)，這些毒劑曾作為化學(xué)武器被應(yīng)用于一戰(zhàn)、二戰(zhàn)和多次恐怖活動(dòng)中[1-2]。

OPP和OPNAs可以通過呼吸道、皮膚黏膜、眼睛、胃腸道等多種途徑進(jìn)入生物體，經(jīng)過迅速的分布、代謝，最終以原體、代謝物、蛋白質(zhì)加合物3種形式存在，并對(duì)生物體的健康產(chǎn)生短期或長期的影響，包括:①急性膽堿能毒性：蓄積的ACh對(duì)膽堿能受體(煙堿受體和毒蕈堿受體)過度刺激所產(chǎn)生的縮瞳、流涎、心動(dòng)過急或過緩等癥狀；②中間綜合征：急性或重度的OP中毒引發(fā)的神經(jīng)肌肉接頭功能障礙，如呼吸肌、骨骼肌麻痹；③遲發(fā)性神經(jīng)病(organophosphate delayed neuropathy，OPIDN)：單次或反復(fù)暴露于OP毒物導(dǎo)致的遲發(fā)性中央-外周遠(yuǎn)端感覺-運(yùn)動(dòng)多神經(jīng)病，有感覺障礙、共濟(jì)失調(diào)、肌無力等表現(xiàn)；④慢性神經(jīng)毒性：單次急性或多次低劑量暴露于OP毒物所引發(fā)的慢性神經(jīng)行為改變，如學(xué)習(xí)記憶能力下降、情感障礙等[3]。

鑒于OPP/OPNAs的原體、代謝物在生物體內(nèi)有穩(wěn)定性差、存續(xù)時(shí)間短、降解速度快等諸多不足，OP毒性機(jī)制的研究焦點(diǎn)已經(jīng)轉(zhuǎn)移至蛋白加合物。本文將諸多研究中涉及到的靶標(biāo)蛋白分為兩類：內(nèi)源性清道夫(丁酰膽堿酯酶(butyrylcholinesterase，BChE)、白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白)和低劑量毒性的相關(guān)蛋白(細(xì)胞骨架蛋白、神經(jīng)病靶標(biāo)酯酶、泛素)，綜述OPP/OPNAs與這些靶蛋白之間的共價(jià)加合物、加合反應(yīng)機(jī)理、活性位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)特征，旨在為OP毒物的確認(rèn)暴露、溯源歸因、精準(zhǔn)治療、合理預(yù)防等提供新的研究思路。

1 OPP/OPNAs中毒機(jī)制

OPP/OPNAs對(duì)生物體產(chǎn)生急性毒性作用的原因是AChE的活性被抑制。AChE主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的突觸內(nèi)和外周神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)肌肉連接處，少量與血液中紅細(xì)胞的膜結(jié)合。它能夠快速水解神經(jīng)遞質(zhì)ACh，終止ACh對(duì)突觸后膜的興奮作用，從而保證神經(jīng)信號(hào)在生物體內(nèi)的正常傳遞[4]。此過程依賴于AChE的活性位點(diǎn)：催化三聯(lián)體(Ser203-His447-Glu334)和外周陰離子位點(diǎn)，底物ACh的季銨離子通過靜電作用結(jié)合在AChE的陰離子結(jié)合位點(diǎn)，其羰基碳與AChE的絲氨酸殘基Ser203的羥基相互作用，經(jīng)乙?；腿ヒ阴；h(huán)水解ACh[5]。

作為ACh水解過渡態(tài)的結(jié)構(gòu)類似物，OPP和OPNAs是AChE的高效抑制劑。OPP/OPNAs進(jìn)入生物體后，磷原子與絲氨酸側(cè)鏈的羥基共價(jià)結(jié)合生成磷/膦?；腁ChE，使AChE喪失水解ACh的功能。與乙酰化的AChE能夠快速水解不同，磷/膦?；腁ChE的水解非常緩慢，致使AChE的活性受到抑制，ACh在體內(nèi)過度蓄積并持續(xù)作用于膽堿能受體：毒蕈堿和煙堿受體，超過50%的AChE被抑制后會(huì)出現(xiàn)膽堿能危象，如嘔吐、腹痛、腹瀉、瞳孔縮小、多汗、流涎、心率減慢、肌肉痙攣等，嚴(yán)重者甚至?xí)?dǎo)致死亡[6]。

