趙秋龍,江群艷,嚴輝,瞿城,郭盛,樊歡,包蓉蓉,何潤天,康宏杰,段金廒

(1.南京中醫(yī)藥大學中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國家地方聯(lián)合工程研究中心/江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心/國家中醫(yī)藥管理局中藥資源循環(huán)利用重點研究室,江蘇 南京 210023;2.寧夏枸杞創(chuàng)新中心,寧夏 銀川 750002)

枸杞子為茄科植物寧夏枸杞LyciumbarbarumL.的干燥成熟果實,始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,氣微,味甜,具有滋補肝腎,益精明目的功效[1]?，F(xiàn)代研究表明,枸杞子主要含多糖、生物堿、類胡蘿卜素、黃酮等化學成分[2],具有抗衰老[3]、抗高血壓[4]、抗腫瘤[5]、降血糖[6]、降血脂[7]及神經(jīng)保護[8]等藥理活性。目前枸杞子主要分布于甘肅、內蒙古、寧夏、新疆和青海等地[9-10],但由于氣候、土壤不同,各地枸杞子的氣味可能存在一定差異。目前,陳棟杰等[11-12]已利用電子舌測定不同產(chǎn)地枸杞子的“味”以描述其性狀特征;雖有通過電子鼻對枸杞子的“氣”進行研究的報道[13-15],但收集的樣品來源單一、樣本量少。本研究基于超快速氣相電子鼻對56批枸杞子樣品進行分析,結合判別因子分析(Discriminant factor analysis,DFA)、卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(Convolutional neural networks,CNN)、主成分分析(Principal component analysis,PCA)及偏最小二乘判別分析(Partial least squares discriminant analysis,PLS-DA)比較五大產(chǎn)區(qū)枸杞子藥材的差異[16-17],為枸杞子藥材的質量控制和綜合利用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器與試藥

Heracles Neo型超快速氣相電子鼻(配備PAL RSI型全自動頂空進樣器、MXT-5非極性毛細管柱、MXT-1701中極性毛細管柱,法國Alpha Mos公司);GA-380N型低噪音空氣泵(北京中興匯利科技發(fā)展有限公司);GH-380N型高純氫氣發(fā)生器(北京中興匯利科技發(fā)展有限公司);Mettler Toledo XS105型電子分析天平(瑞士Mettler公司);電熱鼓風干燥機(上海一恒科學儀器有限公司)。

正構烷烴混合對照品(批號:A0168401,每100 g混合物中含正構烷烴0.02～53.27 g),購自美國Restek公司。

1.2 枸杞子樣本采集

于甘肅、內蒙古、寧夏、青海及新疆采集56批栽培枸杞子樣品(2018、2019年7～8月),經(jīng)南京中醫(yī)藥大學嚴輝教授鑒定為茄科植物寧夏枸杞LyciumbarbarumL.的干燥成熟果實,具體信息見表1。

表1 不同產(chǎn)地枸杞子信息表Table 1 Information of Lycium barbarum L. from distinct origins

2 方法與結果

2.1 供試品制備

取大小形狀均勻的枸杞子,于55 ℃烘箱中通風烘干,去除冷藏保存中產(chǎn)生的冷凝水。取出冷卻至室溫,粉碎過3號篩,密封備用。

2.2 單因素考察[18]

2.2.1 樣品用量 設置孵化溫度70 ℃,孵化時間20 min,進樣量5 000 μL,考察同一樣品(編號S25)的不同用量(1、2、3、4、5 g)對氣味色譜峰峰面積和峰形的影響。結果顯示,隨著樣品用量增加,氣味峰的峰面積也逐漸增加,峰形良好,見圖1。當樣品用量為4 g或5 g時,峰面積增加不明顯,故選擇樣品用量為3 g。

圖1 不同樣品用量、進樣量、孵化溫度及孵化時間對峰面積的影響Fig.1 The influence of distinct sample dosage, injection volumes, incubation temperatures and time on peak area

2.2.2 進樣量 取枸杞子(編號S25)粉末3 g,精密稱定,設置孵化溫度70 ℃,孵化時間20 min?？疾觳煌M樣量(1 000、2 000、3 000、4 000、5 000 μL)對氣味色譜峰峰面積和峰形的影響。結果顯示,隨著進樣量增加,氣味峰的峰面積均逐漸增大,且當進樣量在5 000 μL時,峰形良好,見圖1,故選擇進樣量為5 000 μL。

2.2.3 孵化溫度 取枸杞子(編號S25)粉末3 g,精密稱定,設置孵化時間20 min,進樣量5 000 μL?？疾觳煌趸瘻囟?40、50、60、70、80 ℃)對氣味色譜峰峰面積和峰形的影響。結果顯示,隨著溫度升高,氣味峰的峰面積先增大后減小,當溫度為70 ℃時,峰面積最大,見圖1,故選擇孵化溫度為70 ℃。

