夏穎慧,邱水瑋,孫江東,邢泉生

(1 青島大學(xué)附屬婦女兒童醫(yī)院心臟中心,山東 青島 266034； 2 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部神經(jīng)再生與康復(fù)研究院)

房間隔缺損(ASD)是常見的先天性心臟病之一，占先天性心臟病的13%～18%[1]。ASD通常的治療方法是使用鎳鈦合金封堵器經(jīng)導(dǎo)管封堵，該法的好處是創(chuàng)傷小、住院時間短，但從長遠(yuǎn)來看，鎳鈦合金封堵器不可降解，且有增加心律失常、血栓等并發(fā)癥的風(fēng)險[2-3]。因此，開發(fā)生物可降解材料制作心臟缺損封堵裝置是當(dāng)前需要解決的問題。聚丁二酸丁二醇酯(PBS)是脂肪族聚酯類材料，具有高結(jié)晶度，制成補片可以提供較好的硬度，從而起到支撐作用。同時，PBS還具有良好的可加工性，可以通過擠出、注射成型等方法進行加工[4-5]。但由于該材料降解時間較長，且其高疏水性不適合細(xì)胞附著，目前較少應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[6]。有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)PBS與殼聚糖(CS)復(fù)合時，不僅不影響各材料的性能，還可在一定程度上起到互相促進的作用[7]。CS作為一種天然來源的半合成氨基聚糖，具有良好的生物相容性、可降解性以及生物黏附性[8-10]。CS通過與聚酯類材料復(fù)合改性，可應(yīng)用于組織再生和細(xì)胞支架等領(lǐng)域[11-12]。同時，3D打印CS水凝膠目前在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域(如組織工程、納米載藥、傷口敷料等)也得到廣泛的研究[13-16]。為了探究PBS/CS用于3D打印加工的可行性以及該復(fù)合材料作為醫(yī)療植入物的理化性能，本研究對PBS/CS進行材料表征和細(xì)胞學(xué)測試，為開發(fā)新型可用于3D打印制作心臟補片的可降解材料提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

PBS(注塑級，上海麥克林生化科技有限公司)；CS(脫乙酰度≥95%，黏度100～200 mPa·s，上海麥克林生化科技有限公司)；NIH/3T3細(xì)胞株(武漢普諾賽生命科技有限公司)；DMEM高糖培養(yǎng)液(北京索萊寶科技有限公司)；活性氧(ROS)檢測試劑盒(Beyotime，S0033S)；Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒(Beyotime，C1062S)；Phalloidin-iFluor 555抗體(ab176756，Abcam，美國)。

1.2 復(fù)合材料的制備及表征分析

1.2.1PBS/CS材料的制備 將PBS真空干燥4 h(溫度50 ℃，真空度-0.1 MPa)。按投料質(zhì)量比9∶1、8∶2稱取PBS和CS，分別命名為PCS1和PCS2，依次倒入轉(zhuǎn)矩流變儀密煉模塊，設(shè)置密煉模塊的前、中、后溫度均為160 ℃，轉(zhuǎn)速30 r/min，密煉共混10 min。室溫冷卻后封裝入預(yù)先干燥除水處理的密封罐中。

1.2.2掃描電鏡觀察表面形貌 為了觀察添加CS對PBS結(jié)構(gòu)的影響，通過模具注塑將PBS/CS、PBS制作成啞鈴狀拉伸測試樣條，液氮冷脆1 h后脆斷截取其斷面。將斷面真空干燥后用導(dǎo)電膠固定在樣品臺上，斷面噴金處理，使用日本日立公司生產(chǎn)的Regulus 8100型場發(fā)射掃描電子顯微鏡對斷面進行觀察，獲取圖片。

1.2.3傅立葉變換紅外光譜測試結(jié)構(gòu)表征 PBS、PCS1、PCS2和CS樣品使用美國賽默飛公司生產(chǎn)的Nicolet iN10MX型傅立葉變換紅外光譜儀進行分析。分辨率為4 cm-1，掃描次數(shù)32次，掃描范圍4 000～400 cm-1。

1.3 3D打印ASD補片的制備

使用熔融擠出式3D打印機進行PBS/CS心臟補片的制作。將20 g真空干燥后的PCS1和PCS2顆粒料倒入3D打印機擠出筒內(nèi)，加熱至175 ℃，待材料呈熔融狀態(tài)后以7.5 mm/s勻速擠出。打印參數(shù)：噴頭直徑0.35 mm，打印厚度5 mm，打印層數(shù)2，網(wǎng)孔間隔5 mm。