不同物種間或同一物種的不同部位間的AChE具有高度保守性，OP毒物對(duì)AChE的抑制作用與物種、年齡無關(guān)。OPP/OPNAs進(jìn)入生物體后會(huì)迅速分布于各個(gè)器官如腦、肺、心、肝、腎，并穩(wěn)定存在，其中肺的攝取率最高，這似乎間接解釋了為什么OP患者中毒死亡的直接原因是呼吸衰竭。此外，研究發(fā)現(xiàn)OP毒物的體循環(huán)量與AChE的濃度呈負(fù)相關(guān)，循環(huán)量過高會(huì)誘發(fā)膽堿能綜合征，伴有呼吸窘迫、高血壓等癥狀[7]。同時(shí)，神經(jīng)元的鈣瞬變?cè)黾雍外}的高表達(dá)會(huì)造成神經(jīng)元過度活化，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)元損傷，出現(xiàn)癲癇或永久性認(rèn)知障礙。磷/膦?；腁ChE的重活化有兩種途徑：歷經(jīng)緩慢的自發(fā)水解或活化劑的重活化。肟類重活化劑能夠復(fù)能磷/膦酰化ChE，與蓄積的ACh競爭膈肌煙堿型乙酰膽堿受體，從而保護(hù)呼吸肌纖維免受OP毒物的損傷[8-9]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)其有擬膽堿酯酶作用，可水解ACh，但也存在諸多局限性：① 重活化作用具有選擇性：對(duì)敵敵畏、對(duì)硫磷、甲胺磷等中毒酶有較好的重活化作用，而對(duì)樂果、敵百蟲和馬拉硫磷等中毒酶的重活作用較差，GD中毒酶的重活效果更差[8]；② OP-AChE老化后AChE的活性不能再恢復(fù)，OPP/OPNAs與絲氨酸殘基之間的共價(jià)加合物易發(fā)生脫烷基形成單陰離子加合物，與OP毒物的磷原子上的取代基帶電性一致，阻礙了AChE的再活化進(jìn)程；③ 常見的肟類藥物為季銨化合物，不易透過血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)，僅對(duì)外周組織中的AChE有重活化效果；④ 腎排泄快，需根據(jù)病情和半衰期重復(fù)給藥。目前，最有效的活化劑是親核吡啶鎓肟，但吡啶鎓環(huán)中的季氮原子帶有的永久性的正電荷會(huì)阻止肟穿過BBB，無法恢復(fù)大腦正常的膽堿能功能。研究發(fā)現(xiàn)[9]，叔肟單異亞硝基丙酮能激活中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的AChE，治療后患者具有更高的存活率和更低的發(fā)病率，但具體的活化作用還需進(jìn)一步研究確認(rèn)。

2 內(nèi)源性清道夫

在生物體內(nèi)有這樣的一類蛋白：OPP/OPNAs的磷/膦酰化修飾似乎并沒有對(duì)其造成明顯的不良影響，它依舊保持最初的生物學(xué)功能，參與機(jī)體正常的代謝過程。隨著蛋白的自身降解，有毒的OPP/OPNAs排出體外，這類蛋白包括BChE、白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白等，屬于內(nèi)源性清道夫，通過與OPP/OPNAs共價(jià)結(jié)合來幫助機(jī)體清除毒物。對(duì)這些內(nèi)源性清道夫的加合物進(jìn)行研究，深入理解其加合位點(diǎn)、作用機(jī)制、周圍環(huán)境，對(duì)OP毒性的預(yù)防和抗OP毒性藥物的研發(fā)具有一定的啟示作用。

2.1 OPP/OPNAs與BChE的加合反應(yīng)BChE主要分布于血清和肝臟中，肌肉和腦組織中也有少量存在[10]。因同屬于絲氨酸水解酶家族，BChE與AChE具有相似的結(jié)構(gòu)特征：氨基酸序列的高度同源性、活性部位催化三聯(lián)體(Ser198-His438-Glu325)和外周陰離子部位、相似的三維結(jié)構(gòu)、具有芳香氨基酸殘基。BChE催化水解丁酰膽堿(butyrylcholine，BCh)，其絲氨酸的羥基攻擊BCh的羰基碳，與丁?；矁r(jià)結(jié)合并釋放膽堿，隨后丁?；杆忉尫哦∷幔珺ChE恢復(fù)活性。

OPP/OPNAs對(duì)BChE的抑制作用與AChE類似，即OP毒物的磷原子與Ser198的羥基共價(jià)結(jié)合生成OP-BChE加合物。不同的是，OP-BChE加合物僅起到中和毒物的作用，對(duì)機(jī)體沒有任何不良影響。研究表明，BChE與OP毒物的結(jié)合速率比AChE高，因血液中的高豐度、較長的半衰期、高反應(yīng)性以及顯著的排毒功效，BChE被認(rèn)為是最有效的生物清除劑，而人血漿中BChE的濃度約50nmol/L，不足以抵消高濃度的OPP/OPNAs。因此，OP毒性的防治常常采用外源性的BChE來實(shí)現(xiàn)[11]。此外，BChE也能催化水解ACh，但由于底物特異性和水解能力的差異性，反應(yīng)進(jìn)行緩慢。當(dāng)AChE活性受到抑制時(shí)，BChE能代替AChE水解突觸后膜上過量的ACh或參與調(diào)節(jié)突觸前膜ACh的釋放過程。不足的是，這一過程只存在于周圍神經(jīng)系統(tǒng)中，無法降低中樞神經(jīng)系統(tǒng)中ACh的含量，故AChE被抑制時(shí)仍會(huì)出現(xiàn)膽堿能功能異常。

