王 麗 莫日根 常劍銳 于 蕾 張彩云

（內(nèi)蒙古自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020）

乳腺增生是女性最常見的乳腺疾病，其致病原因主要為內(nèi)分泌功能紊亂[1]。慈蓮膠囊為內(nèi)蒙古自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院院內(nèi)制劑，臨床治療乳腺增生取得了良好效果[2，3]，筆者通過研究慈蓮膠囊對乳腺增生大鼠的作用，探討其治療作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 70 只SPF 級雌性未孕SD大鼠（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供），體質(zhì)量180～220 g，生產(chǎn)許可證SCXK（蒙）2015-0001。

1.1.2 藥物與試劑 慈蓮膠囊（內(nèi)蒙古自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院制劑室提供）；枸櫞酸他莫昔芬片（揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司，國藥準(zhǔn)字H32021472，10 mg× 60 片）；乳癖消片[遼寧上藥好護(hù)士藥業(yè)（集團(tuán)）有限公司，國藥準(zhǔn)字Z21021822，0.67 g× 72 片]。

苯甲酸雌二醇注射液（杭州動物藥品廠，批號：0902145，規(guī)格l mL∶l mg），黃體酮注射液（浙江仙琚制藥股份有限公司，批號：090601，規(guī)格1 mL∶20 mg），甲醛溶液、無水乙醇（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司，批號：20200608、20210112）；二甲苯（天津富宇精細(xì)化工有限公司，批號：20181219），石蠟（德國徠卡，批號：202006）。雌二醇（JYM0608Ra）、孕酮（JYM0049Ra）、泌乳素（JYM1048Ra）（武漢基因美生物科技有限公司）；促黃體生成素（El absci ence 公司，E-EL-R0026c）、促卵泡激素（上海尚寶生物科技有限公司，批號：10075RA）。ELI SA試劑盒、SABC免疫組化試劑盒；DBA顯色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，批號：20201022N、20200621H）；HE 染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號：G1020）；通用SP 檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號：SP0058）。兔抗鼠雌激素受體抗體（批號：20512）、兔抗鼠孕激素受體抗體（批號：20524）、P53 抗體（批號：20556）均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 儀器 全自動染色機(jī)Lei ca Aut ostainer XL、分體式組織包埋機(jī)Lei ca EG1150 H、切片機(jī)Lei ca RM 2235、攤片機(jī)Lei ca HI 1210、烘片機(jī)Lei ca HI 1220、封閉式全自動組織脫水機(jī)Lei ca APS 200S、顯微鏡Lei ca DM2000 均為德國徠卡制造；恒溫水浴鍋（北京長風(fēng)儀器儀表公司，XMTD-6000）；冷凍高速離心機(jī)（德國SI GMA，Si GMR3-18K）；電子天平（梅特勒-托利多，ML204/02）；精密游標(biāo)卡尺（成都成量工具，0～150 mm，0.02 mm）；烤箱（上?；厶﹥x器制造有限公司，DHG-9140A）；載玻片（Ser vi cebi o）；蓋玻片（江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司，10212432C）；微波爐（格蘭仕，P70D20TL-P4）。美國MD Spectra Max i 3 多功能酶標(biāo)儀。

1.2 方法

1.2.1 造模 取70 只大鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分空白組（10 只）和造模組（60 只）。造模：于大鼠后肢內(nèi)側(cè)肌肉注射苯甲酸雌二醇注射液0.5 mg/kg，日1次，連續(xù)25 d；然后肌肉注射黃體酮注射液5 mg/kg，日1 次，連續(xù)5 d；第31 天起，每3 d 肌肉注射1 次苯甲酸雌二醇注射液0.5 mg/kg 至給藥結(jié)束?？瞻捉M大鼠肌肉注射等體積生理鹽水。造模30 d 后，隨機(jī)選取6 只造模組大鼠和1 只空白組大鼠處死。以造模組大鼠第2 對乳頭高度和直徑均顯著高于空白組（P＜0.01），且病理切片觀察到大鼠乳頭的腺導(dǎo)管、腺泡、腺小葉等出現(xiàn)相應(yīng)的病理變化，判定造模成功。

1.2.2 分組及給藥 造模組造模成功后，隨機(jī)分為6 組，即模型組、乳癖消組、他莫昔芬組及慈蓮膠囊低、中、高劑量組，每組9 只。慈蓮膠囊組按生藥量計(jì)0.7 g/（kg·d）、1.4 g/（kg·d）、2.8 g/（kg·d）為低、中、高劑量；他莫昔芬組予枸櫞酸他莫昔芬3 mg/（kg·d）；乳癖消組予乳癖消片0.5 g/（kg·d）；空白組及模型組均予等體積蒸餾水；均灌胃給藥。給藥體積為8 mL/kg，日1 次，連續(xù)30 d。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 乳房直徑及乳頭高度 用精密游標(biāo)卡尺于造模前、給藥前后測大鼠胸部的第2 對乳頭高度和乳房直徑。

