［摘要］目的探究冰白含漱液（BBH）在治療口腔炎癥方面的作用機(jī)制。方法使用TCMSP、PubChem、SwissTargetPrediction、GeneCard、Drugbank和OMIM等數(shù)據(jù)庫獲得BBH中主要活性成分與口腔炎癥相關(guān)的潛在靶點(diǎn)，篩選交集靶點(diǎn)構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)、中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)行基因本體論和京都基因與基因組百科全書富集分析。取核心靶點(diǎn)與其對(duì)應(yīng)化合物分子對(duì)接。采用ELISA法檢測(cè)BBH對(duì)炎癥因子腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素6（IL-6）的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)BBH有效成分和口腔炎癥交集靶點(diǎn)99個(gè)。與其對(duì)應(yīng)化合物分子對(duì)接結(jié)合能最小的化合物分別是槲皮素、吳茱萸次堿、β-谷甾醇、小檗堿、黃連堿、珊瑚菜素、白屈菜赤堿、右旋龍腦。BBH各濃度IL-6水平均有顯著影響，1.500μg/mL、3.125μg/mL濃度組可降低TNF-α水平。結(jié)論BBH通過多靶點(diǎn)和多通路降低口腔炎癥的多種指標(biāo)。

［關(guān)鍵詞］冰白含漱液；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；分子對(duì)接模型；巨噬細(xì)胞；白細(xì)胞介素6；腫瘤壞死因子α

doi：10.3969/j.issn.1674-7593.2023.06.018

ExploringtheAnti-inflammatoryMechanismofBingbaiGargleBasedonNetworkPharmacologyandMolecularDockingModelConstruction

GaoYing1，HouLihui2，WangLe2，ZhangYu2，YangTao3**

1Ninety-sixty-fourthHospitaloftheChinesePeopleLiberationArmy，Changchun130021;2ChangchunUniversityofTraditionalChineseMedicine，Changchun130117;3ChinesePeopleLiberationArmyUnit93313，Changchun130062

**Correspondingauthor：YangTao，email：1595765865@qq.com

［Abstract］ObjectiveToinvestigatethemechanismofBingbaigargle（BBH）inthetreatmentoforalinflammation.MethodsThepotentialtargetsrelatedtooralinflammationofthemainactivecomponentsinBBHwereobtainedbyTCMSP，PubChem，SwissTargetPrediction，GeneCard，DrugbankandOMIMdatabases.Theintersectiontargetswerescreenedtoconstructprotein-proteininteractionnetwork，herb-component-target-diseasenetwork，andgeneontologyandKyotoEncyclopediaofGenesandGenomesenrichmentanalysiswereperformed.Takethecoretargettodockwithitscorrespondingcompoundmolecule.TheeffectsofBBHontumornecrosisfactor-α（TNF-α）andinterleukin-6（IL-6）weredetectedbyELISA.ResultsAtotalof99intersectiontargetsofBBHactiveingredientsandoralinflammationwerefound.Thecompoundswiththesmallestdockingbindingenergywiththeircorrespondingcompoundswerequercetin，evodiamine，β-sitosterol，berberine，coptisine，corallicin，chelerythrine，anddextrorotatoryborneol.IL-6levelsweresignificantlyaffectedatallconcentrationsofBBH，andTNF-αlevelsweredecreasedinthe1.500μg/mLand3.125μg/mLconcentrationgroups.ConclusionBBHcandecreasevariousindexesoforalinflammationthroughmultipletargetsandmultiplepathways.

［Keywords］Bingbaigargle;Networkpharmacology;Moleculardockingmodel;Macrophages;Interleukin-6;Tumornecrosisfactor-α

口腔健康不僅影響個(gè)人的情感、社交，還會(huì)影響精神和整體身體健康?？谇谎装Y在老年群體中發(fā)病率較高，與心血管疾病和糖尿病等非傳染性疾病有關(guān)?？谇唤】禒顩r不佳對(duì)生活質(zhì)量有巨大的負(fù)面影響［1］。冰白含漱液（Bingbaigargle，BBH）由黃柏、白及、冰片3味中藥組成，有清熱解毒、防腐生肌作用。本課題主要探討B(tài)BH的清熱解毒、抗炎的機(jī)制。