OPP/OPNAs進(jìn)入生物體后，BChE的活性位點(diǎn)Ser198的羥基對(duì)OP毒物的磷原子進(jìn)行親核攻擊，生成磷/膦?；疊ChE。因此，可以通過鑒定體內(nèi)的BChE加合物來判斷OP的暴露。染毒后的BChE經(jīng)蛋白酶酶解獲得含有Ser198位點(diǎn)的肽段：胃蛋白酶酶解后的九肽加合物和胰蛋白酶酶解后的二十九肽加合物，兩種均可用于OP毒物的生物檢測，但相比于九肽加合物，二十九肽加合物因肽段分子量大，含有的氨基酸殘基多，觀察完整的y系列或b系列碎片離子以確定修飾位點(diǎn)的難度增加，所以修飾的FGESAGAAS肽段是檢測OP暴露的生物標(biāo)志物[12]。然而，BChE加合物的檢測存在局限性：① OP-BChE加合物存在老化現(xiàn)象，且老化速度比AChE加合物快。老化后的BChE加合物缺少烷氧基的信息，無法對(duì)去烷基化后具有相同結(jié)構(gòu)的OP毒物進(jìn)行溯源。例如GB、GF、VX、VM和VR均含有甲基膦鍵，與被修飾的BChE生成老化的甲基膦酸標(biāo)志物；VE的結(jié)構(gòu)中含有乙基膦鍵，VE-BChE生成老化的乙基膦酸標(biāo)志物；僅有甲基-、乙基-OPNAs類似物，如丙基沙林與BChE生成老化的丙基膦酸標(biāo)志物。雖然甲基-、乙基-、丙基膦酸酯是OPNAs特有的，但仍無法對(duì)老化的OP毒物準(zhǔn)確溯源；而對(duì)于常見的OPP，BChE加合物的OP毒性溯源似乎格外高效：O-甲醇酸酯和敵敵畏分別形成磷酸單甲氧基-、磷酸二甲氧基-BChE加合物；二嗪農(nóng)生成二乙氧基硫代磷酸標(biāo)志物，經(jīng)硫醇-硫酮互變異構(gòu)獲得的二嗪農(nóng)異構(gòu)體，與BChE共價(jià)結(jié)合生成一乙-、二乙氧基磷酸加合物。② 磷/膦酰化的BChE可經(jīng)親核試劑(如肟)作用重新活化，加合物結(jié)構(gòu)的破壞會(huì)影響對(duì)OP暴露的判斷，而肟無法恢復(fù)老化的BChE的活性，因此設(shè)計(jì)有效的烷基化劑是應(yīng)對(duì)BChE加合物老化的重要途徑之一，但該領(lǐng)域的相關(guān)研究尚少[13]。

2.2 OPP/OPNAs與白蛋白的加合反應(yīng)白蛋白是由肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞合成，在血漿中的半衰期約20 d，是血漿中含量最高的蛋白質(zhì)，在維持膠體滲透壓、運(yùn)輸營養(yǎng)和排除毒素等方面具有重要作用。1963年，桑格對(duì)標(biāo)記肽進(jìn)行氨基酸測序，證明二異丙氧基氟磷酸酯(diisopropoxy fluorophosphate，DFP)可以標(biāo)記人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)的酪氨酸殘基。此后，除絲氨酸水解酶之外，白蛋白逐漸成為探究OP毒物生物標(biāo)志物的重要靶標(biāo)。

相比于BChE加合物，OP-白蛋白加合物具有諸多優(yōu)勢：①白蛋白的OP解毒作用強(qiáng)，同樣作為OP清道夫，血液中白蛋白的濃度是BChE的10000倍，彌補(bǔ)了反應(yīng)速度慢的不足，可以通過與磷原子共價(jià)結(jié)合清除體內(nèi)的OP毒物。②白蛋白的半衰期較長，意味著OP-白蛋白加合物在體內(nèi)的保留時(shí)間比OP-BChE長，為OP暴露提供更好的檢測窗。③OP-白蛋白加合物更穩(wěn)定，而OP-BChE易老化。BChE具有活性部位催化三聯(lián)體，其中絲氨酸殘基Ser198與OP上的磷原子共價(jià)結(jié)合，附近的組氨酸和谷氨酸會(huì)催化BChE加合物的老化過程，而白蛋白的活性部位不存在促進(jìn)衰老的氨基酸殘基。④OP-白蛋白加合物的應(yīng)用范圍廣。BChE加合物的研究沒有廣譜性，因?yàn)榕?、山羊、綿羊的血液中沒有BChE，大鼠血液中的BChE含量低，而所有哺乳動(dòng)物的血漿中都存在白蛋白，更具有研究價(jià)值。白蛋白與OPP/OPNAs發(fā)生親核反應(yīng)，共鑒定出3種磷/膦?；揎椀陌被釟埢豪野彼釟埢①嚢彼釟埢?、絲氨酸殘基，它們的共性特征是具有親核側(cè)鏈，氨基酸殘基的ε側(cè)鏈進(jìn)攻OPP/OPNAs上的磷原子形成OP-白蛋白加合物。OPP/OPNAs與不同的殘基的ε側(cè)鏈共價(jià)連接時(shí)，插入的位點(diǎn)也不同，例如GB的O-異丙基甲基磷酸酯分別被加到了酪氨酸的ε-酚羥基、賴氨酸ε-氨基、絲氨酸的ε-羥基上[13-14]。