1.3.2 HE 染色觀察乳腺組織病理形態(tài)學(xué)變化 常規(guī)取材經(jīng)固定，脫水，石蠟包埋，切片，HE 染色，在光鏡下觀察大鼠乳腺組織病理變化。

1.3.3 酶聯(lián)免疫法（ELISA）測血清中性激素水平 末次給藥24 h 后，取血，離心（離心半徑8.2 cm，離心速度3000 r/min，離心時(shí)間15 min）處理。依據(jù)ELI SA試劑盒說明書，測血清雌二醇（E2）、孕酮（P）、泌乳素（PRL）、促黃體生成素（LH）、促卵泡激素（FSH）含量。

1.3.4 免疫組化SP 法檢測乳腺組織中ER、PR、P53表達(dá) 切片脫水封片后，顯微鏡下觀察，采集圖像并分析。以細(xì)胞質(zhì)和（或）細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒作為陽性細(xì)胞，采用Image-Pro Plus 軟件測量棕黃色區(qū)域的積分光密度值（I OD）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；計(jì)量資料以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（）表示；各組數(shù)據(jù)均進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布，組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)；等級資料采用非參數(shù)檢驗(yàn)。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組對乳腺增生大鼠乳房直徑、乳頭高度的影響 空白組大鼠乳頭呈小顆粒狀，貼在皮膚上，柔軟，個(gè)別稍隆起。與空白組比較，模型組大鼠乳頭紅腫，乳房直徑和乳頭高度增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，各給藥組乳房直徑和乳頭高度均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠給藥前后乳頭直徑、高度比較 （）

表1 各組大鼠給藥前后乳頭直徑、高度比較 （）

注：與空白組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。

2.2 各組乳腺組織形態(tài)學(xué)變化 病理組織學(xué)觀察：空白組乳腺小葉、導(dǎo)管散在分布于脂肪組織間，無小葉腺泡增生、聚集及導(dǎo)管擴(kuò)張。模型組乳腺小葉增生、腺泡數(shù)目明顯增加，排列擁擠，導(dǎo)管上皮增生、管腔擴(kuò)張，腺腔內(nèi)可見大量分泌物，結(jié)構(gòu)紊亂，呈乳腺增生性改變；相較于模型組，乳癖消組和他莫昔芬組的腺泡數(shù)量、導(dǎo)管上皮增生程度及腺腔擴(kuò)增程度均顯著降低，腺腔內(nèi)分泌物明顯減少，乳腺組織增生狀態(tài)得到改善。與模型組相較，慈蓮膠囊高、中、低劑量組乳腺腺泡數(shù)量、導(dǎo)管上皮增生及腺腔擴(kuò)張均有不同程度降低，腺腔內(nèi)分泌物減少，乳腺組織的增生狀態(tài)得到了不同程度改善，其中尤以慈蓮膠囊高劑量組改善顯著。見圖1。

圖1 各組大鼠乳腺組織HE 染色圖

2.3 各組對血清中E2、P、PRL、LH、FSH 影響 與模型組相比，各組大鼠E2、血清PRL、FSH水平均降低（P＜0.05）；P 水平均增高，其中他莫昔芬組、乳癖消組升高明顯（P＜0.05）；血清LH 水平均顯著升高（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠血清中E2、P、PRL、LH、FSH 含量比較 （）

表2 各組大鼠血清中E2、P、PRL、LH、FSH 含量比較 （）

注：與空白組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。

2.4 各組對乳腺增生大鼠乳腺組織切片中ER、PR、P53 表達(dá)的影響 與空白組相比，模型組的乳腺組織，呈ER陽性表達(dá)的導(dǎo)管上皮細(xì)胞及腺泡細(xì)胞顯著增多，以胞核表達(dá)為主，為棕黃色或黑褐色，強(qiáng)弱不等，多呈中-強(qiáng)陽性（P＜0.05）。與模型組相比，乳癖消組和他莫昔芬組呈ER陽性表達(dá)的細(xì)胞顯著減少，以胞核表達(dá)為主，強(qiáng)弱不等（P＜0.05）。與模型組相比，慈蓮膠囊高、中、低劑量組乳腺組織增生狀態(tài)得到不同程度改善，呈ER陽性表達(dá)的乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞和腺泡細(xì)胞也不同程度減少，尤以慈蓮膠囊高劑量組表達(dá)減少顯著（P＜0.05）。

