鄭桃林,劉超,彭璠

(解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第921醫(yī)院:1內(nèi)分泌科,2干部病房,長(zhǎng)沙 410003)

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)是以高血糖、胰島素抵抗和相對(duì)胰島素缺乏為特征的慢性代謝疾病。目前,全世界有3.66億糖尿病患者,到2030年,這一數(shù)字將達(dá)到5.52億[1]。有研究表明,糖尿病與認(rèn)知功能多個(gè)領(lǐng)域的表現(xiàn)下降及大腦結(jié)構(gòu)異常密切相關(guān)[2],長(zhǎng)期糖尿病會(huì)導(dǎo)致患者認(rèn)知能力下降,從而增加癡呆的發(fā)生。輕度認(rèn)知功能障礙(mild cognitive impairment,MCI)[3]是介于正常老化與輕度癡呆之間的一種臨床狀態(tài),是正常認(rèn)知進(jìn)展到癡呆的過(guò)渡期。研究發(fā)現(xiàn),對(duì)于MCI及早進(jìn)行治療干預(yù)可以預(yù)防或延緩癡呆的發(fā)生[4]。因此,尋找能夠預(yù)測(cè)老年T2DM繼發(fā)MCI的生物標(biāo)志物,并采取相應(yīng)措施預(yù)防MCI的發(fā)生非常重要。

外泌體是由各種細(xì)胞釋放的納米級(jí)(直徑30～120nm)膜囊泡,通過(guò)胞外作用釋放到細(xì)胞外。外泌體中包含的物質(zhì)會(huì)根據(jù)宿主細(xì)胞的生理狀態(tài)發(fā)生顯著改變,因此外泌體被認(rèn)為是獲得致病信息和識(shí)別生物標(biāo)志物的新來(lái)源。神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)是糖酵解酶烯醇化酶的神經(jīng)元形式,主要位于神經(jīng)元的細(xì)胞質(zhì)中,是評(píng)估神經(jīng)元損傷的標(biāo)志物。Tau是一種細(xì)胞內(nèi)微管相關(guān)蛋白,其在腦脊液中的總水平被認(rèn)為反映了正在進(jìn)行的神經(jīng)元死亡的程度。磷酸化tau(phosphorylated tau,P-tau)的過(guò)度磷酸化形式與癡呆疾病過(guò)程中神經(jīng)原纖維纏結(jié)的形成密切相關(guān),因此P-tau是癡呆的特異性生物標(biāo)志物[5]。本研究的主要目的是檢測(cè)T2DM患者血清外泌體中NSE及P-tau蛋白的表達(dá),探討其與繼發(fā)MCI的相關(guān)性,評(píng)估其是否可以作為老年T2DM患者發(fā)生MCI的潛在預(yù)測(cè)標(biāo)志物。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2019年1月至2020年12月于聯(lián)勤保障部隊(duì)第921醫(yī)院就診的114例老年T2DM患者為研究對(duì)象(研究組)。其中女性44例,男性70例;年齡65～78(68.5±3.2)歲;T2DM病程8～21(10.3±4.5)年。另選取同期健康體檢者100名作為對(duì)照組。其中女性35例,男性65例;年齡64～76(66.8±4.2)歲。納入標(biāo)準(zhǔn):符合《中國(guó)2型糖尿病防治指南(2019年版)》的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)可能引起腦功能障礙的神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者,如腦卒中、帕金森病、腦腫瘤等;(2)長(zhǎng)期服用鎮(zhèn)靜、抗抑郁藥物,以及可能干擾中樞神經(jīng)系統(tǒng)的藥物;(3)長(zhǎng)期酗酒;(4)心、腦、肺等重要器官?lài)?yán)重疾病?；颊呒凹覍倬栽竿鈪⒓硬⒑炇鹬橥鈺?shū)。本研究符合《赫爾辛基宣言》并經(jīng)過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。除血糖指標(biāo)外,2組研究對(duì)象一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05;表1)。