2.2.1OP-酪氨酸加合物 酪氨酸殘基可以被多種OP毒物磷/膦酰化修飾，如DFP與菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋清溶菌酶上的酪氨酸殘基共價(jià)結(jié)合；OPP(對(duì)硫磷、敵敵畏、毒死婢、馬拉硫磷、丙胺磷、DFP)、OPNAs(GB、GD)與HSA、純小鼠白蛋白的酪氨酸(tyrosine，Tyr)411殘基共價(jià)連接。FP-生物素對(duì)牛血清白蛋白磷?；揎椀幕钚晕稽c(diǎn)Tyr410，相當(dāng)于HSA的Tyr411。對(duì)特殊標(biāo)記的Tyr411深入研究，發(fā)現(xiàn)其pKa值(7.9-8.3)明顯低于酪氨酸殘基的平均水平(pKa=10)，解析加合物的晶體結(jié)構(gòu)時(shí)發(fā)現(xiàn)，該殘基與多個(gè)帶正電的基團(tuán)相鄰并處于非極性環(huán)境中，Tyr411的羥基臨近Arg410和Lys414的側(cè)鏈。將Tyr411定點(diǎn)突變?yōu)锳la時(shí)，白蛋白的活性消失，而將Arg410突變?yōu)锳la時(shí)，白蛋白的活性大大降低，說明Tyr411是HSA的活性位點(diǎn)，Arg410對(duì)穩(wěn)定其高反應(yīng)性具有重要作用。據(jù)悉，Tyr411是最具高反應(yīng)性的殘基，分析蛋白加合物進(jìn)行OP溯源時(shí)，OP毒物中不同的離去基團(tuán)會(huì)影響OP檢測限，例如對(duì)硫磷、毒死婢很容易確定到1 μmol·L-1的暴露水平，丙胺磷在高水平(1 mmol·L-1)下可以檢測樣本，但預(yù)估能夠達(dá)到1 μmol·L-1的檢測水平，而馬拉硫磷的檢測限為1 mmol·L-1，提示相比于其余3種OPP的酚羥基離去基團(tuán)，馬拉硫磷的硫醇基團(tuán)與Tyr411有較低的反應(yīng)性。除Tyr411外，HSA中的Y263也具有高反應(yīng)性，能夠同時(shí)被6種OPNAs(GA、GB、GD、GF、VX及其異構(gòu)體)共價(jià)修飾。對(duì)Y263的空間結(jié)構(gòu)及電子效應(yīng)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)Y263較大的溶劑可及性(%SAS)，增加了與OPNAs發(fā)生碰撞的機(jī)會(huì)，離子對(duì)(與距離4.21 ?的K233形成的離子對(duì))和非共價(jià)相互作用(酚羥基與距離2.89 ?的E230形成氫鍵)在穩(wěn)定加合物中具有關(guān)鍵作用。HSA上有關(guān)活性位點(diǎn)Tyr411和Y263的研究啟示：OPP/OPNAs與殘基的共價(jià)結(jié)合與OP毒物的離去基團(tuán)、活性位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)和周圍環(huán)境有關(guān)[15]。此外，殘基離子化也會(huì)影響加合反應(yīng)，F(xiàn)P-生物素在pH 8.0～8.3下高劑量染毒HSA并延長染毒時(shí)間，發(fā)現(xiàn)90%結(jié)合在Tyr411，其余10%標(biāo)記在其它殘基上，如絲氨酸，研究其特殊反應(yīng)性，發(fā)現(xiàn)酪氨酸羥基的pKa低于絲氨酸羥基(pKa：10.1<16)，同時(shí)，由于周邊的精氨酸或賴氨酸對(duì)酪氨酸或絲氨酸的離子化羥基的穩(wěn)定作用，導(dǎo)致離子化的酪氨酸比例遠(yuǎn)高于絲氨酸，使酪氨酸更容易發(fā)生加合反應(yīng)且加合比例更大。