1.4 細(xì)胞學(xué)測試

1.4.1細(xì)胞培養(yǎng)與材料浸提液的準(zhǔn)備 NIH/3T3細(xì)胞在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2、飽和濕度條件下，使用含體積分?jǐn)?shù)0.10小牛血清和體積分?jǐn)?shù)0.01青霉素/鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度在每個培養(yǎng)皿達80%～90%時，應(yīng)用2.5 g/L的胰蛋白酶在37 ℃條件下消化細(xì)胞，直至細(xì)胞從培養(yǎng)皿中脫落，將細(xì)胞收集進離心管中，以1 200 r/min離心5 min，棄上清，加入磷酸鹽緩沖液以1 200 r/min離心5 min，棄上清后用DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，并按每培養(yǎng)皿(直徑10 cm)1×105個細(xì)胞的密度定殖新培養(yǎng)皿，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，選擇密度為60%～70%的細(xì)胞進行后續(xù)實驗。

根據(jù)國家醫(yī)療器械生物學(xué)評價標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 16886.5-2017)制備材料浸提液，以檢測材料浸提液對細(xì)胞影響。3D打印補片進行環(huán)氧乙烷滅菌后，按照每平方厘米材料加入1 mL培養(yǎng)液的比例，無菌環(huán)境下在10 cm培養(yǎng)皿中加入含體積分?jǐn)?shù)0.10小牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在37 ℃浸提24 h，之后在無菌環(huán)境下將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到新的無菌離心管中，封口后置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2CCK-8法檢測細(xì)胞增殖 收集對數(shù)生長期的NIH/3T3細(xì)胞，計數(shù)后在96孔板中按照每孔5 000個種植細(xì)胞，每孔加入細(xì)胞培養(yǎng)液至100 μL，在含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃恒溫孵育2 h，應(yīng)用酶標(biāo)儀測定波長450 nm處的吸光度值，根據(jù)吸光度分析每組細(xì)胞增殖情況。

1.4.3細(xì)胞形態(tài)檢測 使用Phalloidin-iFluor 555抗體對肌動蛋白細(xì)絲(f-肌動蛋白)進行染色。將用材料浸提液培養(yǎng)24 h后的NIH/3T3細(xì)胞以磷酸鹽緩沖液清洗2次，用40 g/L的多聚甲醛固定細(xì)胞10 min，以磷酸鹽緩沖液洗3次，每次5 min；添加含體積分?jǐn)?shù)0.003 Triton X-100和20 g/L BSA的磷酸鹽緩沖液對細(xì)胞進行破膜，10 min后應(yīng)用磷酸鹽緩沖液清洗細(xì)胞3次，每次5 min；加入適量的Phalloidin-iFluor 555抗體稀釋液(1∶1 000)，室溫孵育60 min后，應(yīng)用磷酸鹽緩沖液洗細(xì)胞3次，每次5 min；最后，應(yīng)用含DAPI的封片劑封片，使用倒置熒光顯微鏡，在Ex/Em分別為 556 nm/574 nm(Phalloidin-iFluor 555)和360 nm/460 nm(DAPI)條件下觀察細(xì)胞。

1.4.4細(xì)胞氧化應(yīng)激水平檢測 使用ROS檢測試劑盒檢測含有ROS的細(xì)胞。NIH/3T3細(xì)胞在材料浸提液中培養(yǎng)24 h后，以磷酸鹽緩沖液洗2次，加入適量稀釋的DCFH-DA(用無血清培養(yǎng)液稀釋至10 μmol/L)充分覆蓋細(xì)胞，在37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育20 min。用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，充分去除細(xì)胞外的DCFH-DA，之后用2.5 g/L的胰蛋白酶消化細(xì)胞，以1 200 r/min離心收集細(xì)胞，使用流式細(xì)胞儀檢測FITC通道陽性細(xì)胞，使用FlowJo分析數(shù)據(jù)。