2.2.4 孵化時間 取枸杞子(編號S25)粉末3 g,精密稱定,設置孵化時間20 min,孵化溫度70 ℃,進樣量5 000 μL?？疾觳煌趸瘯r間(10、15、20、25、30 min)對氣味色譜峰峰面積和峰形的影響。結果顯示,孵化20 min后氣味峰峰面積無明顯增大,趨于飽和穩(wěn)定,見圖1,故選擇孵化時間為20 min。

2.3 檢測條件

色譜柱為低極性MXT-5(交聯(lián)5%聯(lián)苯/95%二甲基聚硅氧烷)、中極性MXT-1701(交聯(lián)14%氰丙基苯/86%二甲基聚硅氧烷)金屬毛細管柱,規(guī)格均為10 m×0.18 mm×0.4 μm;樣品瓶規(guī)格為20 mL;樣品用量為3 g,進樣量為5 000 μL,孵化溫度為70 ℃,孵化時間為20 min;進樣速度為125 μL·s-1;進樣持續(xù)時間為45 s;進樣口溫度為200 ℃,捕集阱補集溫度為50 ℃;捕集阱分流速度為10 mL·min-1;捕集持續(xù)時間為50 s;捕集阱最終補集溫度為250 ℃;色譜柱初始溫度為50 ℃,程序升溫(以0.5 ℃·s-1升至80 ℃,以1 ℃·s-1升至100 ℃,以3 ℃·s-1升至250 ℃,保持20 s);采集時間為150 s;火焰離子化檢測器(FID)增益為12[19]。

2.4 樣品的進樣分析

樣品在超快速氣相電子鼻Heracles上進行測定分析,每份樣品平行測定2次,準確吸取3 g枸杞子樣品于20 mL的電子鼻專用頂空瓶中,使用PTFE隔墊密封,將準備好的樣品置于自動進樣器裝置上,采用頂空進樣進行分析。

2.5 方法學考察

取枸杞子(編號S25)粉末約3 g,共6份,精密稱定,按“2.3”項下檢測條件進行分析,記錄峰面積,考察精密度和重復性;取枸杞子(編號S25)粉末約3 g,共6份,精密稱定,分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h后按“2.3”項下檢測條件進行分析,記錄峰面積,考察樣品的穩(wěn)定性。結果顯示,樣品氣味峰峰面積的相對標準偏差(RSD)在2.19%～6.27%之間,保留時間的RSD值在0.03%～0.13%之間,表明該方法精密度高,重復性好,室溫下放置24 h內穩(wěn)定性良好。

2.6 不同產(chǎn)地枸杞子氣味指紋圖譜研究

2.6.1 指紋圖譜的建立和分析[20]按照“2.3”項下的檢測條件,通過超快速氣相色譜電子鼻對56批枸杞子進行檢測。以MXT-5色譜柱扣除空白后采集的信號為主,將所得圖譜信息導入OriginPro 2021軟件,獲得枸杞子的氣味指紋圖譜,見圖2;各產(chǎn)地特征指紋圖譜的比較,見圖3;13個特征峰相對峰面積熱圖,見圖4;不同產(chǎn)地氣味色譜平均峰面積,見表2。結果表明,枸杞子氣味指紋圖譜中共檢出13個共有峰,不同產(chǎn)地枸杞子氣味峰的數(shù)量沒有差異,而峰面積明顯不同。此外,60 s前所出的氣味峰較密集、峰面積大;60 s后所出的氣味峰較少、峰面積小。

圖2 56批枸杞子樣品的氣味指紋圖譜(S1～S56)Fig.2 Odor chromatogram fingerprints of 56 batches of Lycium barbarum L. (S1-S56)

注:P1～P13.色譜峰1～13;GS1～GS14.甘肅1～14;NM1～NM10.內蒙古1～10;NX1～NX15.寧夏1～15;XJ1～XJ8.新疆1～8;QH1～QH9.青海1～9圖4 不同產(chǎn)地枸杞子氣味峰相對峰面積熱圖分析Fig.4 Heatmap analysis of odor chromatogram relative peak area of distinct origin-derived Lycium barbarum L.

表2 不同產(chǎn)地枸杞子13個特征氣味峰的平均峰面積Table 2 The average area of 13 characteristic odor chromatogram peaks from distinct origin-derived Lycium barbarum L.