2.2.2OP-賴氨酸加合物 OPP/OPNAs對(duì)賴氨酸殘基的磷/膦酰化修飾是基于賴氨酸的ε-氨基對(duì)OP毒物上磷原子進(jìn)行親核攻擊，然后在ε-氨基上加一個(gè)有機(jī)磷部分，例如毒死婢和DFP與HSA發(fā)生親核反應(yīng)，分別得到二乙氧基-和二異丙氧基-磷酰化賴氨酸[16]。GA對(duì)體外(牛、卵磷脂、大鼠、兔)純白蛋白和體內(nèi)(卵磷脂、大鼠、兔)白蛋白的膦?；揎?，發(fā)現(xiàn)體內(nèi)外有相似的被修飾的肽序列，且在不同物種中均保持穩(wěn)定。GA-卵磷脂加合物的形成是源于賴氨酸側(cè)鏈的氮原子對(duì)GA上磷原子的親核攻擊，膦?；臍埢ǔ４嬖谟诎椎鞍椎谋砻婊蚋浇目涨粌?nèi)，具有較低的PKa值和CDOCKER相互作用能。CDOCKER相互作用能越低表示加合物越穩(wěn)定，如體內(nèi)的活性位點(diǎn)K414與GA之間的加合物具有較強(qiáng)的結(jié)合能(-24.3242 kcal/mol)，穩(wěn)定性較強(qiáng)，而未標(biāo)記的賴氨酸殘基的CDOCKER相互作用能較高[17]。此外，膦?；馁嚢彼釟埢姆磻?yīng)性同樣受到氫鍵、靜電作用、電子對(duì)的影響，如GA靠近HSA上的K525時(shí)，氮原子與K525和Y401的側(cè)鏈形成氫鍵，碳原子與F551的側(cè)鏈形成H-π共軛，這兩個(gè)因素有助于增強(qiáng)GA-K525的疏水性，降低親水性和GA與K525親核反應(yīng)能，使加合物更加穩(wěn)定[9]。提示可以通過誘變或化學(xué)修飾鄰位殘基來改變周圍環(huán)境，降低氨基酸殘基的pKa，從而增加OP與白蛋白的反應(yīng)性。不同物種的氨基酸序列顯示兔血清白蛋白(rabbit serum albumin，RSA)與HSA的序列同源性高達(dá)76.03%，高于常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大小鼠。GD對(duì)RSA、兔血漿染毒發(fā)現(xiàn)存在GD-賴氨酸加合物，而兔體內(nèi)膦?；臍埢鶅H發(fā)現(xiàn)賴氨酸，因體內(nèi)GD的暴露劑量遠(yuǎn)低于體外，在未使用過量毒物的情況下，賴氨酸殘基優(yōu)先被標(biāo)記，推斷RSA體內(nèi)賴氨酸殘基比酪氨酸、絲氨酸的反應(yīng)性更高，可能的原因有：①賴氨酸是堿性氨基酸，其側(cè)鏈易解離并帶有正電荷，增強(qiáng)了親核活性；②賴氨酸ε-氨基優(yōu)先與GD形成加合物，而非酪氨酸的ε-酚羥基、絲氨酸的ε-羥基，可能是其官能團(tuán)賦予其這種特性[7]。

2.2.3OP-其他氨基酸加合物 在沒有活性位點(diǎn)絲氨酸的蛋白中，酪氨酸和賴氨酸的反應(yīng)性比絲氨酸大。當(dāng)實(shí)驗(yàn)條件加大，如增加OP毒物濃度、延長染毒時(shí)間等，就會(huì)出現(xiàn)OPP/OPNAs與絲氨酸殘基的加合現(xiàn)象，但絲氨酸加合物的穩(wěn)定性遠(yuǎn)低于酪氨酸加合物，同樣在pH8.3的條件下溫育，一個(gè)月后仍能觀察到被OP修飾的酪氨酸，而OP-絲氨酸加合物早已不見蹤影，這可能由于：①OP-絲氨酸容易進(jìn)行β消除以釋放有機(jī)磷部分，只剩下脫氫丙氨酸，而OP-酪氨酸并未發(fā)現(xiàn)釋放有機(jī)磷?；糠值淖C據(jù)。②OP-絲氨酸可以輕松去除有機(jī)磷部分，導(dǎo)致肽的質(zhì)譜圖中沒有特征性片段，而OP-酪氨酸相對(duì)穩(wěn)定的產(chǎn)生大量的特征性片段，為OP標(biāo)記的酪氨酸的存在提供證據(jù)[18]。膦?；慕z氨酸位點(diǎn)同樣有其結(jié)合特征，HSA上的K*VPQVSTPTLVEVSR肽段上的S419與結(jié)構(gòu)相似的GB和GF有較強(qiáng)的親和力，其中GB的磷原子與HSA中S419側(cè)鏈的氧原子形成共價(jià)鍵，同時(shí)，GB與HSA中K500側(cè)鏈的氮原子之間的氫鍵、與相鄰殘基之間較低的非共價(jià)結(jié)合能，均增加了GB-HSA的穩(wěn)定性。具有硫醇離去基團(tuán)的OP毒物，如V類OPNAs(VX、VR、Vs)和OPP(氧化氫-甲基、樂果、氧化樂果)能與HSA中唯一的非二硫鍵橋接的半胱氨酸殘基(Cys34)形成二硫加合物，它是通過游離的硫醇離去基團(tuán)或二硫鍵二聚體與Cys34之間進(jìn)行硫醇-二硫鍵交換形成的。以VX為例，VX的含硫離去基團(tuán)2-(二異丙基氨基)乙硫醇(2-(diisopropylamino)ethanethiol，DPAEP)與Cys34形成二硫加合物，酶解后會(huì)以半胱氨酸-脯氨酸二肽或三肽的形式釋放。這些毒物與白蛋白會(huì)形成兩個(gè)中心的加合物，一個(gè)是含硫中心的二硫加合物，一個(gè)是含磷中心的磷/膦酰化加合物，其中二硫加合物的靶向氨基酸為半胱氨酸，而磷/膦?；雍衔锏陌袠?biāo)主要為酪氨酸或賴氨酸。有一種觀點(diǎn)：磷/膦酰化的酪氨酸鄰近Cys34時(shí)有助于二硫加合物的形成。但在HSA的三維結(jié)構(gòu)中，沒有一個(gè)反應(yīng)性的酪氨酸(包括高反應(yīng)性的Tyr411)與Cys34接近，僅有Tyr84、Tyr140在Cys34附近，提示這兩種酪氨酸可能是OP毒物的潛在靶點(diǎn)。