與空白組相比，模型組增生的乳腺組織，呈PR陽性表達(dá)的導(dǎo)管上皮細(xì)胞及腺泡細(xì)胞顯著增多，以胞核表達(dá)為主，為棕黃色，強(qiáng)弱不等，多呈弱-中度陽性（P＜0.05）。與模型組相比，乳癖消組和他莫昔芬組呈PR陽性表達(dá)的細(xì)胞顯著減少，以胞核表達(dá)為主，強(qiáng)度減弱（P＜0.05）。與模型組相比，慈蓮膠囊高、中、低劑量組乳腺組織增生狀態(tài)得到不同程度改善，呈PR陽性表達(dá)的細(xì)胞也不同程度減少，強(qiáng)度減弱。尤以慈蓮膠囊高劑量組表達(dá)減少顯著（P＜0.05）。

與空白組相比，模型組增生的乳腺組織，呈P53陽性表達(dá)的導(dǎo)管上皮細(xì)胞及腺泡細(xì)胞顯著增多，以胞核表達(dá)為主，為棕黃色，強(qiáng)弱不等，多呈弱-中度陽性（P＜0.05）。與模型組相比，乳癖消組和他莫昔芬組呈P53 陽性表達(dá)的細(xì)胞顯著減少，以胞核表達(dá)為主，強(qiáng)弱不等（P＜0.05）。與模型組相比，慈蓮膠囊高、中、低劑量組乳腺組織增生狀態(tài)得到不同程度改善，呈P53 陽性表達(dá)的細(xì)胞也不同程度減少，尤以慈蓮膠囊中、高劑量組表達(dá)減少顯著（P＜0.05）。見圖2～圖4。

圖2 各組大鼠乳腺組織中ER 的表達(dá)

圖3 各組大鼠乳腺組織中PR 的表達(dá)

圖4 各組大鼠乳腺組織中P53 的表達(dá)

3 討論

乳腺增生是女性常見、多發(fā)病，以乳腺局部腫塊和疼痛為主癥?；疾〉娜巳焊装l(fā)乳腺癌，本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用的雌孕激素聯(lián)合造模方法，是目前動物實(shí)驗(yàn)中經(jīng)典的造模方法。給藥期間每隔3 d 給予雌激素刺激，以保持模型的穩(wěn)定性。干預(yù)后他莫昔芬組、乳癖消組、慈蓮膠囊各組乳房直徑和乳頭高度均較模型組降低（P＜0.05）。表明慈蓮膠囊能改善乳腺增生模型大鼠的乳房腫脹程度。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，乳腺增生的主要原因是卵巢激素紊亂導(dǎo)致“下丘腦-垂體-卵巢軸”失去平衡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明他莫昔芬組、乳癖消組、慈蓮膠囊各組均能降低乳腺增生大鼠血清E2、PRL、FSH含量（P＜0.05），他莫昔芬組、乳癖消組，能升高血清P 水平（P＜0.05）。慈蓮膠囊各劑量組均能不同程度地升高P 含量，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。他莫昔芬組、乳癖消組、慈蓮膠囊各組均可升高血清LH水平（P＜0.05）。表明慈蓮膠囊治療乳腺增生可能是通過調(diào)節(jié)性激素水平進(jìn)而引起下丘腦-垂體-卵巢軸的反饋調(diào)節(jié)乳腺增生模型大鼠異常的血清性激素水平而抑制乳腺上皮的增生或促進(jìn)其復(fù)舊。

乳腺增生的發(fā)生與乳腺組織局部雌、孕激素受體的含量及敏感性增高有關(guān)。陳怡君[4]指出女性正常乳腺中的雌、孕激素受體高表達(dá)與乳腺癌的發(fā)病率升高有關(guān)。P53 是多種腫瘤相關(guān)性的一種癌基因和抑癌基因，分野生、突變2 型。野生型可促進(jìn)細(xì)胞分化，抑制腫瘤增殖，是重要的調(diào)控因子。若P53 基因發(fā)生缺失或突變，則成為致癌基因。P53 已經(jīng)確定在乳腺增生病中有表達(dá)，說明P53 基因可能促使增生組織向癌性組織轉(zhuǎn)化或過渡，提示不典型增生惡化的信號。通過對乳腺組織中ER、PR、P53 的觀察，并運(yùn)用奧利德評分（Allredscore）判讀系統(tǒng)[5]，經(jīng)2 名高年資病理醫(yī)師雙盲法閱片取平均值。數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理表明與模型組相比，他莫昔分組、乳癖消組、慈蓮膠囊各組乳腺組織中ER、PR、P53 陽性表達(dá)的細(xì)胞不同程度減少，從而改善乳腺增生程度，與上述學(xué)者觀點(diǎn)相一致。