潘艷　趙小芳　成秀梅

【摘要】? 目的? ? 采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究赤芍治療肺動脈高壓的潛在作用靶點及信號通路。方法? ? 檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫得到赤芍的有效成分及作用靶點，肺動脈高壓相關(guān)疾病靶點主要通過檢索TTD、GeneCards和OMIM等數(shù)據(jù)庫獲得。通過繪制韋恩圖獲取赤芍和肺動脈高壓的交集靶點，交集靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）利用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建。利用DAVID數(shù)據(jù)庫在線工具對赤芍和肺動脈高壓的交集靶點進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析。結(jié)果? ? 獲得赤芍有效活性成分共29個，包括鞣花酸、芍藥苷、黃芩素和黃芩苷等，通過PPI圖得到IL-6、AKT1、TNF、TP53、VEGFA等關(guān)鍵蛋白。富集分析顯示，參與的通路主要集中在HIF-1信號通路、Toll-受體信號通路、NF-kB 信號通路、和TNF信號通路等。結(jié)論? ? 赤芍治療肺動脈高壓可能通過調(diào)節(jié)IL-6、AKT1、TNF、VEGFA和MMP9等關(guān)鍵蛋白，干預(yù)HIF-1信號通路、Toll-受體信號通路、NF-kB 信號通路和TNF 信號通路等來發(fā)揮作用，確切機制仍需要進(jìn)一步的實驗驗證。

【關(guān)鍵詞】? 赤芍； 肺動脈高壓； 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)； 成分-靶標(biāo)-通路

Prediction of active ingredient and mechanism of radix paeoniae rubra in treatment of pulmonary hypertension based on network pharmacology

Pan Yan，Zhao Xiaofang，Cheng Xiumei. The Jiangsu Vocational College of Medicine，Yancheng，Jiangsu? ?224005

【Abstract】? Objective? ? To explore the potential targets and signal pathway of Radix Paeoniae Rubra in treating pulmonary hypertension with network pharmacology.Methods? ? Tcmsp was used to retrieve the active ingredients of Radix Paeoniae Rubra and their potential targets.The related targets of PH were collected by TTD，GeneCards，and OMIM）The intersection targets of Radix Paeoniae Rubra and pulmonary hypertension were determined by the Wayne diagram.The protein-protein interaction（PPT）network of the intersection targets was constructed by using the STRING database.The enrichment analysis of GO function and KEGG pathway was analyzed by the DAVID database.Results? ? A total of 29 active ingredients were obtained.The PPI network showed some core targets including IL-6，AKT1，TNF，TP53，VEGFA，etc.The enrichment analysis indicated that the differentially expressed genes were mainly enriched in HIF-1 signaling pathway，Toll-like receptor signaling pathway，NF-kappa B signaling pathway，TNF signaling pathway and so on.Conclusion? ? Radix Paeoniae Rubra was predicted to exert therapeutic effect through multi-component，multi-target and multi-pathway.

【Key Words】? Red peony root； Pulmonary hypertension； Network pharmacology； Ingredient-target-pathway

中圖分類號：R285? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A? ? ? ? 文章編號：1672-1721（2023）19-0001-03

DOI：10.19435/j.1672-1721.2023.19.001

肺動脈高壓（pulmonary hypertension，PH）是各種因素導(dǎo)致肺動脈壓力異常升高的病理狀態(tài)，最終可發(fā)展為右心衰竭、甚至死亡，發(fā)病率和致死率較高[1]。在相當(dāng)長的時間內(nèi)，臨床上無治療肺動脈高壓的特效藥。目前，一些靶向藥物，如內(nèi)皮素受體拮抗劑、5-型磷酸二酯酶抑制劑顯現(xiàn)出一定的治療效果，但對疾病進(jìn)展抑制作用不確切，對死亡率的降低效果不明顯[2]。中藥具有多成分、多靶點協(xié)同作用的特點，在治療肺動脈高壓上擁有豐富的用藥經(jīng)驗[3]。赤芍是茛科植物芍藥（Paeonia lactiflora）或川赤芍（P.veitchii）的干燥根，具有活血化瘀功效[4]。已有研究觀察到，赤芍具有治療肺動脈高壓的作用，但是其抗肺動脈高壓的有效成分及作用機制仍需要進(jìn)一步明確[5]。本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選赤芍的有效成分，探討其治療肺動脈高壓的潛在作用機制。

