滕元姬，凌永嫦, 王俊利

(1.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院a.檢驗(yàn)科，b.產(chǎn)科，廣西百色533000；2.右江民族醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，廣西百色533000)

SMAD4 (sma mothers against decapentaplegia homologue 4)，又名DPC4(deleted in pancreatic cancer, locus 4)，位于人類(lèi)染色體18q21.1，是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白SMADs家族成員。SMADs家族分為三類(lèi)：R-SMAD (SMAD1、2、3、5、8)、co-SMAD4、I-SMAD (SMAD6、7)，其中以co-SMAD4最常見(jiàn)[1]。SMAD4是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的重要細(xì)胞內(nèi)遞質(zhì)[2]。起始于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β的眾多分泌因子幾乎控制著成年人的每一個(gè)發(fā)育過(guò)程和動(dòng)態(tài)平衡，TGF-β信號(hào)的紊亂與許多發(fā)育障礙和癌癥等復(fù)雜疾病關(guān)系密切[3]。SMAD4在TGF-β信號(hào)通路上起著穩(wěn)定SMADs-DNA結(jié)合復(fù)合體，招募轉(zhuǎn)錄激活因子等重要作用，因此，SMAD4基因的突變或缺失被認(rèn)為是多種癌癥發(fā)生的基礎(chǔ)[4]。本研究旨在探討SMAD4基因在廣西壯族女性人群中的攜帶和突變頻率，為相關(guān)易感性疾病的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象收集2018—2019年在右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院體檢的233名壯族女性全血樣本，平均年齡(45.98±10.12)歲。經(jīng)問(wèn)卷調(diào)查，所研究對(duì)象籍貫和長(zhǎng)期居住地都是廣西地區(qū)，個(gè)體間無(wú)親緣關(guān)系，各項(xiàng)體檢實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)均在正常范圍，既往無(wú)慢性病史、自身免疫類(lèi)疾病史、精神病史。所有研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)，此項(xiàng)研究經(jīng)右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取收集受試者經(jīng)EDTA-K2+抗凝的全血樣本2～3 mL。 DNA提取試劑盒為深圳亞能生物科技有限公司生產(chǎn)，所有實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)規(guī)范和使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，所提取的DNA-80 ℃條件保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR引物設(shè)計(jì)及反應(yīng)體系Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)SAMD4位點(diǎn)擴(kuò)增引物，由上海天昊生物科技有限公司合成。PCR反應(yīng)體系(20 μL)含1x GC-I buffer(Takara)， 2 U 3.0 mM Mg2+，0.3 mM dNTP, 1 U HotStar Taq polymerase (Qiagen Inc.)，1 μL樣本DNA和1 μL多重PCR引物。PCR循環(huán)程序：1 step 95 ℃ 2 min，2 step 11個(gè)循環(huán)(94 ℃ 20 s，65 ℃ 40 s，72 ℃ 1.5 min)，3 step 24循環(huán)(94 ℃ 20 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min)，4 step 72 ℃ 2 min，4 ℃ forever。多重PCR產(chǎn)物純化：在20 μL PCR產(chǎn)物中加入5 U SAP酶和2 U Exonuclease Ⅰ酶，37 ℃水浴1小時(shí)，75 ℃ 滅活15 min。連接反應(yīng)體系：10x連接緩沖液 1 μL、高溫連接酶0.25 μL、5'連接引物混合液(1 μM)0.4 μL，3'連接引物混合液(2 μM)0.4 μL、純化后多重PCR產(chǎn)物2 μL、ddH2O 6 μL 混勻，連接程序38個(gè)循環(huán)(94 ℃ 1 min，56 ℃ 4 min)。

1.2.3 SNPs分型IMLDRTM多重SNP分型試劑盒(上海天昊)，rs3819122和rs34468925位點(diǎn)所在區(qū)段采用多重PCR反應(yīng)在一個(gè)體系中獲得擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)外切核酸酶/蝦堿酶(EXOI/SAP)純化后用于后續(xù)連接酶反應(yīng)的模板。每個(gè)位點(diǎn)包含兩個(gè)5'端等位基因特異探針和一條3'端位點(diǎn)的熒光標(biāo)記的特異探針。連接產(chǎn)物通過(guò)ABI3730XL毛細(xì)管電泳來(lái)區(qū)分(DNA測(cè)序及引物信息見(jiàn)表1)。

