張績，周上鈴，何發(fā)，劉莉莎，張玉娟，何晉宇，杜曉秋

水稻-淀粉酶基因的表達模式與穎花開放的關(guān)系

張績，周上鈴，何發(fā)，劉莉莎，張玉娟，何晉宇，杜曉秋

南充市農(nóng)業(yè)科學院，四川南充 637000

【】淀粉降解與水稻漿片膨大和穎花開放過程密切相關(guān)，探究-淀粉酶基因在穎花開放過程中的作用，為雜交水稻制種效率及產(chǎn)量的提高提供理論依據(jù)?！尽吭谒緭P花時，利用稀釋堿性品紅溶液進行離體穗子吸水試驗，觀察堿性品紅在穎花中殘留的組織，通過碘-碘化鉀染色法確定11—14期（依據(jù)雄蕊發(fā)育分期）淀粉粒的分布變化，并通過RT-PCR、RT-qPCR和報告基因檢測多個-淀粉酶基因在此期間的時空表達模式?！尽克痉f花開放前，內(nèi)外稃片通過相互嵌合的鉤合槽（marginal tissues of palea，mtp）將漿片和雌雄蕊封閉在內(nèi)。當穎花開放時，漿片快速膨大，使得內(nèi)外稃片的鉤合點松開。揚花期間，離體穗子在稀釋堿性品紅溶液中吸水后，堿性品紅染料主要殘留在內(nèi)外稃片鉤合槽和漿片相連處組織以及花絲中。碘染試驗顯示，在12期（穎花開放前），淀粉粒主要分布在雄蕊和內(nèi)外稃片鉤合槽，漿片中也有少量淀粉粒，在13—14期（穎花開放中），內(nèi)外稃片鉤合槽和漿片中的淀粉粒均降解。RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)和的表達量從12期開始上升，至13—14期表達量顯著增強，到受精后1 d（1 day after pollination，DAP1）表達量又明顯下降，和在此過程中持續(xù)表達，表達量弱于RT-qPCR分析顯示，在11—14期，表達量變化最顯著，其次是和，的表達量變化幅度最不明顯，和在13—14期表達量顯著增加，而和在不同時期均表達，在13—14期表達量略有升高。在12期，主要在內(nèi)外稃以及內(nèi)外稃片鉤合槽上表達，在13—14期主要在內(nèi)外稃片鉤合槽、漿片以及花絲上表達?！尽克痉f花開放過程中淀粉粒在mtp和漿片中明顯降解，與、等-淀粉酶基因時空表達模式相對應，可能與水稻漿片膨大導致穎花開放過程密切相關(guān)。