2.3 OPP/OPNAs與轉(zhuǎn)鐵蛋白的加合反應(yīng)轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin，TRF)由肝細(xì)胞合成，是血漿中主要的含鐵蛋白，負(fù)責(zé)運(yùn)輸由消化管吸收的鐵和由紅細(xì)胞降解釋放的鐵。盡管轉(zhuǎn)鐵蛋白的半衰期僅有7 d，但因其胰蛋白酶酶解樣本在40℃的環(huán)境中可以保存一個(gè)月以上，同樣能作為檢測OP加合物的良好靶標(biāo)蛋白[19]。采用過量的OP毒物(GB、GA、VX、GD、GF、乙基塔崩、丙基塔崩)轉(zhuǎn)染人轉(zhuǎn)鐵蛋白，結(jié)合位點(diǎn)涉及3種類型的殘基：酪氨酸-、賴氨酸-和絲氨酸殘基，其中Y515位點(diǎn)同時(shí)被GB、GD、VX標(biāo)記，是轉(zhuǎn)鐵蛋白中最具反應(yīng)性的殘基，處于暴露狀態(tài)并與其他殘基之間存在氫鍵相互作用。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)OP與酪氨酸的結(jié)合似乎更傾向于附近有帶正電的精氨酸或賴氨酸，結(jié)合白蛋白中的標(biāo)記肽進(jìn)行研究：在pH=8.3的條件下，采用0.1、0.2 mmol·L-1的DFP、毒死婢和敵敵畏染毒兩條合成肽段ArgTyrThrArg和SerTyrSerMet，在ArgTyrThrArg肽段上發(fā)現(xiàn)酪氨酸加合物，而另一條肽段上沒有發(fā)現(xiàn)毒物標(biāo)記，將染毒濃度增加至1 mmol·L-1，質(zhì)譜中發(fā)現(xiàn)較弱的離子化肽，發(fā)現(xiàn)規(guī)律：位于帶正電荷的精氨酸或賴氨酸殘基附近的酪氨酸殘基通常具有高反應(yīng)性。當(dāng)轉(zhuǎn)鐵蛋白上的酪氨酸或賴氨酸被膦酰化后仍能與三價(jià)鐵離子結(jié)合并發(fā)生氧化還原反應(yīng)，表明轉(zhuǎn)鐵蛋白的生理功能不受加合物的影響。

3 低劑量毒性的相關(guān)蛋白

AChE的快速磷/膦?；浞纸忉屃薕PP/OPNAs的急性毒性作用。然而，當(dāng)確認(rèn)低劑量的OP毒物在未抑制AChE的情況下仍能產(chǎn)生神經(jīng)毒性，如頭痛，記憶力減退，學(xué)習(xí)能力差，睡眠困難，疲勞和肌肉無力時(shí)，提示有除抑制ChE之外的機(jī)制參與其中，而磷/膦?；揎椀陌椎鞍谆蜣D(zhuǎn)鐵蛋白并不能解釋低劑量毒性的由來，說明另有靶標(biāo)經(jīng)OPP/OPNAs修飾后對(duì)生物體的神經(jīng)功能造成損傷。但該領(lǐng)域進(jìn)展緩慢，目前尚不明確其發(fā)生機(jī)制。

3.1 OPP/OPNAs與細(xì)胞骨架蛋白的加合反應(yīng)據(jù)悉，低劑量的OP毒物干擾神經(jīng)發(fā)育的過程，如神經(jīng)元增殖、分化、凋亡、軸突發(fā)生、突觸形成，甚至神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的增殖、分化等。神經(jīng)元細(xì)胞骨架是由微管、微絲、中間絲構(gòu)成的蛋白纖維網(wǎng)架體系，在正常的神經(jīng)發(fā)育中至關(guān)重要，其骨架蛋白有望成為研究OP神經(jīng)毒性的重要靶標(biāo)[20]。

3.1.1OPP/OPNAs與微管蛋白的加合反應(yīng) 微管蛋白是微管的主要成分，包括3種：α-、β-、γ-微管蛋白，前兩種微管蛋白占總量的80%～95%，具有相似的三維結(jié)構(gòu)，能夠緊密結(jié)合形成二聚體并參與微管的組裝；γ-微管蛋白位于微管組織中心，對(duì)微管的形成、數(shù)量、位置及細(xì)胞分裂具有重要作用。微管蛋白聚合形成微管，參與營養(yǎng)物質(zhì)從神經(jīng)細(xì)胞體到神經(jīng)突觸的運(yùn)輸。有報(bào)道稱，易感動(dòng)物體在OP暴露后引起的OPIDN、認(rèn)知功能缺陷或與微管蛋白功能損壞、軸突運(yùn)輸中斷有關(guān)[21]。在FP-生物素染毒的活體小鼠的腦內(nèi)上清液中發(fā)現(xiàn)被標(biāo)記的分子量為55KDa的蛋白，質(zhì)譜鑒定該蛋白的主要成分為微管蛋白。隨后研究發(fā)現(xiàn)，OPP(毒死婢、DFP、FP-生物素)和OPNAs(GB、GD)能與牛微管蛋白(α-、β-微管蛋白)上的酪氨酸殘基和賴氨酸殘基共價(jià)結(jié)合，其中α-微管蛋白上的Tyr83和β-微管蛋白上的Tyr281暴露在微管蛋白二聚體的表面，與三磷酸鳥苷分子的鳥嘌呤部分具有π-π相互作用，二者的OP反應(yīng)性最高，且反應(yīng)速度也比其他氨基酸殘基快。同時(shí)，被標(biāo)記的微管蛋白聚合會(huì)形成異常短的微管，微管結(jié)構(gòu)改變，運(yùn)輸功能異常導(dǎo)致神經(jīng)傳遞和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能受損[22]。