1材料與方法

1.1研究材料

BBH（院內(nèi)自制），脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）（普諾賽生命科技有限公司，批號(hào)3230506003），胎牛血清（內(nèi)蒙古奧普賽生物科技有限公司，批號(hào)20230106），胰蛋白酶（Servicebio，批號(hào)25200-056），DMEM培養(yǎng)基（Cytiva，批號(hào)AJ30735879），噻唑藍(lán)（Methylthiazolyldiphenyl-tetrazoliumbromide，MTT）（普諾賽生命科技有限公司，批號(hào)296-93-1）。

RAW264.7巨噬細(xì)胞，在37℃恒溫箱5%CO2下采用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，每隔2d更換培養(yǎng)液1次，細(xì)胞融合度達(dá)80%時(shí)使用。

1.2方法

1.2.1網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究①BBH活性成分、口腔炎癥靶點(diǎn)篩選：以TCMSP數(shù)據(jù)庫（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）為主，在BBH配方中初步檢索3味藥物的全部活性成分，并借助Uniprot數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）對(duì)所有靶點(diǎn)名稱標(biāo)準(zhǔn)化，進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)篩選BBH的有效成分。同時(shí)通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)，構(gòu)建處方活性組分資料庫，補(bǔ)充活性組分［2-6］。利用PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫下載化合物的2D結(jié)構(gòu)，導(dǎo)入到SwissTargetPrediction（https：//www.swisstargetprediction.ch/）數(shù)據(jù)庫，獲取有效成分相關(guān)靶點(diǎn)。以“Stomatitis”為關(guān)鍵詞在GeneCards（https：//www.genecards.org/）、Drugbank（https：//go.drugbank.com）和OMIM（https：//www.omim.org／）數(shù)據(jù)庫中檢索相關(guān)疾病靶點(diǎn)，之后進(jìn)行數(shù)據(jù)合并和去除，從而構(gòu)建口腔炎癥疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫。然后用venny2.1取處方中的有效成分與疾病的靶點(diǎn)相交，得到有效成分與疾病的相交靶點(diǎn)。②蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（Protein-proteininteraction，PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建：為獲取黃柏、白及、冰片中的潛在作用靶點(diǎn)，將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入到String（https：//string-db.org/）數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)模型。將生物物種設(shè)定為“Homospaiens”，將置信度設(shè)置為最高置信度“highestconfidence（0.9）”，其余設(shè)置均為默認(rèn)，由此獲取PPI關(guān)鍵靶點(diǎn)。③有效活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建：使用Cytoscape3.8.2軟件創(chuàng)建一個(gè)包含有效組分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖和網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析，對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行篩選。④基因本體（Geneontology，GO）功能及京都基因與基因組百科全書（Kyotoencyclopediaofgenesandgenomes，KEGG）通路富集分析：將處方發(fā)揮作用的核心作用靶點(diǎn)錄入Metascape數(shù)據(jù)庫（http：//metascape.org/）進(jìn)行分析，物種設(shè)置“Homosapiens”，設(shè)置閾值“P＜0.01”，進(jìn)行GO功能和KEGG途徑的富集分析，分析其主要生物學(xué)過程和相關(guān)途徑。

1.2.2分子對(duì)接模型的構(gòu)建根據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)，選取度值前5的靶點(diǎn)與其對(duì)應(yīng)化合物進(jìn)行分子對(duì)接，通過RCSBPDBPRO數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org/）獲得靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。采用Pymol軟件去除水分子與配體后，使用Autodock1.5.6進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)合能最低的結(jié)果導(dǎo)入Pymol軟件作圖。

1.2.3BBH對(duì)炎癥因子的影響①M(fèi)TT檢測(cè)BBH對(duì)RAW264.7細(xì)胞存活率的影響：精確稱取適量處方分別配制成濃度為0.750、1.500、3.125、6.250和12.500、25.000μg/mL的液體。設(shè)置無藥物干預(yù)的對(duì)照組和不同濃度藥液干預(yù)的實(shí)驗(yàn)組，各組均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞以7×104個(gè)/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)24h，每孔加入10μLMTT試劑，孵育4h，加入150μL二甲基亞砜（Dimethylsulfoxide，DMSO），于490nm處使用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度（OD）值，計(jì)算細(xì)胞存活率，以此篩選最適藥物濃度。②LPS體外誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥模型的建立：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞從皿壁上吹打下來，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，每孔加入100μL，使接種細(xì)胞密度為7×104個(gè)/孔，貼壁培養(yǎng)24h，棄去培養(yǎng)基，設(shè)空白對(duì)照組和LPS處理組（終濃度單位為μg/mL），每孔加入100μL，培養(yǎng)箱中孵育24h后，每孔加10μLMTT，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中孵育4h，取出培養(yǎng)板棄去上清，每孔加入150μLDMSO，酶標(biāo)儀490nm波長(zhǎng)測(cè)定OD值。計(jì)算其IC50值建立炎癥模型。③ELISA法測(cè)定細(xì)胞炎癥因子：將ELISA試劑于室溫平衡20min，室溫下3000r/min離心10min，取不同組別的上清液孵育后加酶標(biāo)抗體，最終以底物顯色。終止顯色反應(yīng)后，立即檢測(cè)OD450nm值。依據(jù)梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，分別繪制腫瘤壞死因子α（Tumornecrosisfactor-α，TNF-α）和白細(xì)胞介素6（Interleukin-6，IL-6）的標(biāo)準(zhǔn)曲線。據(jù)此算出各組細(xì)胞上清中TNF-α及IL-6的濃度。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPadPrism6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和作圖。正態(tài)分布的兩組計(jì)量資料采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，3組及以上正態(tài)分布的計(jì)量資料采用單因素方差分析，Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果