水稻；-淀粉酶；穎花開放；淀粉粒；漿片膨大

0 引言

【研究意義】水稻穎花開放過程是一個反應迅速、精細調(diào)控的生理過程，對水稻授粉起重要作用。穎花開放閉合時間較短，一般不超過2 h，在這段時間內(nèi)，穎花要完成花絲伸長、花藥開裂、散粉、受精等一系列過程，開閉穎過程如果受到內(nèi)、外部因素影響不能正常進行，會導致父、母本花期不遇，嚴重制約雜交水稻制種效率。研究水稻開閉穎分子調(diào)控機理，為雜交水稻制種效率及產(chǎn)量的提高提供理論依據(jù)，對雜交水稻穩(wěn)產(chǎn)具有重要意義。【前人研究進展】水稻穎花開放是由漿片吸水膨大所啟動，漿片膨大將外稃向外推開，同時將內(nèi)稃向內(nèi)壓擠，使外稃和內(nèi)稃的鉤合點松開，外稃和內(nèi)稃相互分開，同時雄蕊花絲急速伸長，使花藥伸出穎殼并裂開，花粉散落，進行授粉。漿片中大量薄壁組織細胞中分散管狀分子[1]，這種結(jié)構(gòu)可能有利于漿片細胞內(nèi)滲透壓快速增加而吸水促使薄壁組織細胞迅速膨脹[2]。漿片的薄壁細胞無次生壁，只有初生壁，細胞中有大量液泡。漿片靠外稃一側(cè)的薄壁細胞吸水后體積變化大，可增至開穎前體積的一倍[1]。Pissarek[3]測量玉米和濱草漿片的滲透壓，發(fā)現(xiàn)其先升再降。YAN等[4]提取水稻膨大的漿片汁液，用菲林試劑測定呈現(xiàn)典型糖反應。Pissarek[3]推測水稻開花的滲壓劑之一可能是淀粉快速水解的產(chǎn)物。王忠等[1]對開花前后水稻漿片的K+含量、可溶性糖以及淀粉等內(nèi)含物作了比較，發(fā)現(xiàn)開穎前2 h、開穎中和開穎后2 h，漿片中K+含量（μg每對漿片）分別為2.208、2.240和0.788 μg；可溶性糖含量（μg每對漿片）分別為10. 32、23.25和12.55 μg；而淀粉含量（μg每對漿片）在開穎前2 h為10.05 μg，開穎中為6.52 μg。同時，還在漿片中檢測到淀粉酶活性，并成功分離。結(jié)果表明，可溶性糖是引起水稻漿片滲透勢變化的主要物質(zhì)。淀粉是植物細胞中碳水化合物最普遍的儲藏形式，在質(zhì)體中合成，貯存在淀粉粒中。淀粉降解主要通過水解或磷酸化反應[5]，這個過程由多種酶共同作用，如-淀粉酶、-淀粉酶、淀粉脫支酶、-葡萄糖苷酶、淀粉磷酸化酶等[6]。-淀粉酶既可作用于淀粉粒，也可作用于可溶性淀粉，在淀粉降解過程中發(fā)揮重要作用[7-8]，-淀粉酶在胚乳中的水解作用研究較多，在種子萌發(fā)過程中，-淀粉酶從糊粉層和胚盾片分泌到胚乳中，降解淀粉粒中的淀粉[9-10]。在水稻基因組上有十余個-淀粉酶編碼基因[11-13]，-淀粉酶時空表達模式研究發(fā)現(xiàn)不同異構(gòu)體在不同組織中發(fā)揮其功能[14-15]。前人已分離到一些與開穎和漿片膨大相關(guān)的突變體，如，水稻生長素氧化雙加氧酶（dioxygenase for auxin oxidation，DAO）失活的突變體，其不能正常開穎和散粉，表現(xiàn)單性結(jié)實[16-17]。通過分析突變體和野生型漿片中25個的RNA-seq數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)突變體中表達量顯著降低[18]。OsARF2直接調(diào)節(jié)的表達。過量表達可顯著恢復和突變體不能正常開穎和結(jié)實的表型[18]。突變體內(nèi)外稃片最大張開角度顯著大于野生型，其漿片吸水容量和膨大體積均大于野生型。研究發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)漿片細胞壁纖維素[19]。2個等位突變體的小花均停留在開放階段，OsJAR1是一個茉莉酸-氨基酸合酶，對小花開放、關(guān)閉以及花藥裂開十分重要[20]。【本研究切入點】王忠等[1]在開穎期漿片中分離到淀粉酶，表明淀粉酶可能參與水稻穎花開放過程，促進可溶性糖含量增加，引起水稻漿片滲透勢發(fā)生顯著變化，但哪些淀粉酶在此過程中起作用，尚不明確。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究通過碘染檢測水稻小花11—14期淀粉粒的分布情況變化，并通過RT-PCR、RT-qPCR和-淀粉酶啟動子驅(qū)動報告基因分析水稻-淀粉酶在此過程時空表達模式，以期探究-淀粉酶基因在穎花開放過程中發(fā)揮其功能的作用部位。對-淀粉酶與穎花開放相關(guān)的時空表達模式研究有助于探明水稻開穎過程的調(diào)控機理

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料選用粳稻日本晴，栽植于南充市農(nóng)業(yè)科學院試驗田，按常規(guī)方法管理。在抽穗開花期，選擇生長一致的稻穗用于試驗。

1.2 堿性品紅溶液吸水試驗

上午8：00—9：00，選取當天即將揚花的穗子，在戶外太陽照射下放置于稀釋10倍的堿性品紅溶液中，午后選取當天上午開穎揚花完畢的小花，于體視鏡下觀察品紅在組織中的著色情況。

1.3 淀粉染色

將碘化鉀和碘配制成1%碘試劑，置棕色瓶中暗處保存。選取水稻穗中部小花，用FAA溶液固定過夜，取出并加入適量0.1%碘化鉀溶液。用玻璃棒攪動使小花全部浸沒。靜置1—2 h，于體視鏡下觀察。

1.4 表達載體的構(gòu)建

用引物Os06g49970_PRO up和Os06g49970_PRO down擴增獲得（Os06g49970）啟動子（電子附表1）。pCAMBIA1301載體經(jīng)dⅢ和Ⅰ雙酶切，回收，以Klenow酶補平黏性末端，用T4連接酶連接平末端，改建為pGUS1301載體。用Ⅰ和Ⅰ雙酶切pGUS1301載體和，將二者用T4連接酶連接，構(gòu)建成::載體。