3.1.2OPP/OPNAs與角蛋白的加合反應(yīng) 皮膚是OP毒物進(jìn)入生物體的重要途徑。研究表明，暴露于14C-VX環(huán)境中的家豬，皮膚內(nèi)會(huì)殘留約20%的放射性，明確了皮膚在OP暴露中的研究價(jià)值，而VX對(duì)人類皮膚的滲透性不及豬皮，會(huì)在更大面積的皮膚上擴(kuò)散，因此使用劑量的大部分會(huì)保留在施用部位的皮膚內(nèi)。FP-生物素與人角蛋白的加合物肽段THEN*FESFNNLR上的酪氨酸殘基Tyr230共價(jià)結(jié)合，肯定了皮膚內(nèi)蛋白加合物對(duì)檢測OP暴露、對(duì)OP歸因的可行性。皮膚中的角蛋白是中間絲的重要組成部分，主要存在于所有上皮細(xì)胞和部分非上皮細(xì)胞，用于維持細(xì)胞的形狀和抵抗外界的壓力。OPNAs(VX、DFP)和OPP(毒死婢、FP-生物素)與人足底的愈傷組織內(nèi)的角蛋白形成蛋白加合物，涉及酪氨酸殘基、絲氨酸殘基，而在毒死婢與角蛋白加合物的胰蛋白酶解片段中僅發(fā)現(xiàn)了被共價(jià)修飾的酪氨酸殘基，提示與酪氨酸相比，絲氨酸殘基對(duì)OP毒物的反應(yīng)性較低[23-24]。關(guān)于角蛋白的研究尚少，或許角蛋白的其他位點(diǎn)也被修飾，但因消化肽的含量太低、檢測水平有限而未發(fā)現(xiàn)。

3.1.3OPP/OPNAs與其他骨架蛋白的加合反應(yīng) 除微管蛋白、角蛋白外，微絲的主要構(gòu)成蛋白——肌動(dòng)蛋白加合物也被發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)P-生物素能夠標(biāo)記牛肌動(dòng)蛋白上的酪氨酸殘基(Tyr55、Tyr200)。據(jù)報(bào)道，大鼠重復(fù)暴露于閾值以下劑量的毒死婢或DFP中，其坐骨神經(jīng)中的順行性軸突運(yùn)輸受損。除微管蛋白外，與之相關(guān)的tau蛋白、驅(qū)動(dòng)蛋白分別參與軸突內(nèi)微管的組裝和穩(wěn)定、外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中軸突運(yùn)輸，同樣具有研究價(jià)值，例如DFP處理的母雞中tau蛋白磷酸化；對(duì)氧磷、毒死婢會(huì)直接影響驅(qū)動(dòng)蛋白，破壞微管內(nèi)依賴驅(qū)動(dòng)蛋白的運(yùn)輸。

3.2 OPP/OPNAs與神經(jīng)病靶標(biāo)酯酶的加合反應(yīng)神經(jīng)病靶標(biāo)酯酶(neuropathy target esterase，NTE)是一種只催化經(jīng)CDP-膽堿途徑合成卵磷脂的磷脂酶B，表達(dá)主要受卵磷脂、環(huán)腺苷酸、泛素-蛋白酶體途徑的調(diào)節(jié)，主要存在于哺乳動(dòng)物神經(jīng)細(xì)胞和非神經(jīng)細(xì)胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上[25-27]。據(jù)報(bào)道，OPIDN是由OP毒物對(duì)NTE的磷/膦?；鸬?。NTE屬于絲氨酸酯酶，與絲氨酸水解酶(AChE、BChE)的反應(yīng)機(jī)理相似，是OPs上的磷原子與NTE的活性位點(diǎn)絲氨酸Ser966共價(jià)結(jié)合抑制NTE的酶活性，隨后磷/膦?；腘TE發(fā)生老化：NTE上的OP部分的側(cè)鏈斷開，或OP基團(tuán)的去質(zhì)子反應(yīng)，只留下一個(gè)帶負(fù)電的取代基結(jié)合到酶的活性位點(diǎn)上，NTE的活性被永久抑制。在神經(jīng)元中，NTE的活性被抑制會(huì)破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜脂穩(wěn)態(tài)，而神經(jīng)軸突內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸都是靠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)完成的，這一過程會(huì)不可避免的遭受擾亂。在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中，NTE的抑制也會(huì)影響膜磷脂代謝，破壞神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞之間正常的相互作用。正常情況下，神經(jīng)元被一層神經(jīng)膠質(zhì)膜緊密包被時(shí)，神經(jīng)元會(huì)向其下游神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)出停止包被的信號(hào)，而NTE抑制后，中斷二者之間的相互作用，神經(jīng)元會(huì)被多層神經(jīng)膠質(zhì)膜松散的包被，繼而導(dǎo)致兩種細(xì)胞凋亡，遠(yuǎn)端軸突發(fā)生退變。此外，NTE有溶血磷脂酶的活性，對(duì)磷脂代謝具有重要作用。當(dāng)酶抑制，脊髓等部位的磷脂代謝和信號(hào)通路中斷，可能會(huì)造成遲發(fā)性毒性的發(fā)生。總之，OPs引起的NTE活性抑制會(huì)誘發(fā)以外周神經(jīng)變性為主要特征的OPIDN，期間NTE的生物功能喪失，神經(jīng)毒性作用產(chǎn)生。