2.1.1成分靶點(diǎn)、疾病靶點(diǎn)以及交集靶點(diǎn)的篩選將TCMSP數(shù)據(jù)庫得到的活性成分靶點(diǎn)合并去重后，共獲得218個(gè)活性成分靶點(diǎn)，根據(jù)GeneCard等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行數(shù)據(jù)合并和去重后，共獲得2963個(gè)靶點(diǎn)；將篩選出的成分靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)輸入Venny2.1，取交集，將得到的99個(gè)交集靶點(diǎn)，作為藥物作用于疾病的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。

2.1.2活性成分和疾病靶點(diǎn)篩選在Cytoscape3.8.2軟件中導(dǎo)入處方和疾病靶點(diǎn)，構(gòu)建成分-交叉靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)，見圖1。之后進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，將節(jié)點(diǎn)的重要程度反映在度的網(wǎng)絡(luò)上，度值越大，表明這個(gè)網(wǎng)絡(luò)的重要性越高。

2.1.3PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建在String數(shù)據(jù)庫中導(dǎo)入得到的153個(gè)藥物和疾病交叉靶點(diǎn)，設(shè)置互動(dòng)得分最高為0.9，去除沒有參與PPI的靶點(diǎn)，得到PPI網(wǎng)絡(luò)。再將導(dǎo)入到Cytoscape3.8.2軟件中的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，見圖2。

根據(jù)中位值對(duì)相關(guān)蛋白靶點(diǎn)進(jìn)行排序，根據(jù)degree值，最終篩選出的關(guān)鍵靶點(diǎn)，見表1。根據(jù)關(guān)鍵靶點(diǎn)得出處方中的活性成分為槲皮素、吳茱萸次堿、β-谷甾醇、小檗堿、黃連堿、珊瑚菜素、白屈菜赤堿、右旋龍腦。

2.1.4GO功能和KEGG通路富集分析在Metascape數(shù)據(jù)庫中導(dǎo)入處方作用交叉靶點(diǎn)，進(jìn)行GO功能富集分析（P＜0.05）。這些成分發(fā)揮作用的生物過程主要涉及細(xì)胞遷移的正向調(diào)節(jié)、對(duì)激素的反應(yīng)、對(duì)異種生物刺激的反應(yīng)、細(xì)胞分化的負(fù)調(diào)控、對(duì)輻射的反應(yīng)等過程；分子功能主要是蛋白質(zhì)同源二聚化活性、蛋白激酶活性、血紅素結(jié)合、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合，見圖3。在細(xì)胞成分層面主要作用在細(xì)胞質(zhì)的核周區(qū)域、質(zhì)膜蛋白復(fù)合物、細(xì)胞器外膜。進(jìn)一步進(jìn)行KEGG通路富集分析，根據(jù)P值的大小和富集基因數(shù)目進(jìn)行篩選，主要涉及癌癥通路、IL-17信號(hào)通路、血脂與動(dòng)脈粥樣硬化、人類巨細(xì)胞病毒感染等過程，見圖4。

