趙 軍 李 昕 常 虹 高小明 劉 巖※

(1.內(nèi)蒙古自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院中醫(yī)內(nèi)科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050)

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(PMOP)屬高轉(zhuǎn)換型的原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥，是一種由于絕經(jīng)后婦女卵巢功能衰退、雌激素水平下降，繼發(fā)甲狀旁腺功能亢進(jìn)、降鈣素分泌不足，從而導(dǎo)致骨吸收大于骨形成，骨量逐漸減少，以單位體積骨量減少和骨組織微結(jié)構(gòu)退變、破壞為特征，最終導(dǎo)致骨骼脆性增加而易于發(fā)生骨折的全身代謝障礙性骨病。流行病學(xué)資料顯示中國(guó)>60歲人群中的女性原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥發(fā)病率為28.6%，并趨向于逐年升高，因此尋求有效預(yù)防和治療PMOP的方法有重要現(xiàn)實(shí)價(jià)值。在傳統(tǒng)民族醫(yī)藥中尋求效果可靠、毒副作用小的防治方法具有重要意義[1-4]。

本研究所用的民族藥藍(lán)刺頭(蒙醫(yī)名“烏日格斯圖呼和”)，菊科藍(lán)刺頭屬，漏蘆的干燥頭狀花序，載于蒙醫(yī)醫(yī)典《智慧文鑒》，有固骨質(zhì)、接骨愈傷之功效，用于治療筋傷骨折、金創(chuàng)、刺痛等癥[5-8]。本次實(shí)驗(yàn)通過(guò)摘除大鼠卵巢的經(jīng)典方法復(fù)制絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型，通過(guò)合理隨機(jī)對(duì)照分組、科學(xué)給藥、檢測(cè)體質(zhì)量時(shí)序性變化、子宮病理學(xué)計(jì)量指標(biāo)、骨密度(BMD)，并與陽(yáng)性對(duì)照藥物進(jìn)行比較，旨在進(jìn)一步探究藍(lán)刺頭安全性，為傳統(tǒng)中醫(yī)藥資源開(kāi)發(fā)及利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 (1)藍(lán)刺頭制劑由廣州中醫(yī)藥大學(xué)科技產(chǎn)業(yè)園有限公司提供。強(qiáng)骨膠囊：北京岐黃制藥有限公司，規(guī)格：0.25 g/粒，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20030007。己烯雌酚片：北京益民藥業(yè)有限公司，規(guī)格：0.5mg/片，國(guó)藥準(zhǔn)字H11020899。(2)試劑：蘇木素伊紅染液(青島克斯特生物科技有限公司)、堿性美藍(lán)溶液(武漢卡諾斯科技有限公司)、亞甲基藍(lán)染液[范德(北京)生物科技有限公司]。(3)儀器：北京醫(yī)用離心機(jī)廠生產(chǎn)的DM0424醫(yī)用離心機(jī)，半徑15 cm，離心速度3000 r/min；100倍Olympus SZX19型顯微鏡，日本奧林巴斯公司；同方股份有限公司THMMDI-UP-I圖像分析儀，版本為motic Image Advanced 3.0。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 4月齡清潔級(jí)雌性Wistar大鼠84只，平均體質(zhì)量(250.00±20.00)g，購(gòu)于內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，合格證號(hào)：SCXK(蒙)2002-0001。分籠飼養(yǎng)，自由攝食、水；飼養(yǎng)期間每7 d稱1次體質(zhì)量，并每日記錄動(dòng)物飼養(yǎng)室的溫度變化。

1.3 動(dòng)物分組 建模 分組：隨機(jī)法依次分模型組、假手術(shù)組、藍(lán)刺頭高、中、低劑量組、強(qiáng)骨膠囊組、己烯雌酚組共7組，每組12只，亞甲基藍(lán)染液分別編號(hào)。

建立PMOP大鼠模型：方法參照《動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[9]，用乙醚麻醉大鼠后，仰位固定，下腹備皮，鋪無(wú)菌洞巾，外科常規(guī)消毒，沿下腹部正中線2 cm切口打開(kāi)腹腔，除假手術(shù)組(只切除卵巢周?chē)倭恐荆磺新殉?外，其余各組大鼠均完整摘除雙側(cè)卵巢，傷口內(nèi)滴入適量慶大霉素水溶液，止血后分層縫合。術(shù)后各組大鼠切口嚴(yán)格消毒。術(shù)后恢復(fù)5 d，逐只進(jìn)行陰道上皮細(xì)胞角化實(shí)驗(yàn)[10-13]，連續(xù)觀察5 d，假手術(shù)組大鼠陰道涂片細(xì)胞主要由有核上皮細(xì)胞、角化上皮細(xì)胞和白細(xì)胞組成(圖1A)，而模型組則以白細(xì)胞為主(圖1B)，提示造模成功。