3.3 OPP/OPNAs與泛素的加合反應(yīng)泛素(ubiquitin，Ub)是所有真核細(xì)胞中的一種小蛋白，游離存在于細(xì)胞內(nèi)或共價(jià)綴合到各種胞質(zhì)、核和整合的膜蛋白上，通過單泛素化或多泛素化底物蛋白參與細(xì)胞中的多種代謝過程，如細(xì)胞周期調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能、應(yīng)急反應(yīng)、DNA損傷修復(fù)等。Ub的氨基酸序列中包含賴氨酸、酪氨酸、蘇氨酸、絲氨酸殘基，是典型的磷酸化位點(diǎn)。然而，與V類毒劑一同孵育時(shí)，發(fā)現(xiàn)僅在賴氨酸殘基上形成蛋白加合物。正常PH條件下，暴露于蛋白表面的賴氨酸殘基側(cè)鏈上的氮原子會(huì)發(fā)生質(zhì)子化，無法再與親核試劑發(fā)生反應(yīng)。而膦?；馁嚢彼釟埢浇嬖谒嵝曰鶊F(tuán)谷氨酸，可以臨時(shí)接受其質(zhì)子，促進(jìn)加合物的生成[28]。事實(shí)上，暴露于蛋白表面的7個(gè)賴氨酸殘基中，至少有6個(gè)對(duì)Ub的生物學(xué)功能至關(guān)重要，這取決于賴氨酸殘基中游離的ε-氨基，它能與Ub分子中游離的C端G76殘基反應(yīng)，形成多聚泛素鏈，而被修飾的賴氨酸殘基會(huì)失去其生物學(xué)功能[29-30]。簡言之，OPs與賴氨酸殘基的加合作用會(huì)破壞Ub正常的生理功能，進(jìn)而產(chǎn)生毒性作用。

4 小結(jié)

通過深度探究OP毒物與蛋白質(zhì)之間的加合反應(yīng)機(jī)制，了解活性位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)特征，為之后的OP毒物的確認(rèn)暴露、溯源歸因、精準(zhǔn)治療、合理預(yù)防提供了新思路：(1)通過鑒定蛋白加合物的存在來實(shí)現(xiàn)OP的確認(rèn)暴露，與OP毒物原型、代謝產(chǎn)物相比，生物體內(nèi)的蛋白加合物為OP的暴露提供了更好的檢測窗。對(duì)OP毒物的檢測時(shí)間無需再限定于48 h之內(nèi)，研究者可以根據(jù)蛋白加合物在生物體內(nèi)的保留時(shí)間來選擇通過測定哪種蛋白加合物來判斷OP暴露；(2)通過分析蛋白加合物中與活性位點(diǎn)相結(jié)合的OP毒物的保留基團(tuán)對(duì)OP毒性進(jìn)行溯源歸因，為OP中毒提供更多有效信息，幫助醫(yī)生對(duì)OP中毒患者實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)治療。目前，以蛋白加合物為基石對(duì)OP毒性溯源的文章較少，難以形成歸因溯源的完整體系，提示可以總結(jié)常見的物種體內(nèi)不同蛋白加合物對(duì)OPP/OPNAs的溯源情況，互為補(bǔ)充，進(jìn)而形成一張比較完善的溯源譜圖以供醫(yī)療參考；(3)充分掌握蛋白加合物的形成規(guī)律、活性位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)特征。蛋白加合物形成的影響因素較多，與結(jié)合蛋白的種類、結(jié)構(gòu)，活性位點(diǎn)暴露情況、周圍環(huán)境(如空間結(jié)構(gòu)、電子效應(yīng)、靜電作用(氫鍵、共軛鍵))，氨基酸殘基的酸堿性、解離情況、帶電情況等因素相關(guān)，通常處于暴露狀態(tài)(具有較大的%SAS)、與鄰位殘基形成離子對(duì)或存在非共價(jià)相互作用、pKa值較小、周邊有帶正電的氨基酸殘基的活性位點(diǎn)，易于與OP毒物共價(jià)結(jié)合形成蛋白加合物。該規(guī)律可用于新藥研發(fā)，作為預(yù)防藥，通過預(yù)先與活性位點(diǎn)相結(jié)合來阻止有毒蛋白加合物的生成；或作為治療藥，通過改變加合物的結(jié)構(gòu)、加合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)特征，破壞已生成的有毒蛋白加合物以達(dá)到解毒目的。