表1 2組研究對(duì)象一般資料比較Table 1 Comparison of baseline data between two groups

1.2 血清源性外泌體的提取和鑒定

(1)血清提取:普通干燥管抽取各實(shí)驗(yàn)對(duì)象10ml靜脈血,室溫下放置30min。然后1600g離心10min。將上清液轉(zhuǎn)移至新EP管中,在4℃下,以2×104g離心10min。將上清液移至新的EP管中,-80℃保存待分析。(2)血清源性外泌體的提取:采用ExoQuick-TC試劑盒(美國(guó)SBI公司)提取血清源性外泌體。-80℃儲(chǔ)存的血清樣本冰上解凍,4℃條件下2×104g離心15min,上清液轉(zhuǎn)移至新EP管中。每400μl上清液加入ExoQuiekTC試劑100μl,顛倒EP管約20次混勻,4℃靜置12h。1500g離心30min,吸出上清液。無(wú)核酸酶的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)反復(fù)均勻吹打重懸離心沉淀物,將重懸液轉(zhuǎn)移至新的1.5ml EP管中。(3)血清源性外泌體的鑒定:采用透射電子顯微鏡觀察提取的血清源性外泌體形態(tài);Western blot 檢測(cè)外泌體標(biāo)志物表達(dá)(檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)NanoView Biosciences)。

1.3 血清源性外泌體中NSE和P-tau的檢測(cè)

采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)研究對(duì)象血清源性外泌體中NSE及P-tau的表達(dá)。其中人NSE檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海澤葉生物科技有限公司;人P-tau檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢菲恩生物科技有限公司。檢測(cè)按照試劑盒說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格進(jìn)行操作。

1.4 簡(jiǎn)易認(rèn)知狀態(tài)評(píng)價(jià)量表

簡(jiǎn)易認(rèn)知狀態(tài)評(píng)價(jià)量表(mini-mental state examination,MMSE)是目前臨床上廣泛使用的成人認(rèn)知狀態(tài)評(píng)估工具。該量表主要對(duì)受測(cè)試者的定向力、記憶力、注意力和計(jì)算力、回憶能力、語(yǔ)言能力5個(gè)方面的能力進(jìn)行測(cè)量,共包括11個(gè)問(wèn)題項(xiàng)目。總分范圍0～30分,分?jǐn)?shù)越高表示患者認(rèn)知功能越良好。認(rèn)知功能損傷評(píng)分參考:正常(27～30分);輕度受損(21～26分);中度受損(10～20分);重度受損(0～9分)。

1.5 蒙特利爾認(rèn)知評(píng)估量表

蒙特利爾認(rèn)知評(píng)估量表(Montreal cognitive assessment, MoCA)是一種廣泛使用的認(rèn)知評(píng)估工具。該量表包括交替連線測(cè)驗(yàn)、視結(jié)構(gòu)技能(立方體)、視結(jié)構(gòu)技能(鐘表)、命名、記憶、注意、句子復(fù)述、詞語(yǔ)流暢性、抽象、延遲回憶和定向這11個(gè)維度項(xiàng)目。評(píng)估以下7個(gè)領(lǐng)域的認(rèn)知功能:視覺(jué)空間/執(zhí)行、命名、注意力、語(yǔ)言、抽象、記憶延遲和定向。該量表測(cè)試的最高分?jǐn)?shù)為30分,分?jǐn)?shù)越高,認(rèn)知能力越好。以26分為界值,<26分為伴有MCI,≥26分則認(rèn)知功能正常。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 血清源性外泌體的分離與鑒定

透射電鏡下觀察,從血清中分離的外泌體呈類(lèi)圓形囊泡狀,直徑大小為50～120nm。Western blot分析結(jié)果顯示其表達(dá)外泌體特異性標(biāo)志物CD9和CD63,表明從研究對(duì)象血清中成功分離出外泌體(圖1)。

圖1 血清源性外泌體的鏡下形態(tài)Figure 1 Microscopic morphology of serum-derived exosomesA: exosomes under transmission electron microscopye; B: electrophoresis result. CD: cluster of differentiation; GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.

