陳銘浩，劉志豪，王永紅

（華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院，上海 200000）

乳酸（Lactic acid，LA）是一種非常重要的有機(jī)酸，分子式為CH3-CHOHCOOH，在食品、化工、紡織、醫(yī)藥等領(lǐng)域都有重要的應(yīng)用價(jià)值[1?3]。生物法生產(chǎn)乳酸具有環(huán)境友好、節(jié)能等優(yōu)勢(shì)，常用細(xì)菌或者根霉作為生產(chǎn)菌株，凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）具有耐高溫（50～55 ℃）、耐低pH、適應(yīng)開放式發(fā)酵[4]和產(chǎn)高光學(xué)純度L-乳酸等優(yōu)勢(shì)，因此在乳酸發(fā)酵行業(yè)備受關(guān)注[5?6]。

凝結(jié)芽孢桿菌的工業(yè)乳酸發(fā)酵主要以玉米質(zhì)淀粉水解液作為原料，由于分解代謝物阻遏（Carbon catabolite repression，CCR）效應(yīng)使發(fā)酵后期存在以異麥芽糖、海藻糖等為主的殘?zhí)牵瑥亩绊懭樗岬寐?、發(fā)酵周期和后期純化成本[7]。分解代謝物阻遏效應(yīng)是一種細(xì)胞在多種碳源并存情況下優(yōu)先選擇速效碳源進(jìn)行生長(zhǎng)的經(jīng)典代謝調(diào)控機(jī)制。Nair等[8]已闡明厚壁菌門細(xì)菌在營(yíng)養(yǎng)充足即有葡萄糖存在的情況下，通過上調(diào)誘導(dǎo)物排斥效應(yīng)機(jī)制中的關(guān)鍵基因ccpA和hprK，觸發(fā)CCR效應(yīng)。

混合碳源乳酸發(fā)酵過程中，在速效碳源利用向緩效碳源利用轉(zhuǎn)變期間，菌體由于得不到充足的碳源供應(yīng)而出現(xiàn)明顯自溶的現(xiàn)象[9]，這種菌體為響應(yīng)各種環(huán)境壓力而出現(xiàn)的自溶在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中起到重要作用[10?11]。菌體自溶不僅會(huì)延長(zhǎng)發(fā)酵周期，還會(huì)影響后期產(chǎn)品純化，所以減少菌體自溶在發(fā)酵調(diào)控中非常關(guān)鍵。發(fā)酵環(huán)境中的溶氧、pH、金屬離子和滲透壓都會(huì)對(duì)菌體自溶造成不同程度的影響[12]，但目前對(duì)于凝結(jié)芽孢桿菌菌體自溶的報(bào)道較少，因此研究影響菌體自溶的關(guān)鍵因素對(duì)于優(yōu)化凝結(jié)芽孢桿菌乳酸發(fā)酵條件和提高發(fā)酵效率具有重要意義。

為探究影響菌體自溶的關(guān)鍵因素以及優(yōu)化發(fā)酵條件，本文首先研究了不同pH、通氣量和中和劑對(duì)5 L罐凝結(jié)芽孢桿菌混合碳源乳酸發(fā)酵的影響。隨后研究了金屬離子、滲透壓等條件對(duì)在饑餓環(huán)境中菌體自溶和活性的影響。本研究為凝結(jié)芽孢桿菌混合碳源乳酸發(fā)酵過程代謝轉(zhuǎn)變調(diào)控機(jī)理的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

凝結(jié)芽孢桿菌（B. coagulans）ATCC7050 為NCBI上已記錄的菌株，美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所；氨基酸 分析純，阿拉??；無機(jī)鹽 分析純，凌峰化學(xué)；葡萄糖、海藻糖 分析純，泰坦科技。

ICS3000型離子色譜、NanoDrop 2000c型超微分分光光度計(jì) 美國(guó)Thermo公司；DGU-20A型HPLC 日本島津公司；FE-20型pH計(jì) 瑞士梅特勒托利多公司；5 L生物反應(yīng)器 國(guó)強(qiáng)生化裝備公司；OM819.C型冰點(diǎn)滲透壓儀 雅森博科科學(xué)儀器有限公司；752型紫外可見分光光度計(jì) 菁華科技儀器有限公司（上海）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 凝結(jié)芽孢桿菌的活化和培養(yǎng)