圖1 光鏡下大鼠陰道脫落細(xì)胞涂片

1.4 藥物干預(yù)和標(biāo)本采集 藥物干預(yù)：手術(shù)造模確認(rèn)成功后，各組大鼠分籠自由飼養(yǎng)90 d后開(kāi)始給予藥物干預(yù)。模型組和假手術(shù)組予相應(yīng)體積0.9%氯化鈉溶液灌胃，藍(lán)刺頭高、中、低劑量組按生藥根據(jù)人鼠體表面積折算后，分別以13 mg/mL、6.5 mg/mL、3.25 mg/mL的劑量灌胃給藥，以低劑量組為臨床等效劑量；強(qiáng)骨膠囊組3.46 mg/mL、己烯雌酚組0.0023 mg/mL，按成人有效劑量給藥。為便于配藥，以上藥物根據(jù)大鼠體質(zhì)量換算為0.02 mL/g控制給藥量。每天灌胃1次，連續(xù)90 d，至處死前24 h停止。

標(biāo)本采集：處死前12 h禁食不禁水，10%水合氯醛0.8 mL腹腔注射麻醉，剖取雙側(cè)完整股骨，剔除分離表面肌肉組織，保留骨膜，標(biāo)記右側(cè)股骨，生理鹽水浸泡過(guò)的紗布包裹，保鮮膜封存，恒溫冷藏保存，以備檢測(cè)骨密度(BMD)之用；摘取大鼠子宮，4℃室溫4%甲醛溶液固定24 h，以備HE染色。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)

1.5.1 右側(cè)離體股骨骨密度測(cè)定 采用雙能DIREX-10骨密度儀(深圳市艾克瑞電氣有限公司)對(duì)PMOP大鼠的右側(cè)離體股骨近段進(jìn)行檢測(cè)分析。顯微CT掃描大鼠右側(cè)股骨近心端，測(cè)量骨密度(BMD)、骨小梁體積/組織體積(BV/TV%)。

1.5.2 子宮不同部位病理學(xué)檢測(cè) 子宮組織HE染色。不同組PMOP大鼠各取5張切片(n0)，每張切片隨機(jī)再選擇5個(gè)視野(n1)，100倍倒置顯微鏡下對(duì)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞高度、子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞高度、腺腔內(nèi)徑、宮內(nèi)膜腺體面積百分比、肌全層(圖2、表1、表2)變化情況進(jìn)行觀察，拍照后采用醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量時(shí)序性變化 灌胃前第13周體質(zhì)量、灌胃結(jié)束前1 d第25周體質(zhì)量、LEE’S指數(shù)，模型組與假手術(shù)組相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01、P<0.05)；藍(lán)刺頭高、中、低劑量組及強(qiáng)骨膠囊組、己烯雌酚組與假手術(shù)組相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01、P<0.05)；藍(lán)刺頭各劑量組、強(qiáng)骨膠囊組、模型組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1、表2。

表1 各組 PMOP大鼠造模成型期體質(zhì)量變化

表2 各組PMOP大鼠灌胃治療期體質(zhì)量變化

從整個(gè)實(shí)驗(yàn)的終末體質(zhì)量變化來(lái)看，大鼠去卵巢后的體質(zhì)量時(shí)序性變化均呈迅速增長(zhǎng)，相比之下經(jīng)陽(yáng)性藥物治療后的各去勢(shì)組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)速度減緩，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，且藍(lán)刺頭劑量越大，大鼠體質(zhì)量越輕，呈線性關(guān)系。

2.2 骨組織計(jì)量學(xué)變化 與假手術(shù)組比較，各組大鼠股骨頭近心端骨密度(BMD)、骨小梁體積/組織體積(BV/TV%)均下降(P<0.05)，其中模型組降低尤為明顯(P<0.01)；與模型組比較藥物灌胃干預(yù)后，各給藥組BMD、BV/TV%均顯著升高(P<0.05)；藍(lán)刺頭3劑量組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而與己烯雌酚組之間差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組PMOP大鼠右側(cè)股骨干骺端骨組織計(jì)量學(xué)結(jié)果比較

2.3 子宮不同部位病理學(xué)變化 與假手術(shù)組比較，模型組的子宮內(nèi)膜上皮高度、腺上皮高度、腺腔內(nèi)徑厚度、內(nèi)膜腺體面積均顯著降低(P<0.01)。與模型組比較，藍(lán)刺頭中劑量組、強(qiáng)骨膠囊組、己烯雌酚組上述子宮組織各項(xiàng)指標(biāo)均明顯增加(P<0.05)，而三者之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表4、表5。假手術(shù)組內(nèi)膜層較厚，內(nèi)膜腺腔明顯，全肌層較厚，細(xì)胞飽滿，排列致密。與其相比，模型組大鼠子宮內(nèi)膜層明顯萎縮，內(nèi)膜腺體面積減少，內(nèi)膜上皮及腺體上皮高度減?。蛔訉m腺腔內(nèi)徑厚度變薄，子宮腺減少；全肌層顯著變薄，細(xì)胞縮小，排列松散。己烯雌酚組子宮內(nèi)膜層無(wú)顯著變薄，但上皮細(xì)胞水腫明顯，部分腺上皮細(xì)胞排列不規(guī)則，內(nèi)膜增生過(guò)快，尚未見(jiàn)病理惡變；藍(lán)刺頭組子宮內(nèi)膜層雖比正常對(duì)照組有不同程度萎縮，但依然較厚，且無(wú)細(xì)胞水腫現(xiàn)象，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