2.2 2組研究對(duì)象MCI發(fā)生情況

MMSE量表結(jié)果顯示,研究組患者出現(xiàn)認(rèn)知功能受損的比例高于對(duì)照組;MMSE分值明顯低于對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。MoCA量表結(jié)果顯示,研究組MoCA分值明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。研究組患者中71例發(fā)生MCI,對(duì)照組中45例發(fā)生MCI,研究組出現(xiàn)MCI的比例高于對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

表2 2組研究對(duì)象認(rèn)知評(píng)估結(jié)果比較Table 2 Comparison of cognitive assessment results between two groups

2.3 血清外泌體中NSE和P-tau的表達(dá)

根據(jù)MoCA分?jǐn)?shù)將研究組114例患者分為MCI組(n=71)和非MCI組(n=43),MCI組血清外泌體中NSE和P-tau表達(dá)水平分別為(13.27±1.61)μg/L和(17.14±2.45)pg/ml,明顯高于非MCI組的(10.86±1.43)μg/L和(14.49±2.25)pg/ml(t=5.728,6.154;P<0.05)。

2.4 血清外泌體中NSE和P-tau表達(dá)水平與認(rèn)知受損嚴(yán)重程度的相關(guān)性

相關(guān)分析顯示,研究組114例老年T2DM患者血清外泌體中NSE表達(dá)水平與MMSE分值和MoCA分值存在負(fù)相關(guān)(r=-0.547,-0.562;P<0.05);血清外泌體中P-tau表達(dá)水平與MoCA分值存在負(fù)相關(guān)(r=-0.583,-0.597;P<0.05;圖2)。

圖2 NSE和P-tau表達(dá)水平與MMSE分值和MoCA分值的相關(guān)性分析Figure 2 Analysis of correlation of NSE and P-tau expression with MMSE score and MoCA score NSE: neuron-specific enolase; P-tau: phosphorylated tau; MMSE: mini-mental state examination; MoCA: Montreal cognitive assessment.

2.5 血清外泌體中NSE及P-tau對(duì)老年T2DM患者發(fā)生MCI的預(yù)測(cè)價(jià)值

血清外泌體中NSE表達(dá)預(yù)測(cè)老年T2DM患者發(fā)生MCI的曲線下面積(area under the curve,AUC)為0.729,血清外泌體中P-tau表達(dá)預(yù)測(cè)老年T2DM患者發(fā)生MCI的AUC為0.741,而兩者聯(lián)合預(yù)測(cè)老年T2DM患者發(fā)生MCI的AUC為0.827,高于NSE和P-tau單個(gè)指標(biāo)對(duì)老年T2DM患者發(fā)生MCI的預(yù)測(cè)價(jià)值(t=3.836,3.478;P<0.05;圖3)。

圖3 NSE及P-tau表達(dá)預(yù)測(cè)MCI的ROC曲線Figure 3 ROC curve of NSE and P-tau expression for predicting MCIA: NSE expression; B: P-tau expression; C: combination of NSE and P-tau expression. NSE: neuron-specific enolase; P-tau: phosphorylated tau; ROC: receiver operating characteristic; MCI: mild cognitive impairment.

3 討 論

T2DM是一種復(fù)雜的代謝性疾病,可能對(duì)身體各器官產(chǎn)生重大影響。T2DM患者的MCI發(fā)病率明顯高于非T2DM患者。You等[6]薈萃分析結(jié)果顯示,T2DM患者中MCI的合并患病率約為45.0%。T2DM導(dǎo)致MCI的具體機(jī)制尚不明確,目前已知可能與T2DM相關(guān)的血管風(fēng)險(xiǎn)因素(包括高血壓、血脂異常和肥胖等)有關(guān)[7,8]。較長(zhǎng)的T2DM持續(xù)時(shí)間可能導(dǎo)致嚴(yán)重的腦大血管疾病及可能損害認(rèn)知功能的臨床和亞臨床腦梗死[9]。此外,胰島素信號(hào)受損也是導(dǎo)致MCI的重要機(jī)制[10]。還有研究報(bào)道T2DM可能加重特定灰質(zhì)區(qū)域的萎縮,表明T2DM在認(rèn)知損害過(guò)程中可能發(fā)揮更關(guān)鍵的作用[11]。本研究結(jié)果顯示,研究組老年T2DM患者出現(xiàn)認(rèn)知受損的比例高于對(duì)照組,且MMSE和MoCA分值也明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。根據(jù)MoCA量表的MCI標(biāo)準(zhǔn),本研究中老年T2DM患者出現(xiàn)MCI的比例高于未患T2DM的對(duì)照組(P<0.05)。這一結(jié)果與既往研究T2DM被認(rèn)為是MCI的風(fēng)險(xiǎn)因素一致。