1.2.1.1 種子培養(yǎng) 從?20 ℃冰箱中取出B.cagulansATCC7050甘油凍存管，解凍后吸取250 μL菌液到斜面培養(yǎng)基，并用竹簽涂抹均勻，放到50 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h得到一級(jí)斜面，用竹簽刮取菌苔涂布于兩個(gè)新的斜面中，放到50 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)14 h得到二級(jí)斜面。用50 mL無菌水將活化后的菌體從二級(jí)斜面上洗脫下來接入（接種量為15%，V/V）100 mL MRS培養(yǎng)基中，在50 ℃搖床中100 r/min，培養(yǎng)12 h[9]。

1.2.1.2 5 L生物反應(yīng)器發(fā)酵 將無菌水洗滌后的種子液接入含有混合碳源合成培養(yǎng)基MCDM3++[9]的5 L罐中（接種量為10%，V/V）50 ℃培養(yǎng)，發(fā)酵體積為4 L，轉(zhuǎn)速100 r/min，控制相應(yīng)通氣量，使用相應(yīng)中和劑控制pH。合成培養(yǎng)基MCDM3++[13]（g/L）：葡萄糖20、海藻糖20、乙酸鈉2、K2HPO40.3、KH2PO40.3、檸檬酸氫二銨1、丙氨酸0.5、半胱氨酸0.5、谷氨酸0.5、精氨酸0.5、組氨酸0.5、異亮氨酸0.5、甲硫氨酸0.5、亮氨酸0.5、蘇氨酸0.5、纈氨酸0.5、酪氨酸0.5、鳥嘌呤0.075、硫胺素0.005、葉酸0.005、MgSO40.5、FeSO40.02、MnSO40.05。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 乳酸發(fā)酵條件的單因素實(shí)驗(yàn) 本實(shí)驗(yàn)考察了氫氧化鈉作為中和劑，不同通氣量（0、2.4、4.8、7.2和24 L/h）和不同pH（5.5、6.0、6.5）分別對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌乳酸發(fā)酵特性的影響；氫氧化鈣作為中和劑，通氣量為7.2 L/h時(shí)，不同pH（5.5、6.0、6.5）對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌乳酸發(fā)酵特性的影響。

1.2.2.2 菌體自溶的單因素實(shí)驗(yàn) 分別考察滲透壓相同的不同鹽溶液（CaCl20.2 mol/L，NH4Cl 0.3 mol/L，NaCl 0.3 mol/L，MgCl20.2 mol/L，KCl 0.3 mol/L）、不同滲透壓的NaCl溶液（0.1、0.2、0.3、0.5 mol/L）以及滲透壓相同而Na+：Ca2+摩爾比不同（1:0、1:2、1:1、2:1、0:1）的NaCl和CaCl2混合溶液分別對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌在饑餓狀態(tài)下菌體自溶的影響。本實(shí)驗(yàn)收集發(fā)酵8 h時(shí)的菌體重懸于上述溶液并保持OD620一致，50 ℃恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)24 h后測(cè)定OD620、菌落形成單位（Colony forming units，CFU）以及胞外溶出蛋白。

1.2.3 指標(biāo)檢測(cè)和計(jì)算方法

1.2.3.1 菌體光密度測(cè)定 本實(shí)驗(yàn)采用可見光分光光度計(jì)在620 nm處測(cè)定菌體光密度。取適量的菌液并用1 mol/L的稀鹽酸稀釋到適當(dāng)倍數(shù)（排除碳酸鈣固體對(duì)測(cè)量的干擾），分光光度計(jì)的讀數(shù)控制在0.2～0.8，超出此范圍會(huì)影響數(shù)值的準(zhǔn)確性。