表4 PMOP大鼠術(shù)后25周子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞高度、子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞高度變化

表5 PMOP大鼠術(shù)后25周子宮腺腔內(nèi)徑厚度、子宮內(nèi)膜腺體面積百分比變化

圖2 PMOP大鼠假手術(shù)組和模型組子宮不同部位病理切片比較

3 討論

雌激素在骨代謝中發(fā)揮著重要作用，女性絕經(jīng)或摘除卵巢后，雌激素水平下降、缺乏會(huì)加速骨轉(zhuǎn)換，促使骨形成和吸收偶聯(lián)失衡，從而發(fā)生骨質(zhì)疏松。而骨骼和子宮又是雌激素發(fā)揮作用的重要靶器官。骨密度(BMD)、骨小梁體積/組織體積(BV/TV%)是骨骼骨量和骨組織結(jié)構(gòu)的主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，其中BMD為骨質(zhì)疏松癥的黃金診斷指標(biāo)[14-19]。子宮是女性重要生殖器官之一和生育場(chǎng)所，存在雌孕激素受體。子宮對(duì)參與和調(diào)節(jié)機(jī)體骨代謝有重要意義。研究示肥胖會(huì)增加身體負(fù)重[20]，易導(dǎo)致骨折發(fā)生，因此控制體質(zhì)量有助于預(yù)防骨質(zhì)疏松。在蒙醫(yī)經(jīng)典文獻(xiàn)[21]中，骨質(zhì)疏松屬“骨枯癥”范疇，其記載有“老年人赫依偏盛，體內(nèi)三根、七素平衡失調(diào)，精華分解、吸收與排泄功能紊亂，導(dǎo)致骨之精華吸收減少，易骨枯”。而刺頭是道地的野生傳統(tǒng)蒙藥材，在內(nèi)蒙古各地隨處可見(jiàn)，能夠壯骨、接骨。本實(shí)驗(yàn)顯示在一定濃度范圍內(nèi)，藍(lán)刺頭能夠明顯上調(diào)去卵巢大鼠BMD、BV/TV%表達(dá)水平，從而起到一定的骨保護(hù)作用，據(jù)前期研究[22]成果推測(cè)藍(lán)刺頭可能是通過(guò)上調(diào)骨組織雌激素受體(ER)的表達(dá)而發(fā)揮類雌激素樣作用；去勢(shì)會(huì)提高大鼠體質(zhì)量過(guò)快過(guò)高增長(zhǎng)，會(huì)引發(fā)肥胖，藍(lán)刺頭能有效抑制體質(zhì)量增長(zhǎng)，有助預(yù)防骨質(zhì)疏松，降低骨折發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，其可能也是通過(guò)經(jīng)典雌激素通路實(shí)現(xiàn)的；藍(lán)刺頭能夠提高子宮質(zhì)量/體質(zhì)量(UW/BW)、增加子宮內(nèi)膜厚度、防止子宮內(nèi)膜萎縮，延緩了子宮機(jī)能下滑狀態(tài)，從而在骨量維持方面發(fā)揮重要作用。并且與陽(yáng)性對(duì)照藥物比較，藍(lán)刺頭組的子宮內(nèi)膜厚度增長(zhǎng)速度不及己烯雌酚組，與強(qiáng)骨膠囊組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，這一結(jié)果提示與西藥己烯雌酚相比，藍(lán)刺頭的雌激素樣不良反應(yīng)不明顯，其發(fā)生子宮內(nèi)膜癌的風(fēng)險(xiǎn)性可能降低。因此，藍(lán)刺頭在防治PMOP的同時(shí)，可以有效避免雌激素替代療法給子宮帶來(lái)的嚴(yán)重不良影響。綜上，藍(lán)刺頭可以對(duì)大鼠去卵巢后引發(fā)的骨量丟失、體質(zhì)量過(guò)快過(guò)高增長(zhǎng)和子宮功能衰退起一定防治作用，證實(shí)藍(lán)刺頭有效性、安全性較高，并具簡(jiǎn)(組方簡(jiǎn)單、給藥量小)、效(有效成分清、效果一定)、驗(yàn)(理論、實(shí)驗(yàn)依據(jù)可靠)、廉(價(jià)低)優(yōu)勢(shì)，為應(yīng)用傳統(tǒng)民族醫(yī)藥理論防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松提供一定實(shí)驗(yàn)依據(jù)。