外泌體是細(xì)胞間通信的重要媒介。有研究報(bào)道,外泌體是與神經(jīng)退行性疾病相關(guān)的錯(cuò)誤折疊蛋白細(xì)胞間傳遞的潛在載體,其包含的分子也是神經(jīng)退行性疾病的潛在診斷生物標(biāo)志物[12,13]。既往有研究報(bào)道[14],在血液中發(fā)現(xiàn)的外泌體中包含了反映疾病特異性腦區(qū)域內(nèi)病理變化的蛋白質(zhì)表達(dá)譜,表明分析循環(huán)外泌體蛋白表達(dá)可能是監(jiān)測(cè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)病機(jī)制的新策略。本研究我們選擇分離血清外泌體作為載體來(lái)研究其包含的神經(jīng)退行性疾病相關(guān)蛋白表達(dá)。本研究中,我們使用ExoQuick-TC法提取血清外泌體,最終獲得的囊泡狀顆粒與之前研究報(bào)道的外泌體形態(tài)和大小一致,且Western印跡分析其富集外泌體特異性標(biāo)志物CD9和CD63的表達(dá),進(jìn)一步確認(rèn)了這些顆粒作為外泌體的特性[15]。

糖尿病引起的腦微血管損傷可能增加神經(jīng)元對(duì)缺血和缺氧的敏感性,最終導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡,這是糖尿病促進(jìn)認(rèn)知功能障礙的主要病理機(jī)制之一[16]。NSE存在于神經(jīng)元和其他神經(jīng)外胚層來(lái)源的細(xì)胞中。當(dāng)神經(jīng)細(xì)胞受損時(shí),NSE可以從細(xì)胞中大量釋放并進(jìn)入血液循環(huán),導(dǎo)致血液中NSE水平異常升高。因此,血清NSE可間接反映神經(jīng)系統(tǒng)損傷程度,其水平過(guò)高與老年人認(rèn)知功能下降密切相關(guān)[17]。Tau是一種微管相關(guān)蛋白,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(尤其是在遠(yuǎn)端軸突)中表達(dá)豐富。如果Tau蛋白過(guò)度磷酸化,會(huì)導(dǎo)致軸突形態(tài)和動(dòng)態(tài)運(yùn)輸功能的不穩(wěn)定和破壞[18]。過(guò)度磷酸化的Tau蛋白聚集纏結(jié)直接導(dǎo)致神經(jīng)退行性變和相關(guān)的認(rèn)知惡化[19]。因此,P-tau也被認(rèn)為是認(rèn)知功能障礙相關(guān)的生物學(xué)標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示,MCI組血清外泌體中NSE和P-tau表達(dá)水平明顯高于非MCI組。相關(guān)分析顯示,老年T2DM患者血清外泌體中NSE和P-tau表達(dá)水平與MMSE分值和MoCA分值存在負(fù)相關(guān)。以上研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),血清外泌體中NSE和P-tau與老年T2DM患者出現(xiàn)認(rèn)知障礙有關(guān),即患者血清外泌體中NSE和P-tau表達(dá)濃度水平越高,其出現(xiàn)MCI的可能性也越大。此外,我們采用AUC這個(gè)整體性的衡量指標(biāo)來(lái)研究血清外泌體中NSE和P-tau表達(dá)水平預(yù)測(cè)老年T2DM患者發(fā)生MCI的準(zhǔn)確性。結(jié)果顯示,血清外泌體中NSE和P-tau對(duì)于預(yù)測(cè)老年T2DM患者發(fā)生MCI的AUC具有較高的準(zhǔn)確性,而聯(lián)合二者檢測(cè)會(huì)進(jìn)一步提高其預(yù)測(cè)MCI發(fā)生的準(zhǔn)確性。

總之,老年T2DM患者血清中外泌體富含神經(jīng)元損傷和認(rèn)知功能障礙相關(guān)標(biāo)志物NSE和P-tau,且其表達(dá)水平較非T2DM患者顯著升高。相關(guān)分析表明老年T2DM患者血清中外泌體中高水平表達(dá)的NSE和P-tau與MCI有關(guān)。通過(guò)監(jiān)測(cè)患者血清外泌體中NSE和P-tau表達(dá)水平的改變將有助于預(yù)測(cè)老年T2DM患者發(fā)生MCI,這將有助于醫(yī)師在臨床上制定措施來(lái)進(jìn)行針對(duì)性的干預(yù)。