1.4.5細(xì)胞凋亡檢測 使用Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒檢測細(xì)胞凋亡程度。NIH/3T3細(xì)胞用不含EDTA的2.5 g/L胰蛋白酶消化后，在4 ℃下以1 200 r/min離心5 min。用預(yù)冷磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞2次，以1 200 r/min 4 ℃離心5 min，收集細(xì)胞。然后用300 μL的1×染色緩沖液重懸細(xì)胞，并添加5 μL Annexin V-FITC試劑輕輕混合，在室溫、避光條件下孵育15 min，之后加入10 μL的PI試劑混合，并添加200 μL的1×染色緩沖液，混勻后置于冰上，5 min內(nèi)使用流式細(xì)胞儀檢測FITC通道和PE通道的凋亡細(xì)胞，用FlowJo分析數(shù)據(jù)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用GraphPad Prism統(tǒng)計軟件(Version 9 for Windows，San Diego，California，USA)進行統(tǒng)計學(xué)分析，兩組計量資料的比較采用Studentt檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 掃描電鏡觀察

通過電鏡觀察材料的表面形貌，可以看出CS在PBS材料中的分散情況。從圖1a～c可以看出，純PBS的斷口表面非常光滑；當(dāng)添加CS的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.10時， PCS1斷裂表面的光滑度下降，CS分散比較均勻，同時出現(xiàn)少量裂紋(圖1d～f)；當(dāng)添加CS的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.20時，PCS2斷裂表面粗糙，裂紋數(shù)量和寬度顯著增加(圖1g～i)。

a～c：PBS；d～f：PCS1；g～i：PCS2。圖1 PBS和PBS/CS的掃描電鏡觀察

2.2 傅立葉變換紅外光譜測試

CS的紅外特征峰如圖2a所示：3 420 cm-1為O-H與N-H伸縮振動的疊加，1 654 cm-1為乙酰基中C=O伸縮振動(酰胺Ⅰ)，1 153 cm-1為C6位上C-OH伸縮振動，1 078 cm-1和1 027 cm-1均為糖環(huán)骨架伸縮振動[17-18]。PBS的紅外特征峰見圖2b：2 942 cm-1為CH2的對稱伸縮振動，1 713 cm-1為羰基伸縮振動，1 152 cm-1為C-O-C反對稱伸縮振動，803 cm-1為OC(CH2)2COO中CH2的面內(nèi)搖擺振動。添加不同含量的CS所制備的PBS/CS共混材料的紅外圖譜(圖2c、d)與純PBS的紅外圖譜總體上是相似的，圖譜中所出現(xiàn)的2 942 cm-1、1 713 cm-1、1 152 cm-1、803 cm-1峰均對應(yīng)于純PBS基體的峰[19]；然而，在3 420 cm-1處的吸收峰是O-H與N-H伸縮振動的疊加，是CS的特征峰，說明CS已成功地?fù)饺氲?PBS基體中。

a：CS；b：PBS；c：PCS1；d：PCS2。圖2 傅立葉變換紅外光譜測試

2.3 3D打印心臟補片

本研究成功打印出多孔ASD補片。為了打印出易于內(nèi)皮細(xì)胞攀附、促進組織再生的ASD補片，將補片的孔隙大小設(shè)置為5 mm，打印成尺寸大小為40 mm×40 mm的方形或者直徑40 mm的圓形。在試打印過程中發(fā)現(xiàn)PCS2存在擠出不均勻的問題，成型困難，嚴(yán)重影響了補片的打印精度，故選用PCS1進行ASD補片的打印。由于PCS1結(jié)晶速度較慢，打印時無法瞬時結(jié)晶，所以在尺寸上存在一定的誤差。PCS1材料3D打印實際測量到的補片孔徑約為1 mm，厚度為0.67 mm。另外，PCS1材料3D打印出的補片具有良好的彈性，可彎折，且對折后可以恢復(fù)到原來的形狀。因此，選用PCS1材料進行下一步細(xì)胞相容性測試。見圖3。

a：補片打印中；b～d：不同形態(tài)ASD補片的尺寸測量；e：補片彎折測試。圖3 PCS1打印ASD補片及補片尺寸測量

2.4 細(xì)胞學(xué)測試

為了評價PCS1對細(xì)胞的影響，對PCS1的浸提液進行NIH/3T3細(xì)胞實驗。通過測定細(xì)胞內(nèi)ROS水平，確定細(xì)胞對PCS1浸提液的氧化應(yīng)激程度。結(jié)果顯示，PCS1組(用PCS1浸提液培養(yǎng))細(xì)胞與對照組(未用PCS1浸提液培養(yǎng))細(xì)胞ROS水平差異無顯著性(t=1.054，P>0.05)(圖4a～c)。用phalloidin和DAPI孵育細(xì)胞，細(xì)胞骨架被phalloi-din染為紅色，細(xì)胞核被DAPI染為藍色，將細(xì)胞骨架和細(xì)胞核圖像合并后，細(xì)胞骨架出現(xiàn)在細(xì)胞核的位置，然后觀察細(xì)胞形態(tài)的變化。結(jié)果顯示，對照組和PCS1組細(xì)胞形態(tài)沒有顯著差異(圖4d)。