2.2分子對(duì)接研究結(jié)果

以活性成分槲皮素、吳茱萸次堿、β-谷甾醇、小檗堿、黃連堿、珊瑚菜素、白屈菜赤堿、右旋龍腦為配體，以核心靶點(diǎn)AKT1、TNF-α、IL-6為受體進(jìn)行分子對(duì)接，明確BBH抗炎潛在活性成分與核心靶蛋白間的結(jié)合能力，結(jié)合能值越小代表該分子與蛋白對(duì)接得越好，且＜-5.0kcal/mol說明藥物成分與靶點(diǎn)具有強(qiáng)結(jié)合活性。核心靶點(diǎn)與BBH的潛在活性成分之間關(guān)聯(lián)性很強(qiáng)，這可能作為BBH治療口腔炎癥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，見表2、圖5。

2.3BBH對(duì)炎癥因子的影響

2.3.1不同濃度的BBH對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞活力的影響與空白對(duì)照組比較，BBH濃度≤3.125μg/mL時(shí)對(duì)細(xì)胞活力無影響（P＞0.05），而≥6.250μg/mL細(xì)胞存活率顯著降低（P＜0.05），即藥物對(duì)RAW264.6巨噬細(xì)胞有顯著的細(xì)胞毒性，見圖6。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)應(yīng)采用0.750～3.125μg/mL的濃度范圍進(jìn)行研究。

2.3.2ELISA法檢測(cè)BBH對(duì)炎癥因子TNF-α、IL-6的影響模型組細(xì)胞上清液中炎性因子IL-6和TNF-α的水平高于空白對(duì)照組（P＜0.001）。與模型組比較，不同濃度給藥組明顯抑制IL-6、TNF-α水平（P＜0.05），結(jié)果表明，BBH具有顯著的抗炎活性，且呈劑量依賴性，見圖7。

3討論

隨著年齡變化，口腔同時(shí)也會(huì)發(fā)生各種增齡性變化。老年人口腔疾病的發(fā)生不僅影響正常的口腔生理功能，同時(shí)與心血管疾病、糖尿病、高血壓等老年多發(fā)性全身系統(tǒng)疾病密切相關(guān)。例如糖尿病是牙周病的促進(jìn)因素，牙周基礎(chǔ)治療有利于糖尿病血糖的控制；牙周疾病可能是冠心病等心血管疾病、類風(fēng)濕等關(guān)節(jié)性疾病的危險(xiǎn)因素。因此，改善老年人群的口腔健康很關(guān)鍵［7］。

BBH由黃柏、白及、冰片3味中藥組成，協(xié)同發(fā)揮療效，對(duì)治療口腔炎癥有非常顯著的作用。本研究構(gòu)建了BBH治療口腔炎癥的“中藥-活性成分-共同靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，得到99個(gè)疾病共同靶點(diǎn)。通過對(duì)BBH治療口腔炎癥的共同靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)的進(jìn)一步篩選，得到AKT1、TNF-α、IL-6、CASP3、PTGS2等核心靶點(diǎn)。TNF-α在許多炎癥中發(fā)揮著廣泛而多層面的作用，在免疫反應(yīng)的發(fā)生中起核心作用。TNF-α主要由巨噬細(xì)胞分泌，但也由其他免疫和非免疫細(xì)胞產(chǎn)生，包括成纖維細(xì)胞、肌肉細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，并參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、代謝和死亡，對(duì)凝血等生物過程也有一定的影響［8］。在腫瘤微環(huán)境中，TNF-α通過促進(jìn)炎癥細(xì)胞的產(chǎn)生和激活，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞進(jìn)一步侵襲?？谇话┗颊咧蠺NF-α水平有顯著升高［9］。IL-6是一種多效細(xì)胞因子，介導(dǎo)重要的生物學(xué)功能，如B細(xì)胞的分化、急性期蛋白的誘導(dǎo)和造血功能的調(diào)節(jié)等［10］。

本研究采用分子對(duì)接技術(shù)驗(yàn)證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)得到的BBH炎癥活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)AKT1、IL-6及TNF-α的結(jié)合能力，發(fā)現(xiàn)活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)之間存在較強(qiáng)的結(jié)合能力，兩者之間主要以氫鍵結(jié)合的方式相互作用，最小結(jié)合可在-5.1～-7.9kcal/mol?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果，本課題采用LPS誘導(dǎo)體外炎癥模型，ELISA結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BBH在6.250μg/mL濃度下，對(duì)炎癥因子TNF-α及IL-6的釋放具有顯著的抑制作用，這項(xiàng)結(jié)果表明網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)得到的活性成分可能是潛在的抗炎活性成分，有可能會(huì)作為治療口腔炎癥的中藥新藥或者是作為藥物前體，具體有待后續(xù)進(jìn)行研究。

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（2023-08-31收稿）