2.6.2 枸杞子氣味定性分析研究 為明確不同產(chǎn)地枸杞子氣味特征成分組成,對比正構烷烴nC6～nC16混合對照品的保留時間,將“2.5.1”項下所得枸杞子氣味指紋圖譜中13個共有峰保留時間(tR)轉換為Kovats保留指數(shù)(RI),并與AroChemBase數(shù)據(jù)庫比對[21-22]鑒定出13個可能的共有化合物,具體見表3及圖5。結果顯示,峰面積最大的2號峰可能為丙烯醛,峰面積最小的9號峰可能為糠醛。圖5氣味輪顯示,13個化合物主要分為6個主觀感知類別,被感知為“辛辣的”的化合物個數(shù)最多。

圖5 不同產(chǎn)地枸杞子氣味特征成分(中圈)、主觀感知類別(內圈)及相關氣味描述(外圈)的氣味輪Fig.5 Flavor wheel of 13 main odor characteristiccomponents(middle circle), subjective perception category(inner circle)and related odor description(outer circle)in distinct origin-derived Lycium barbarum L.

2.6.3 不同產(chǎn)地枸杞子的快速鑒別分析

2.6.3.1 DFA判別模型的建立 為分析不同產(chǎn)地枸杞子的氣味差異,實現(xiàn)對其快速鑒別,本實驗使用Alpha Soft 17.0軟件對不同產(chǎn)地枸杞子的氣味色譜圖進行DFA[23],具體見圖6。結果顯示,DFA二維模型中,橫縱坐標兩判別因子的累積區(qū)分指數(shù)為81.903%(DF1:66.338%;DF2:15.565%);DFA三維模型中,三判別因子的累積區(qū)分指數(shù)為94.198%(DF1:66.338%;DF2:15.565%;DF3:12.295%),表明該判別模型能充分代表所有樣品的氣味信息。

注:GS.甘肅;NM.內蒙古;NX.寧夏;XJ.新疆;QH.青海圖6 不同產(chǎn)地枸杞子的超快速氣相電子鼻信號DFA分析Fig.6 The DFA analysis of distinct origin-derived Lycium barbarum L. based on ultra-fast gas phase electronic nose

甘肅產(chǎn)枸杞子與其他四產(chǎn)區(qū)藥材在DF1上有明顯差異,寧夏產(chǎn)枸杞子與內蒙古產(chǎn)枸杞子在DF2上有明顯差異,青海產(chǎn)枸杞子與新疆產(chǎn)枸杞子在DF1與DF2上均有差異。從二維和三維模型上,56批枸杞子樣品均能得到分離,所有樣品按產(chǎn)區(qū)分為5類,說明超快速氣相電子鼻可快速鑒別不同產(chǎn)地枸杞子。

2.6.3.2 CNN判別模型的建立 利用枸杞子13個氣味峰數(shù)據(jù)構建CNN模型[24],隨機分為訓練集和測試集,訓練集共有45(×2)批樣品,測試集共10(×2)批樣品。將13個氣味峰峰面積數(shù)據(jù)作為輸入層。卷積層中,一維卷積層為尺寸2×1,數(shù)目32,二維卷積層尺寸2×32,數(shù)目64。輸出卷積層結果時,通過ELU激活函數(shù)對卷積結果進行非線性映射。池化層選擇平均池化法,池化窗口為2×2。訓練模型時,采用交叉熵函數(shù)來反應誤差。最終,獲得基于超快速氣相電子鼻的CNN判別模型,模型訓練的學習率為初始值0.000 1,以1/e為衰減指數(shù),隨訓練次數(shù)增加逐步衰減。模型的訓練集平均準確率為100%,測試集平均準確率為80.5%,其中前兩輪測試集準確率高達95.2%,說明該模型對不同產(chǎn)地的枸杞子可進行產(chǎn)地判別,具體見表4。

表4 不同產(chǎn)地枸杞子的超快速氣相電子鼻信號CNN分析Table 4 The CNN analysis of distinct origin-derived Lycium barbarum L. based on ultra-fast gas phase electronic nose

2.6.4 不同產(chǎn)地枸杞子的主要氣味差異物質分析

2.6.4.1 不同產(chǎn)地枸杞子的主要氣味成分差異初步分析 為分析不同產(chǎn)地枸杞子的氣味差異成分,先利用SPSS軟件對枸杞子13個氣味峰的峰面積進行正態(tài)性檢驗,將符合正態(tài)分布的氣味峰進行單因素方差分析,不符合正態(tài)分布的氣味峰進行非參數(shù)檢驗(K-W檢驗),具體見圖7。結果顯示,五大產(chǎn)區(qū)枸杞子主要在8(己醛)、9(糠醛)、10(二甘醇單乙醚)、11(硝基苯)及12(正庚基丙烯酸酯)號氣味峰上有明顯差異。

注:GS.甘肅;NM.內蒙古;NX.寧夏;XJ.新疆;QH.青海;各組間比較,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.000 1。圖7 不同產(chǎn)地枸杞子13個氣味峰峰面積的比較Fig.7 The odor chromatogram peak area comparison of distinct origin-derived Lycium barbarum L.