1.5 水稻轉(zhuǎn)化與GUS染色

將構(gòu)建好的表達載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105，利用農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化水稻日本晴愈傷組織。用50 mg·L-1潮霉素B篩選陽性愈傷組織。篩選出的陽性愈傷組織在再生培養(yǎng)基上誘導出苗。提取再生苗DNA，用引物進行檢測，將有目標條帶的陽性植株移栽到溫室土壤中進行生長。光照條件為16 h光照/8 h黑暗，溫度保持在（27±5）℃。T0轉(zhuǎn)基因植株收獲種子，T1于正季種植于試驗田中，并通過上述PCR方法檢測出陽性單株用于GUS染色。

參照Jefferson等[21]方法進行GUS組織化學染色。取轉(zhuǎn)基因水稻穗中部小花放入含X-Gluc的反應液，37℃染色16 h。用70%乙醇脫色，體視鏡觀察拍照。

1.6 RNA的提取及RT-PCR

使用TRIzol試劑分別提取11—14期穗中部小花總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR反應程序為94℃ 3 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，25—30個循環(huán)；72℃ 10 min。每個試驗均重復3次以上。

1.7 RT-qPCR

RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄成cDNA同1.6。PCR反應程序為95℃ 10 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃30 s，40個循環(huán)；72℃ 5 min。以水稻為內(nèi)參基因。采用2-??CT法計算得到基因的相對表達量。每個試驗均重復3次以上。

2 結(jié)果

2.1 水稻開穎過程的觀察

水稻花發(fā)育分期有多種定義，根據(jù)穗發(fā)育特征定義為8個階段，根據(jù)雄蕊發(fā)育不同階段定義為14個階段[22]，為了檢測-淀粉酶基因在開穎前和開穎中的表達模式變化，采用分期更為細致的14階段。11期為小孢子進行第一次有絲分裂；12期為生殖細胞進行第二次減數(shù)分裂，13期為外稃張開，花藥開始開裂；14期為授粉階段。水稻穎花開放前，內(nèi)外稃片通過相互嵌合的鉤合槽將漿片和雌雄蕊封閉在內(nèi)。漿片位于穎花基部，與內(nèi)稃相連。水稻內(nèi)外稃片開張是由漿片吸水膨大所致，漿片快速膨大，將外稃向外推開，同時將內(nèi)稃向另一側(cè)擠壓，使得內(nèi)外稃片的鉤合點松開，同時雄蕊花絲也急速伸長，使花藥伸出穎殼外進行授粉（圖1）。

在揚花期，通過觀察離體穗子吸收稀釋堿性品紅溶液漿片中快速膨脹和萎縮的組織，結(jié)果顯示，在漿片和內(nèi)外稃片鉤合槽有較多品紅染料殘留（圖2-A），花絲中也能觀察到品紅染料殘留（圖2-B）。

2.2 水稻花發(fā)育不同階段淀粉粒的分布變化

觀察11—14期小花淀粉粒的分布情況。11期，淀粉粒染色反應主要分布在小穗軸、內(nèi)稃基部、內(nèi)外稃片鉤合槽及漿片中，雄蕊和雌蕊中均無明顯染色。12期，淀粉粒染色反應主要分布于雄蕊、內(nèi)外稃片鉤合槽，漿片邊緣也有微弱的著色；13—14期（開穎后1 h取材料）淀粉粒染色反應主要分布在花粉中，內(nèi)外稃片鉤合槽有微弱的著色（圖3）。結(jié)果表明，淀粉粒在水稻小花11—14期的花粉中積累增加，而在小穗軸、內(nèi)外稃片基部、內(nèi)外稃片鉤合槽以及漿片中逐漸減少。

A：左為13期，右為14期；標尺為2 mm；B：13期漿片放大觀察，標尺為0.5 mm；C：14期漿片放大觀察，標尺為0.5 mm

2.3 α-淀粉酶的RT-PCR分析

為進一步確定哪些淀粉酶基因可能在開穎過程中發(fā)揮作用。根據(jù)其序列結(jié)構(gòu)特征，將水稻基因組的10個-淀粉酶分為3個亞家族——Amy1、Amy2和Amy3，前人對其中8個基因在種子發(fā)育及萌發(fā)過程開展了較為詳盡的功能研究，分別為（Os02g52700）、（Os01g25510）、（Os06g49970）、（Os09g28400）、（Os08g36900）、（Os08g36910）、（Os04g33040）和（Os01g51754）[13, 23]；另外尚未開展功能研究的為（Os02g52710）和（Os09g28420）。這些-淀粉酶基因在水稻小花開穎前、中的表達模式尚未報道。