a：對照組ROS檢測；b：PCS1組ROS檢測；c：對照組與PCS1組ROS水平比較；d：phalloidin染色(細(xì)胞骨架，紅色)和DAPI染色(細(xì)胞核，藍色)觀察細(xì)胞形態(tài)；e：對照組與PCS1組細(xì)胞增殖比較。圖4 PCS1對NIH/3T3細(xì)胞影響的氧化應(yīng)激、細(xì)胞增殖檢測及細(xì)胞形態(tài)觀察

CCK-8法檢測結(jié)果顯示，兩組細(xì)胞的吸光度比較差異無顯著性(t=0.363，P>0.05)，表明PCS1材料浸提液對NIH/3T3細(xì)胞增殖無顯著影響(圖4e)。Annexin V-FITC/PI法檢測NIH/3T3細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示，在早期對照組細(xì)胞凋亡很難檢測到，而且對照組與PCS1組細(xì)胞凋亡沒有明顯差異(t=0.256，P>0.05)；在晚期PCS1組細(xì)胞凋亡也很難檢測到，且對照組與PCS1組細(xì)胞凋亡差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.312，P>0.05)。見圖5。

a：對照組細(xì)胞凋亡流式分析；b：對照組與PCS1組早期凋亡分析；c：PCS1組細(xì)胞凋亡流式分析；d：對照組與PCS1組晚期凋亡分析。圖5 PCS1對NIH/3T3細(xì)胞影響的凋亡程度檢測

3 討 論

近10年來，采用鎳鈦合金封堵器經(jīng)導(dǎo)管封堵治療先天性心臟病具有操作簡便、安全性高和早期并發(fā)癥少等優(yōu)點，因而得到廣泛的應(yīng)用。但隨著對該類手術(shù)病人的長期隨訪發(fā)現(xiàn)，其不良反應(yīng)和并發(fā)癥的發(fā)生風(fēng)險顯著增高，開發(fā)可降解封堵器具有必要性和前瞻性，可為醫(yī)學(xué)組織再生和修復(fù)領(lǐng)域提供更多的可能性[20]。

最近的研究結(jié)果表明，聚酯類高分子材料在醫(yī)學(xué)中具有廣泛的應(yīng)用前景，其中最為常見的聚酯類材料為脂肪族聚酯，例如聚乳酸(PLA)、聚己內(nèi)酯和PBS等，因其降解產(chǎn)物安全無毒，可隨人體代謝排出體外，故被廣泛用于骨和軟骨的修復(fù)以及其他組織再生等領(lǐng)域研究[21-22]?？山到飧叻肿硬牧系慕到膺^程復(fù)雜，尤其是體內(nèi)降解，是降解與吸收同步進行的過程，常伴隨機體不同程度的免疫炎癥反應(yīng)。目前關(guān)于材料降解的研究大多還停留在植入部位的觀察和檢測階段，并未深入研究其代謝、吸收、分布等的影響，僅有少數(shù)可降解材料，如PLA、聚己內(nèi)酯被美國食品藥品監(jiān)督管理局認(rèn)證可作為醫(yī)學(xué)植入物進入人體。本研究選用PBS作為基體材料進行材料學(xué)和細(xì)胞學(xué)的測試，為擴大生物可降解材料的應(yīng)用種類及范圍提供了必要支持。

CS已被證明是一種安全無毒的生物多糖。目前，大量研究表明，CS在醫(yī)療領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。將生物多糖添加到聚酯材料中對于提高聚酯材料的生物相容性和降解率、促進細(xì)胞黏附等起到至關(guān)重要的作用。PBS單體可由石油基材料合成，也可由生物基材料發(fā)酵獲得，其主要降解產(chǎn)物是琥珀酸，琥珀酸是人體三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物，最終降解為二氧化碳和水[23]。由于降解產(chǎn)物的安全性，PBS目前也被廣泛應(yīng)用于食品包裝等領(lǐng)域[24]。盡管PBS具有優(yōu)異的綜合性能，但同時也具有結(jié)晶速度慢和拉伸強度低的缺點，因此對PBS進行改性或多種材料與PBS復(fù)合是目前PBS應(yīng)用的主要方式。當(dāng)PBS用作藥物釋放載體時，可制成PBS/PLA包覆二水合酒石酸鈉鹽微膠囊，實現(xiàn)短周期內(nèi)的擴散釋放；也可采用溶劑揮發(fā)法來制備聚(丁二酸丁二醇酯-共-己二酸丁二醇酯)腸吸收胰島素顆粒，為糖尿病病人的治療提供新的方向[25-26]。除此之外，PBS還可用于軟組織修復(fù)以及組織工程支架材料等領(lǐng)域，在與CS混合后可加工成支架材料，CS具有促進傷口愈合、抑制感染、調(diào)節(jié)免疫等功效[27]。