表1 rs3819122和rs34468925信息及PCR引物

1.3 其他種族人群信息通過(guò)ENSEMBL數(shù)據(jù)庫(kù)(千人基因組數(shù)據(jù))獲取北京漢族、中國(guó)南方漢族、非洲、美國(guó)、日本、歐洲、南亞女性人群rs3819122和rs34468925位點(diǎn)基因型和等位基因數(shù)據(jù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析運(yùn)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 24.0分析。用χ2檢驗(yàn)比較rs3819122和rs34468925位點(diǎn)基因型、等位基因組間分布頻率，用Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律驗(yàn)證各群體遺傳平衡水平，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 基因型分析SMAD4基因 rs3819122和 rs34468925 SNPs 分型顯示：rs3819122位點(diǎn)有AA、CA和CC基因型，rs34468925位點(diǎn)有CC、CT和TT基因型(見(jiàn)圖1)。

A為rs34468925位點(diǎn)CC、CT和TT基因型；B為rs3819122位點(diǎn)AA、CA和CC基因型

2.2 rs3819122和rs34468925 SNPs 在廣西壯族女性人群中的分布SMAD4基因rs3819122和 rs34468925位點(diǎn)基因型和等位基因在廣西壯族女性人群中的分布頻率如表2所示，rs3819122位點(diǎn)基因型以CA為主(43.8%)，其次是AA和CC(36.9%和19.3%)，A等位基因占58.8%。rs34468925位點(diǎn)基因型以CT為主(43.8%)，其次是CC和TT(42.9%和13.3%)，C等位基因占64.8%。用群體遺傳學(xué)Hardy-Weinberg平衡定律檢驗(yàn)基因型頻數(shù)，rs3819122(P=0.140)和 rs34468925(P=0.538)均符合H-W平衡定律(P>0.05)，結(jié)果表明群體基因遺傳平衡，所收集樣本來(lái)自同一孟德?tīng)柸后w。見(jiàn)表2。

表2 rs3819122和 rs34468925 SNPs 在廣西壯族女性人群中的分布[n(%)]

2.3 rs3819122和rs34468925 SNPs在其他人群中的分布從ENSEMBL數(shù)據(jù)庫(kù)中提取并篩選出具有區(qū)域代表性的(北京漢族、中國(guó)南方漢族、非洲、美國(guó)、日本、歐洲、南亞)女性人群SMAD4基因 rs3819122和 rs34468925位點(diǎn)的基因型和等位基因，并與廣西壯族女性人群進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示：廣西壯族女性人群rs3819122基因型與日本和南亞女性人群相比分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.275，P=0.016和χ2=23.907，P<0.001)，與北京漢族、中國(guó)南方漢族、非洲、美國(guó)、歐洲女性人群相比分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；等位基因與南亞人群相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=25.752，P<0.001)。rs34468925基因型與非洲和南亞女性相比分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=16.742，P<0.001和χ2=10.983，P=0.004)，與北京漢族、中國(guó)南方漢族、美國(guó)、日本、歐洲女性人群相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；等位基因與北京漢族、非洲和南亞女性人群相比分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.389，P=0.036、χ2=16.539，P<0.001和χ2=11.255，P=0.001)。見(jiàn)表3、表4。

表3 rs3819122在不同女性人群中的分布[n(%)]

表4 rs34468925在不同女性人群中的分布[n(%)]