1.2.3.2 菌落形成單位測(cè)定 取菌液稀釋到一定的倍數(shù)，吸取100 mL菌液涂布于平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24 h后數(shù)菌落數(shù)（每個(gè)平板菌落數(shù)控制在50個(gè)左右）乘稀釋倍數(shù)并記錄。

1.2.3.3 糖含量測(cè)定 使用離子色譜系統(tǒng)HPIC檢測(cè)，搭配Dionex Carbopac PA 20分離柱（3 mm×150 mm）和Dionex Carbopac PA 20保護(hù)柱（3 mm×30 mm），淋洗液體系由超純水、200 mmol/L NaOH溶液兩部分組成，并用氮?dú)飧艚^空氣。取10 mL發(fā)酵液樣品4 ℃，4000 r/min離心10 min，將上清和飽和草酸鈉溶液按照1:3的比例進(jìn)行混合（除去發(fā)酵液中Ca2+），4 ℃，4000 r/min離心23 min，留上清；然后將上清和無水乙醇按照1:5的比例混合（沉淀蛋白質(zhì)），常溫靜置8 h以上，離心。檢測(cè)過程中梯度洗脫方法：0～20 min用超純水與200 mmol/L NaOH 按照9:1比例進(jìn)行洗脫；20～30 min用200 mmol/L NaOH進(jìn)行洗脫；30～60 min用超純水與200 mmol/L NaOH 按照 9:1比例進(jìn)行平衡柱子[7]。葡萄糖和海藻糖的標(biāo)曲方程見表1。

表1 葡萄糖和海藻糖及乳酸測(cè)定標(biāo)曲方程Table 1 Standard equation for the determination of glucose,trehalose and lactic acid

1.2.3.4 乳酸含量測(cè)定 使用HPLC檢測(cè)，采用氫柱（VARIAN Metacarb-H plus column），柱前加保護(hù)柱，檢測(cè)器為SPD-20AV，流動(dòng)相為0.01 μmol/L稀硫酸，流速0.4 mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，進(jìn)樣量10 μL，柱溫50℃，檢測(cè)時(shí)間45 min。樣品前處理：取10 mL發(fā)酵液離心，0.22 μm水相濾膜過濾上清液至液相小瓶中，用于HPLC測(cè)定[14]。乳酸的標(biāo)準(zhǔn)方程見表1。

1.2.3.5 溶出蛋白的測(cè)定 菌體自溶實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)24 h后的菌液取5 mL，4000 r/min離心23 min，取上清，用超微量分光光度計(jì)測(cè)蛋白濃度。

1.2.3.6 糖酸轉(zhuǎn)化率計(jì)算 為了分析不同條件下混合碳源乳酸發(fā)酵特性，可以通過計(jì)算不同碳源的糖酸轉(zhuǎn)化率來進(jìn)行評(píng)價(jià)，糖酸轉(zhuǎn)化率公式如下：

式中：Yp/s為糖酸轉(zhuǎn)化率，g/g；CfLac為檢測(cè)點(diǎn)乳酸濃度，g/L；CiLac為初始乳酸濃度，g/L；CfCar為檢測(cè)點(diǎn)糖濃度，g/L；CiCar為初始糖濃度，g/L。

1.2.3.7 菌體自溶率計(jì)算 為了分析不同自溶實(shí)驗(yàn)條件對(duì)菌體自溶程度的影響，可以通過計(jì)算菌體自溶率進(jìn)行評(píng)價(jià)，菌體自溶率公式如下：

式中：ODi為初始OD620；ODf為最終OD620。

1.2.3.8 菌體存活率計(jì)算 為了分析菌體自溶前后的活性變化，可以通過計(jì)算菌體存活率進(jìn)行評(píng)價(jià)，菌體存活率公式如下：

式中：CFUi為初始菌落數(shù)；CFUf為最終菌落數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本研究每個(gè)樣品設(shè)置三個(gè)生物學(xué)重復(fù)，采用Excel和OriginPro（2021）進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 凝結(jié)芽孢桿菌混合碳源乳酸發(fā)酵特性