1? ? 材料與方法

1.1? ? 赤芍有效成分篩選及靶點預(yù)測? ? 赤芍的有效成分通過檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP）獲得，有效成分的靶標(biāo)是根據(jù)“藥物口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，藥物相似度（drug similarity，DL）≥0.18”的條件篩選出來。

1.2? ? PH疾病靶點的收集? ? 以“pulmonary hypertension”為檢索詞，通過檢索TTD、GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫，收集疾病相關(guān)靶點。

1.3? ? 赤芍與PH疾病共同靶點的獲取? ? 利用生信數(shù)據(jù)分析平臺（http：//www.Bioinformatics.com.cn），通過Venn圖獲取赤芍相關(guān)靶點和PH疾病靶點的交集，即兩者的共同靶點。

1.4? ? 蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建? ? 將赤芍和PH疾病交集靶點輸入STRING數(shù)據(jù)庫檢索框中，選擇物種為“homo sapines”，設(shè)置隱藏游離點，minimum required interaction score>0.4，其他參數(shù)均為默認(rèn)選項，構(gòu)建赤芍和PH疾病交集靶蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI），并下載該TSV文件。利用Cytoscape 3.7.1軟件載入TSV文件并進(jìn)行可視化處理，再利用Network Analyzer功能，根據(jù)節(jié)點degree值篩選出排名靠前的靶點。

1.5? ? GO及KEGG富集分析? ? 赤芍和PH疾病共同靶點的GO功能和KEGG通路富集分析通過DAVID數(shù)據(jù)庫實現(xiàn)，并利用生信數(shù)據(jù)分析平臺進(jìn)行可視化處理。

2? ? 結(jié)果

2.1? ? 赤芍有效成分篩選? ? 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索赤芍有效成分及作用靶點。獲得赤芍活性成分共29個，包括鞣花酸、芍藥苷、黃芩素和黃芩苷等化合物。再根據(jù)活性成分預(yù)測靶標(biāo)共128個，剔除重復(fù)靶標(biāo)，共得82個靶標(biāo)，利用Uiprot數(shù)據(jù)庫，設(shè)置檢索條件為“review”“human”，將收集的靶蛋白名稱轉(zhuǎn)換為對應(yīng)基因名簡稱。

2.2? ? 赤芍和PH疾病交集靶點篩選? ? 利用TTD數(shù)據(jù)庫獲得肺動脈高壓靶點18個，再采用GeneCards數(shù)據(jù)庫得到肺動脈高壓靶點5 843個，經(jīng)過2次中位數(shù)篩選后獲得最終靶點1 461個。利用OMIM數(shù)據(jù)庫得到肺動脈高壓靶點244個，剔除重復(fù)靶點，將3個數(shù)據(jù)庫收集的靶點取并集共得1 651個肺動脈高壓靶點，與赤芍的82個靶點通過Venn圖取交集，獲得的46個赤芍-肺動脈高壓交集靶點，即為赤芍治療肺動脈高壓潛在靶點，見圖1。

2.3? ? PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點篩選? ? 通過STRING數(shù)據(jù)庫將赤芍-肺動脈高壓46個交集靶點繪制PPI網(wǎng)絡(luò)，利用 Cytoscape 3.6.1軟件進(jìn)行可視化處理，見圖2。根據(jù)相互作用節(jié)點degree數(shù)值大小進(jìn)行核心靶點篩選。篩選出白介-6（IL-6）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）、腫瘤壞死因子（TNF）、腫瘤蛋白p53（TP53）、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）和基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）等蛋白。

2.4? ? GO及KEGG富集分析? ? 赤芍-肺動脈高壓共同靶點的GO富集分析是利用DAVID在線工具實現(xiàn)的，共獲得生物過程（biological process，BP）條目227個（P<0.05），主要涉及對低氧的反應(yīng)、凋亡的正負(fù)調(diào)控和MAPK級聯(lián)反應(yīng)的調(diào)控等；細(xì)胞組成（cellular component，CC）條目26個（P<0.05），主要涉及線粒體、質(zhì)膜、細(xì)胞質(zhì)和核質(zhì)等；分子功能（molecular function，MF）條目47個（P<0.05），主要涉及酶激活、蛋白酶激活和蛋白激酶激活等，見圖3。同時，利用DAVID在線工具對赤芍-肺動脈高壓共同靶點進(jìn)行KEGG通路富集分析，主要涉及HIF-1信號通路、Toll-受體信號通路、NF-kB 信號通路、和TNF信號通路等，見圖4。