3 討 論

20世紀(jì)90年代，SMADs首次被發(fā)現(xiàn)是TGF-β轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞內(nèi)介質(zhì)，它們從TGF-β通路中將信號(hào)直接傳遞到細(xì)胞核，并在細(xì)胞核介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。這一過(guò)程起始于R-SMAD磷酸化的驅(qū)動(dòng)，并與co-SMAD4 和I-SMAD相互作用形成SMADs-DNA-復(fù)合體進(jìn)行信號(hào)傳遞，目前被研究最多的是磷酸化的R-SMADs與SMAD4之間形成的復(fù)合體[5-6]。研究認(rèn)為，SMAD4對(duì)TGF-β通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)不是必需的，但它在SMADs-DNA復(fù)合體中起著關(guān)鍵的穩(wěn)定性作用，對(duì)信號(hào)具有最高的應(yīng)答反應(yīng)，并通過(guò)招募轉(zhuǎn)錄激活因子共同作用于轉(zhuǎn)錄反應(yīng)[7]。SMAD4高親和力和高特異性的DNA結(jié)合活性，使它能夠?qū)⒏鞣N轉(zhuǎn)錄因子的錯(cuò)綜復(fù)雜的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用引導(dǎo)到各自正確的調(diào)控元件上[8-9]。因此，SMAD4基因的缺失或突變被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞對(duì)TGF-β產(chǎn)生抵抗的基礎(chǔ)[10]。

本研究發(fā)現(xiàn)，廣西壯族健康女性人群中SMAD4基因rs3819122位點(diǎn)以CA基因型為主，與日本和南亞女性人群的分布頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。rs3819122以A等位基因?yàn)橹?，且與南亞女性人群分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而rs34468925位點(diǎn)的基因型以CT為主，與非洲和南亞女性人群分布頻率相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。rs34468925以C等位基因?yàn)橹?，與北京漢族、非洲、南亞女性人群的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？梢?jiàn)，本次研究的SMAD4基因rs3819122和 rs34468925位點(diǎn)不僅在廣西壯族女性人群中存在遺傳多態(tài)性，且與其他種族人群相比具有SNPs差異性。

MAROUF等[11]對(duì)摩洛哥人群中APOBEC3和DRIVER基因功能與乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性的研究發(fā)現(xiàn)，SMAD4 rs3819122與乳腺癌腫瘤大小有相關(guān)性。王佩[12]的研究發(fā)現(xiàn)，SMAD4 rs3819122 SNPs和環(huán)境之間的交互作用與強(qiáng)迫癥的嚴(yán)重程度相關(guān)，并可能成為預(yù)測(cè)強(qiáng)迫癥嚴(yán)重程度的一個(gè)指標(biāo)。SMAD4被認(rèn)為是胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)中最常見(jiàn)的基因改變之一，研究發(fā)現(xiàn)SMAD4在50%～55%的PDAC中特異性失活，且與PDAC較低的總體生存率、腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)[13]。研究表明SMAD4在95.8%的婦科原發(fā)腫瘤中有保留表達(dá)以及在鱗狀細(xì)胞癌(SCCs)中常見(jiàn)缺失[4,14]。另外，SMAD4基因在T細(xì)胞中調(diào)節(jié)細(xì)胞的存活、增殖、分化和生長(zhǎng)，T細(xì)胞中SMAD4基因的缺失或突變往往會(huì)導(dǎo)致種類(lèi)免疫性疾病[15]。因此，SMAD4基因無(wú)論是在TGF-β通路中的重要作用，還是自身高度遺傳多態(tài)性，它的突變或缺失都會(huì)對(duì)疾病發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生重要影響。

廣西地處西南邊陲，毗鄰東南亞多個(gè)國(guó)家，是以壯族為主的多個(gè)少數(shù)民族聚居區(qū)，與北京、江浙等中國(guó)經(jīng)濟(jì)較發(fā)達(dá)地區(qū)相比，經(jīng)濟(jì)、交通發(fā)展相對(duì)落后，人員流動(dòng)性少，居住地相對(duì)固定，是多種遺傳性疾病的高發(fā)地區(qū)，如地中海貧血、G6PD缺乏癥、鼻咽癌、肝癌等。本次研究主要是探討SMAD4在廣西壯族女性人群中的攜帶和突變頻率，同時(shí)了解該基因在其他人群的分布情況，為后續(xù)相關(guān)易感性疾病(如宮頸癌、乳腺癌等)的研究提供理論基礎(chǔ)。本研究也存在不足之處，如研究例數(shù)較少，研究種族單一，只針對(duì)壯族女性人群，未將其他少數(shù)民族人群納入其中。因此，從更多元、更深層次去研究SMAD4基因與易感疾病相關(guān)性，是未來(lái)研究的方向，力爭(zhēng)為相關(guān)易感性疾病提供更多理論支持。