B. coagulansATCC7050 5 L罐混合碳源乳酸發(fā)酵過程可分為三個(gè)階段：階段I為葡萄糖消耗階段，階段II為有機(jī)酸消耗階段，階段III為海藻糖消耗階段。

由圖1可知，階段I（0～10 h）菌體立即進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期OD620在發(fā)酵10 h達(dá)到5.4；階段II（10～15 h）菌體快速自溶，OD620在15 h下降至2.0；階段III（15 h至發(fā)酵結(jié)束）OD620維持在1.4左右直至發(fā)酵結(jié)束。乳酸生成呈現(xiàn)明顯的分段現(xiàn)象，階段I發(fā)酵到10 h乳酸濃度為17.53 g/L，乳酸生成速率為1.95 g/L/h，糖酸轉(zhuǎn)化率為0.88 g/g，階段III乳酸生成較為緩慢，發(fā)酵結(jié)束乳酸濃度為23.29 g/L乳酸，乳酸生成速率0.08 g/L/h，糖酸轉(zhuǎn)化率為0.64 g/g。用NaOH作為中和劑的混合碳源乳酸發(fā)酵有明顯的碳源分級(jí)利用現(xiàn)象，階段I菌體將葡萄糖耗盡，葡萄糖消耗速率為2.12 g/L/h，但海藻糖未被利用。階段III海藻糖利用逐漸加快，至發(fā)酵結(jié)束仍有9.82 g/L的海藻糖未被利用，海藻糖消耗速率為0.13 g/L/h。

圖1 B.coagulans ATCC7050混合碳源5 L罐乳酸發(fā)酵Fig.1 Profiles of lactic acid fermentation by B. coagulans ATCC7050 with mixed carbon sources at 5 L bioreactor

葡萄糖耗完后菌體的大量自溶不僅會(huì)造成發(fā)酵周期變長(zhǎng)、乳酸得率降低和純化產(chǎn)物流程復(fù)雜，而且不利于分解代謝物阻遏效應(yīng)的研究[4]。為了緩解5 L罐中菌體降解[15]，以及提高發(fā)酵后期海藻糖利用效率，需對(duì)5 L罐的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。

2.2 不同通氣量對(duì)發(fā)酵特性的影響

凝結(jié)芽孢桿菌為兼性厭氧菌，溶氧會(huì)影響胞內(nèi)的氧化還原水平，從而影響乳酸的生成[16?18]。由圖2可知，不同通氣量都在發(fā)酵10 h OD620達(dá)到最高，通氣量為0、2.4、4.8、7.2和24 L/h的最高OD620分別為4.57、5.60、5.37、5.36和4.66。階段II不同通氣量的OD620均快速下降，階段III的OD620維持在1.4左右直至發(fā)酵結(jié)束。不同通氣量的乳酸濃度在階段I和階段II差距不大，在階段III 7.2 L/h通氣量的乳酸生成最高，直至發(fā)酵結(jié)束為22.89 g/L；0和24 L/h通氣量的乳酸濃度較低，直至發(fā)酵結(jié)束分別為18.49和16.64 g/L。通氣量為7.2 L/h的海藻糖消耗速率為0.12 g/L/h，均快于其他通氣量組。

圖2 B. coagulans ATCC7050混合碳源不同通氣量的5 L罐發(fā)酵結(jié)果Fig.2 Profiles of lactic acid fermentation by B. coagulans ATCC 7050 with mixed carbon sources in 5 L bioreactor under different ventilation

綜上所述，不同通氣量對(duì)菌體生成和自溶影響較小，菌體自溶現(xiàn)象并未得到改善。在7.2 L/h通氣量下底物消耗速率和產(chǎn)酸速率要優(yōu)于其他通氣量，可能是該階段菌體代謝主要以消耗海藻糖產(chǎn)乳酸為主，過高或過低的通氣量會(huì)破壞胞內(nèi)的氧化還原平衡不利于乳酸合成[19]。