3? ? 討論

赤芍是茛科植物芍藥或川赤芍的干燥根，具有清熱涼血，散瘀止痛的療效[4]。但是，關(guān)于赤芍治療肺動脈高壓的具體分子機制仍不清楚，其部分原因在于赤芍成分復(fù)雜，作用靶點較多[4]。本文利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)首次系統(tǒng)全面地預(yù)測赤芍治療肺動脈高壓的機制，為赤芍防治肺動脈高壓、肺心病提供分子理論基礎(chǔ)。

本研究通過TCMSP數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，赤芍的主要活性成分包括鞣花酸、芍藥苷、黃芩素和黃芩苷等化合物。李海燕通過大鼠缺氧性肺動脈高壓實驗發(fā)現(xiàn)，鞣花酸對肺動脈平滑肌細(xì)胞的異常增生有抑制作用，同時可降低右心室壓力，改善右心肥厚程度[6]。錢國清等人研究發(fā)現(xiàn)，芍藥苷可誘導(dǎo)低氧大鼠肺動脈平滑肌細(xì)胞凋亡，其作用機制主要包括阻滯細(xì)胞周期、調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)[7]。而魏澤卉通過野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺動脈高壓模型發(fā)現(xiàn)，黃芩素可能通過抑制MAPK和NF-κB信號通路來抑制肺血管重構(gòu)，從而改善肺動脈高壓和右心室肥厚[8]。

本研究通過PPI網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，IL-6、AKT1、TNF、TP53、VEGFA和MMP9等蛋白節(jié)點度值較高，推測這些蛋白可能是赤芍治療肺動脈高壓的重要靶點。一些隊列研究顯示，血清中IL-6在肺動脈高壓組較對照組高，與肺動脈高壓特定臨床亞型預(yù)后相關(guān)，提示IL-6是治療肺動脈高壓的潛在靶點[9]。Tang H等人利用Akt1敲除小鼠研究發(fā)現(xiàn)，Akt1可能在肺動脈高壓發(fā)病上起著關(guān)鍵性作用，是治療肺動脈高壓潛在靶點[10]。臨床上觀察到，TNF-α在肺動脈高壓患者中表達(dá)水平較高，F(xiàn)ujita M等人利用TNF-α轉(zhuǎn)基因小鼠研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)TNF-α導(dǎo)致嚴(yán)重的肺動脈高壓[11]。而George J等人研究發(fā)現(xiàn)，MMP-9在肺動脈高壓的發(fā)病機制中起著重要作用，有效阻斷MMP-9可為人類肺動脈高壓的治療干預(yù)提供一種選擇[12]。

本研究通過富集分析發(fā)現(xiàn)，預(yù)測的靶基因主要集中在 HIF-1信號通、Toll-受體信號通路、NF-kB信號通路和TNF信號通路等。Lei W等人研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α基因和蛋白表達(dá)在肺動脈高壓患者中較正常對照組高[13]。而Smith K A等人利用動物模型發(fā)現(xiàn)，HIF-1α在低氧誘導(dǎo)的右心室重塑、右心室肥厚發(fā)揮著重要作用[14]。同樣，Toll-受體信號通路在肺動脈高壓中扮演重要角色，F(xiàn)arkas D等人研究表明，降低Toll-受體3表達(dá)，可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和肺血管重塑[15]。

綜上所述，本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)系統(tǒng)全面預(yù)測赤芍治療肺動脈高壓的作用機制，發(fā)現(xiàn)其可能通過調(diào)節(jié)IL-6、AKT1、TNF、VEGFA、MMP9等關(guān)鍵蛋白，干預(yù)HIF-1信號通路、Toll-受體信號通路、NF-kB信號通路和TNF 信號通路等來發(fā)揮作用。本文仍存在一定的局限性，相關(guān)結(jié)論是通過在線工具預(yù)測，仍需要實驗進(jìn)一步驗證。

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（收稿日期：2023-04-16）