運用RT-PCR檢測11—14期水稻小花中10個-淀粉酶基因的表達情況。結(jié)果表明，和在12期開始有微弱表達，13—14期表達量達到最高，受精后1 d（1 day after pollination，DAP1）又有不同程度下降。在此期間，均有較高水平的表達。持續(xù)表達，但表達量較弱。其他-淀粉酶編碼基因的表達量很弱或基本無表達（圖4）。

2.4 α-淀粉酶的RT-qPCR分析

進一步通過RT-qPCR檢測11—14期水稻小花中4個-淀粉酶的表達量變化情況（圖5）。、、和均在13—14期表達量最高，其中，在13—14期表達量比11—12期的增加幅度變化最大，和在13—14期表達量比11—12期增加幅度較小。

2.5 利用GUS報告基因分析OsRAmy2A表達模式

在開穎過程中表達量變化最為顯著，通過PCR擴增克隆啟動子構(gòu)建表達載體轉(zhuǎn)化水稻日本晴來檢測其在穎花不同部位的表達模式。經(jīng)PCR驗證，獲得7株陽性獨立株系，對不同獨立株系檢測在11—14期的表達部位。11期在小花上無明顯表達（圖6-A—C），12期啟動子驅(qū)動主要在內(nèi)外稃上有表達，在內(nèi)外稃片鉤合槽處可見較明顯GUS染色，其他花器官中無明顯表達（圖6-D—F）。13—14期在內(nèi)外稃片中無明顯表達，剝?nèi)ネ怙螅梢奊US染色主要分布在漿片、內(nèi)外稃片鉤合槽以及花絲等部位（圖6-G—I）。

DAP1：受精后1 d。基因名旁括號內(nèi)數(shù)字為RT-PCR循環(huán)數(shù)

圖5 α-淀粉酶基因在小花開穎前、開穎中的RT-qPCR分析

A—C：11期；D—F：12期；G—I：13—14期，標尺為2 mm。An：花藥 A-C: stage 11; D-F: stage 12; G-I: stage 13-14, Bar=2 mm. An: anther

3 討論

3.1 α-淀粉酶基因在穎花開放過程中高水平表達，可能與穎花中淀粉粒降解密切相關(guān)

本研究10個水稻-淀粉酶在11—14期小花中有明顯表達分化。和在11期基本不表達，12期開始弱表達，13—14期表達量最高，一直保持較高水平表達，持續(xù)表達但表達量較弱。其他6個-淀粉酶基因在11—14期穎花中表達量很弱或基本不表達。-淀粉酶基因在種子萌發(fā)過程中的表達模式及功能研究較為清楚，主要參與水解淀粉供胚生長。本研究和在穎花13—14期特異高水平表達，可能與穎花中淀粉粒降解密切相關(guān)。前人研究發(fā)現(xiàn)在開穎前2 h內(nèi)，水稻漿片細胞內(nèi)淀粉粒數(shù)量減少，淀粉粒減小，含淀粉粒細胞數(shù)量也迅速減少[24]。本研究關(guān)于穎花在開放前、開放中淀粉粒的分布變化結(jié)果與前人研究相似。突變體不能正常開穎，研究者對比分析了野生型和突變體上午9：00— 10：00收集的漿片的轉(zhuǎn)錄組，差異表達基因中包含多個淀粉、糖代謝過程相關(guān)基因[25]。本研究進一步為-淀粉酶基因參與漿片膨脹促使穎花開放這一過程提供了證據(jù)。除了通過RT-PCR、RT-qPCR方法檢測-淀粉酶基因表達水平外，啟動子驅(qū)動報告基因在穎花13—14期mtp、漿片中特異表達，與這些部位淀粉粒顯著減少相對應，暗示等-淀粉酶基因參與調(diào)控穎花開放過程中淀粉粒降解。

漿片快速吸水膨脹促使水稻開穎發(fā)生[26-27]。王忠等[1]對開花前后水稻漿片的內(nèi)含物做了比較，檢測到開花時每對漿片的淀粉含量比開花前少3.53 μg，而可溶性糖增加了12.93 μg，證明開穎前水稻漿片淀粉快速降解轉(zhuǎn)化為糖類物質(zhì)，但因為膨大漿片中增加的可溶性糖含量明顯大于減少的淀粉量，其可溶性糖除來自其自身淀粉水解外，還可能來自其他花器官的輸入。漿片與內(nèi)外稃片鉤合槽相連，彼此之間無明顯界限[2]。品紅吸水試驗顯示開穎之后殘留的品紅主要位于漿片和內(nèi)外稃片鉤合槽相連處，說明此處的薄壁組織細胞經(jīng)歷了快速吸水膨脹和萎縮的過程，從而將外稃向外推開，使得外稃和內(nèi)稃的鉤合點松開。12期淀粉粒貯藏在內(nèi)外稃片鉤合槽中，13—14期碘染檢測到該位置淀粉粒明顯降解，說明其很可能是漿片可溶性糖的供應器官之一。穎花開放與花絲伸長幾乎同時發(fā)生[28]。在13—14期花絲中的表達暗示淀粉降解可能也參與花絲伸長。