2.3 不同pH對(duì)發(fā)酵特性的影響

由圖3可知，不同的pH都在階段I發(fā)酵10 h OD620達(dá)到最高，pH為5.5、6.0和6.5的最高OD620分別為5.57、5.36和4.22。階段II pH為5.5的OD620下降緩慢，其余兩組都快速下降。階段III pH為6.0的OD620維持在1.3左右直至發(fā)酵結(jié)束，pH為6.5菌體有二次生長(zhǎng)現(xiàn)象OD620從最低的1.22上升到發(fā)酵結(jié)束的2.45。在乳酸生成方面，階段I pH5.5的乳酸生成略低于pH6.0和6.5組，階段III pH5.5沒有乳酸生成，而pH6.0共生成4.34 g/L乳酸，pH6.5乳酸共生成16.62 g/L乳酸。階段III pH5.5不利用海藻糖，pH6.0共消耗11.45 g/L海藻糖，pH6.5海藻糖全部耗盡。pH5.5、6.0和6.5在階段I的糖酸轉(zhuǎn)化率分別為0.81、0.91、0.85 g/g，pH6.0和6.5在階段III的糖酸轉(zhuǎn)化率分別為0.38和0.81 g/g。

圖3 NaOH作為中和劑的B. coagulans ATCC7050混合碳源不同pH的5 L罐發(fā)酵結(jié)果Fig.3 Profiles of lactic acid fermentation by B. coagulans ATCC7050 with mixed carbon sources in 5 L bioreactor under different pH

綜上所述，pH越高在階段I不利于菌體生長(zhǎng)，但在階段III海藻糖消耗和乳酸生成優(yōu)勢(shì)明顯。雖然pH5.5在階段II的菌體自溶略有緩解，但在階段III OD620仍持續(xù)降低，原因可能是pH5.5時(shí)菌體整體代謝較為緩慢，并不足以維持較高的OD620，因此pH也并非引起菌體自溶的關(guān)鍵因素。pH對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌混合碳源乳酸發(fā)酵的菌體生長(zhǎng)[20?22]和代謝影響顯著，可能是由于不同的pH會(huì)影響胞內(nèi)代謝途徑。Chen等[23]通過代謝網(wǎng)絡(luò)模型模擬發(fā)現(xiàn)，凝結(jié)芽孢桿菌乳酸發(fā)酵提高pH能提高乳酸生成通量。

2.4 不同中和劑對(duì)發(fā)酵特性的影響

目前工業(yè)乳酸發(fā)酵常用氫氧化鈉或氫氧化鈣作為中和劑，前述用氫氧化鈉作為中和劑控制不同的pH時(shí)在葡萄糖消耗完菌體都大量自溶。氫氧化鈣作為中和劑的發(fā)酵結(jié)果如圖4所示，相同pH用氫氧化鈣作為中和劑的最高OD620都高于用氫氧化鈉作為中和劑，且階段II菌體自溶明顯減少。pH6.5在階段III直至發(fā)酵結(jié)束乳酸濃度為32.82 g/L，明顯高于其余兩組，pH5.5和6.0直至發(fā)酵結(jié)束乳酸濃度分別為21.60和26.86 g/L。pH6.5發(fā)酵結(jié)束海藻糖全部耗盡，其余兩組都未耗完。pH5.5、6.0和6.5在階段I的糖酸轉(zhuǎn)化率分別為0.77、0.82、0.77 g/g，在階段III的糖酸轉(zhuǎn)化率分別為0.50、0.64和0.87 g/g。

圖4 Ca（OH）2作為中和劑的B. coagulans ATCC7050混合碳源不同pH的5 L罐發(fā)酵結(jié)果Fig.4 Profiles of lactic acid fermentation by B. coagulans ATCC7050 with mixed carbon sources in 5 L bioreactor under different pH using Ca（OH）2 as neutralizer

用Ca（OH）2在階段I有更高的菌濃，且階段II菌體自溶明顯得到緩解，使得階段III能維持較高的菌濃有利于海藻糖消耗和乳酸生成。用Ca（OH）2和NaOH控制pH呈現(xiàn)明顯不同的發(fā)酵現(xiàn)象，可能是由于中和劑會(huì)造成發(fā)酵環(huán)境中金屬離子和滲透壓的差異[24?25]。金屬離子在細(xì)胞代謝中起著重要作用，許多蛋白質(zhì)均需要金屬離子作為輔因子才能具有活性[26?28]，故接下來研究了不同金屬離子、滲透壓等因素對(duì)饑餓狀態(tài)下凝結(jié)芽孢桿菌自溶的影響。