本研究初步測試PBS/CS共混后3D打印ASD補片的可行性，對PBS、PBS/CS的材料表征進行測試分析，掃描電鏡觀察到復(fù)合材料表面平整度有所差異。當(dāng)CS質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.10時，在熔融共混過程中，分子內(nèi)鏈和分子間鏈之間的氫鍵斷裂，CS與PBS基體之間形成新的氫鍵，使材料具有更好的相容性。當(dāng)CS含量進一步增加時，由于CS的聚集，PCS2復(fù)合材料的斷裂表面觀察到CS呈不均勻分布。由于PBS聚合物是疏水材料，親水性的CS在PBS基體中的聚集是不可避免的。當(dāng)CS的含量較高時，熔融過程中產(chǎn)生的剪切力不足以促進CS在PBS基體中的均勻分散。CS的聚集現(xiàn)象和非均相分散會導(dǎo)致復(fù)合材料力學(xué)性能的退化。由于CS的加入，該復(fù)合材料的熱學(xué)性能如結(jié)晶性和熔融溫度也有所改變。相較于純PBS的加工溫度，PBS/CS共混后熔點降低，且加工時扭矩降低，表明材料在高溫下流動性較好。與PCS1相比，PCS2分散的較不均勻，這是由于CS在高溫下大量聚集，與PBS出現(xiàn)相分離現(xiàn)象，兩者無法均勻混合。將PCS1與PCS2分別打印，由于PCS2中CS含量較多，導(dǎo)致打印過程中材料無法快速結(jié)晶成型，打印尺寸誤差較大。

在細(xì)胞相容性測試中，對細(xì)胞進行氧化應(yīng)激水平檢測尤為關(guān)鍵。ROS包括超氧自由基(O2-)、過氧化氫(H2O2)和羥基自由基(-OH)，在人的正常代謝和病理過程中發(fā)揮重要作用。ROS產(chǎn)生過多，可能會引起炎癥、壞死和瘢痕形成，導(dǎo)致皮膚傷口愈合時間延長，并抑制受損組織的再生[28]。通過檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平，可以判斷材料浸提液是否影響細(xì)胞的氧化應(yīng)激。本文結(jié)果顯示，PCS1組細(xì)胞與對照組細(xì)胞ROS水平差異無顯著性。而且，PBS與CS熔融共混后不會產(chǎn)生新的物質(zhì)，PCS1共混材料如純PBS和純CS一樣，不會影響細(xì)胞的凋亡和增殖。

3D打印技術(shù)近年來得到很大的發(fā)展，尤其是生物打印，在制作仿生材料領(lǐng)域已成為主流的加工方式。隨著數(shù)字科技的發(fā)展，3D打印也更加多樣化，從傳統(tǒng)的熱熔沉積打印到數(shù)字投影打印，實現(xiàn)了高效、精準(zhǔn)制作的一大進步[29]。本研究采用熱熔沉積打印發(fā)現(xiàn)，該技術(shù)在應(yīng)用于PBS/CS復(fù)合材料時存在一些局限性。例如，熔融材料在擠壓后的結(jié)晶速度較慢，導(dǎo)致打印尺寸與理論尺寸有誤差；長時間高溫打印可能使CS在高溫下分解，從而降低材料性能。因此，改進打印方式、進一步提高打印精度是今后研究的重點。

綜上所述，本研究創(chuàng)新性地將PBS與CS熔融共混后3D打印制作ASD補片，經(jīng)材料表征測試發(fā)現(xiàn)兩者具有一定的材料相容性，CS的加入改善了PBS的熱學(xué)性能和親水性，證明通過3D打印技術(shù)將PBS/CS共混材料制作成ASD補片是可行的，并且細(xì)胞實驗顯示該材料浸提液對細(xì)胞無明顯毒性。