3.2 α-淀粉酶基因功能冗余在穎花開放中發(fā)揮作用

前人研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)水稻所有-淀粉酶基因都在萌發(fā)種子、愈傷組織中大量表達，但在其他組織中表達模式明顯分化。在受精后發(fā)育的子房和胚中表達，在受精后10 d胚中表達量最高[29]；在抽穗期葉鞘中表達量增加[30]。只在受精后42 d成熟種子胚乳中表達；在快要開花的成熟花藥中表達量明顯上調(diào)，在授粉后子房發(fā)育前期有較強表達[29]；呈組成型表達，即在不同萌發(fā)時間的種子、根、幼苗、不同發(fā)育階段的花藥、穎殼以及授粉后不同時期的子房中轉(zhuǎn)錄水平起伏幅度不太大[29]。-淀粉酶的表達分化說明不同基因受到特異調(diào)控，單個基因被敲除或突變后又無任何表型，說明多個-淀粉酶基因可能功能冗余在某一特定過程發(fā)揮作用，本研究和的表達模式比較類似，12期開始表達，13—14期表達量最高，DAP1表達量又下降。和的表達模式也比較類似，呈現(xiàn)持續(xù)性表達模式。這兩種表達模式暗示它們可能受到不同上游因子調(diào)控[26-28]。

4 結(jié)論

水稻穎花開放淀粉粒降解主要發(fā)生在mtp和漿片中，和在穎花開放時表達量顯著增加，在mtp、漿片和花絲中特異表達，可能與穎花開放時淀粉降解以及漿片膨大密切相關(guān)。

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Expression pattern of the rice-amylase genes related with the process of floret opening

Zhang Ji, Zhou Shangling, He Fa, Liu Lisha, Zhang Yujuan, He Jinyu, Du Xiaoqiu*

Nanchong Academy of Agricultural sciences, Nanchong 637000, Sichuan

【】Starch degradation is involved in lodicule absorbing abundant water and swelling during rice floret opening, but the amylase genes associated with this process have not been identified yet. 【】To identify the swelling of tissues during floret opening, therice panicles absorbed diluted Fuchsin basic and the dye remains were observed after florets were closing again. The starch grain distribution in rice florets before and during anthesis from stage 11 to stage 14 (according to 14 stages of rice anther development) was detected using iodide staining. The spatial-temporal expression patterns of 10-amylase genes were detected by RT-PCR, RT-qPCR and GUS staining. 【】Before floret opening, the stamens, pistils and lodicules are enclosed by the lemma and palea through marginal tissues of palea (mtp). Rapid swelling of the lodicules causes floret opening by separating the lemma from the palea. After thepanicles absorbed diluted Fuchsin basic during floret opening, the dye remains were observed located in the joint between mtp and lodicules and filaments. Iodide staining showed that the starch grains were mainly located in the stamens and mtp and a small amount of starch grains in the lodicules at stage 12 (before floret opening), whereas the starch grains in the mtp and lodicules were almost completely degraded at stage 13-14 (during floret opening). RT-PCR showed thatandbegan to express from stage 12 and were expressed with high levels at stage 13-14. The expression levels of the two genes decreased at DAP1 (1 day after pollination).andkept expressed during this process. The expression level ofwas higher than that ofThe RT-qPCR analysis showed that the expression level ofincreased most dramatically at stage 13-14, followed byand. Further, the transgenic plants expressing thereporter gene driven by thepromoter were generated. The GUS signaling was located only in the lemma, palea and mtp at stage 12 and the expression of thegene driven by thepromoter was induced in the mtp, lodicules and filaments at stage 13-14. 【】These data indicated that starch grain degradation in the mtp and lodicules at stage 13-14 might be related with high expression levels of some-amylase genes such asand, probably involved in controlling lodicules swelling and floret opening in rice.

rice;-amylase; floret opening; starch grain; lodicules swelling

2022-10-31；

2023-01-19

國家水稻產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系南充綜合試驗站項目（CARS-01-78）、2021年四川省博士后創(chuàng)新實踐基地項目

張績，E-mail：1432743534@qq.com。通信作者杜曉秋，E-mail：ncduxiaoqiu@163.com

（責任編輯 李莉）