2.6.4.2 PCA結果 為進一步鑒別不同產(chǎn)地枸杞子的氣味差異成分,將“2.5.4.1”項下所得5個差異成分己醛(8)、糠醛(9)、二甘醇單乙醚(10)、硝基苯(11)及正庚基丙烯酸酯(12)的峰面積作為變量,利用SIMCA 14.1軟件進行PCA[25],具體見圖8。結果顯示,由PCA得分圖所得2個主成分的累計貢獻率為97.30%(PC1 85.9%,PC2 11.4%),模型預測Q2值為0.616(>0.5),說明該模型能較好地反映樣品中的氣味信息[26]。5個不同產(chǎn)地枸杞子樣本在PCA圖上能區(qū)分開,有明顯差異。

圖8 不同產(chǎn)地枸杞子氣味成分的PCA分析Fig.8 The PCA analysis of odor components from distinct origin-derived Lycium barbarum L.

載荷圖上,己醛、糠醛、二甘醇單乙醚、硝基苯及正庚基丙烯酸酯這5個成分距原點均較遠,表明5個成分對區(qū)分不同產(chǎn)地枸杞子貢獻較大[27]。

2.6.4.3 PLS-DA結果 PCA是一種無監(jiān)督的分析方法,在確定差異成分時,無法忽略組內差異與隨機誤差。為進一步探究不同產(chǎn)地枸杞子的氣味差異物質,采用有監(jiān)督的PLS-DA[28],具體見圖9。結果顯示,56批枸杞子被分為5類,不同產(chǎn)地的枸杞子之間有差異,與PCA分析結果互相驗證。

注:GS.甘肅;NM.內蒙古;NX.寧夏;XJ.新疆;QH.青海

此外,在變量重要性排序(Variable importance in projection,VIP)圖上,己醛(VIP=1.317)、糠醛(VIP=1.020)的VIP值均>1[29],表明己醛與糠醛是5個產(chǎn)地枸杞子的氣味差異物質。由表2可知,枸杞子中,按己醛含量大小的產(chǎn)地排序為:內蒙古>甘肅>寧夏>新疆>青海,內蒙古產(chǎn)枸杞子中的己醛含量是青海產(chǎn)枸杞子中己醛的1.63～3.54倍,是新疆產(chǎn)枸杞子中己醛的1.47～2.49倍;按糠醛含量大小的產(chǎn)地排序為:甘肅>新疆>寧夏>青海>內蒙古,甘肅產(chǎn)枸杞中的己醛含量是內蒙古產(chǎn)枸杞子中己醛的1.17～2.37倍,是青海產(chǎn)枸杞子中己醛的1.15～2.01倍。

3 討論

本研究采用Heracles超快速氣相電子鼻技術從不同產(chǎn)地枸杞子中鑒定出氯乙烷、丙烯醛、叔丁醇等13種共有化合物,通過繪制“氣味輪”發(fā)現(xiàn),除正庚基丙烯酸酯外的12個化合物,是對枸杞子氣味起到關鍵作用的化合物。由VIP值圖可知,己醛(VIP=1.3)和糠醛(VIP=1.03)是不同產(chǎn)地枸杞子的主要差異化合物,可作為區(qū)分枸杞子產(chǎn)地的潛在差異氣味分子指標。枸杞子中己醛含量高低的產(chǎn)地排序為:內蒙古>甘肅>寧夏>新疆>青海;糠醛含量高低的產(chǎn)地排序為:甘肅>新疆>寧夏>青海>內蒙古。建立DFA、CNN判別模型及PCA和OPLS-DA化學計量模型,DFA模型的判別因子累積區(qū)分指數(shù)為81.903%,CNN的測試平均準確率為80.5%,PCA模型的累計貢獻率為97.30%,OPLS-DA模型的累計貢獻率為97.20%,說明以上模型均能區(qū)分不同產(chǎn)地枸杞子氣味,能夠對枸杞子樣品氣味進行快速鑒別分析。因此,本研究通過Heracles超快速氣相電子鼻技術[30],不僅確定枸杞子氣味貢獻程度較大的揮發(fā)性氣味化合物,還可以實現(xiàn)不同產(chǎn)地枸杞子快速鑒別,為其質量控制和產(chǎn)地溯源提供了科學依據(jù)[31-33]。