2.5 金屬離子對(duì)菌體自溶的影響

不同滲透壓對(duì)菌體自溶的影響如圖5A所示，0.2 mol/L NaCl組存活率明顯高于其他組，說明在附近滲透壓更有利于存活。0.5 mol/L組的自溶率明顯低于其余組，且如圖6A所示胞外蛋白濃度最少，可能是由于高滲環(huán)境中菌體脫水死亡，但菌體不裂解。不同離子對(duì)菌體自溶的影響如圖5B所示，Ca2+和Mg2+組菌體自溶率明顯低于其他一價(jià)金屬離子組，分別為28%和27%，如圖6B蛋白濃度和自溶成正比。Na+、K+和Mg2+組菌體的存活率顯著（P<0.05）高于Ca2+和NH4+組，NH4+不僅不能緩解菌體自溶，且對(duì)菌體有害[29]。為了進(jìn)一步探究Ca2+和Na+對(duì)菌體的影響，使用不同Na+：Ca2+混合溶液的結(jié)果如圖5C所示，當(dāng)有Ca2+存在時(shí)菌體自溶率均顯著（P<0.05）降低，有Ca2+存在時(shí)菌體的存活率遠(yuǎn)低于僅含有Na+組，如圖6C胞外蛋白濃度也能反映出菌體的自溶程度。

圖5 不同條件對(duì)菌體自溶的影響Fig.5 Effects of different conditions on cell autolysis

圖6 不同條件對(duì)胞外蛋白濃度影響Fig.6 Extracellular protein concentrations under the different conditions

綜上所述，Ca2+和Mg2+對(duì)菌體自溶有一定的緩解作用，可能是通過下調(diào)細(xì)胞壁水解相關(guān)基因同時(shí)上調(diào)細(xì)胞生長(zhǎng)分裂相關(guān)基因來緩解自溶[30]，而Na+和K+在饑餓環(huán)境中有利于維持菌體的活性。Lo等[31]也提出Mg2+離子可能對(duì)真核生物和原核生物細(xì)胞膜保護(hù)起到一定的作用，但目前機(jī)制尚未清楚。這也就能解釋用Ca（OH）2作為中和劑在階段I有較高菌濃，且在葡萄糖消耗完后，OD620緩慢下降直至啟用海藻糖，使階段III維持較高菌濃縮短發(fā)酵周期。

3 結(jié)論

本文用葡萄糖+海藻糖混合碳源模擬凝結(jié)芽孢桿菌工業(yè)乳酸發(fā)酵過程，并研究了不同通氣量、pH、中和劑對(duì)混合碳源乳酸發(fā)酵過程的影響。研究發(fā)現(xiàn)不同通氣量在階段I和階段II對(duì)糖耗和菌體生長(zhǎng)影響不大，在階段III通氣量為7.2 L/h的海藻糖消耗和乳酸生成優(yōu)于其他通氣量?？刂苝H為6.5時(shí)，在階段I雖然菌濃較低，但糖酸轉(zhuǎn)化率高，與pH5.5和6.0差異不大；在階段III耗糖和產(chǎn)酸速率均明顯優(yōu)于pH5.5和6.0，但較階段I仍有較大差距。與用NaOH作為中和劑相比，用Ca（OH）2做為中和劑在階段I有更高的菌濃，且階段II菌體自溶明顯得到緩解，在階段III能維持較高的菌濃有利于海藻糖消耗和乳酸生成。最后通過研究金屬離子、滲透壓和不同鈣鈉離子比在饑餓環(huán)境中對(duì)菌體自溶和活性的影響，發(fā)現(xiàn)Ca2+和Mg2+能緩解菌體自溶，Na+和K+在饑餓環(huán)境中有利于維持菌體的活性。