張?jiān)撇?，劉雨?/p>

（河西學(xué)院醫(yī)學(xué)院，甘肅 張掖 734000）

肌肉和運(yùn)動神經(jīng)纖維，通過研究電流刺激參數(shù)和骨骼肌收縮反應(yīng)的關(guān)系，為臨床治療肌萎縮及運(yùn)動神經(jīng)纖維損傷提供實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)[3-4]。制備牛蛙離體腓腸肌標(biāo)本的手術(shù)操作步驟簡單，室溫條件下用任氏液防止組織干燥就能保持其興奮性。因此，本文以牛蛙離體坐骨神經(jīng)- 腓腸肌標(biāo)本為研究對象，觀察在不同強(qiáng)度、頻率的電流刺激下，復(fù)方當(dāng)歸注射液對牛蛙離體腓腸肌收縮活動和興奮性的影響，并初步探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

健康成年牛蛙12 只，雌雄不限，體重（500+50）g，由張掖市譽(yù)誠醫(yī)藥生物科技有限公司提供。

1.2 試劑與儀器

復(fù)方當(dāng)歸注射液（規(guī)格為2 mL），由福建古田藥業(yè)有限公司提供；新鮮任氏液，由河西學(xué)院醫(yī)學(xué)院生理實(shí)驗(yàn)室配制；BL- 420F 生物信息采集分析系統(tǒng)、張力傳感器、神經(jīng)屏蔽盒等，均由成都泰盟科技有限公司提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 雙毀髓法[1]制備坐骨神經(jīng)- 腓腸肌標(biāo)本 將牛蛙固定于蛙板上，殺蛙針通過枕骨大孔垂直進(jìn)針，斜向上水平搗毀腦組織，再向下垂直搗毀脊髓。通過檢查四肢肌張力是否消失判斷腦和脊髓的破壞程度，當(dāng)牛蛙處于腦死亡狀態(tài)后，用粗剪刀剪除頭部、軀干上肢和內(nèi)臟組織，剝除皮膚組織。將蛙從脊髓中央分離成兩半，一半浸泡在任氏液中備用，另一半用蛙足釘將兩端固定在木質(zhì)蛙板上繼續(xù)分離。向上保留與坐骨神經(jīng)相連的一段脊柱，向下沿坐骨神經(jīng)干走向用玻璃分針分離周圍組織，剪去其側(cè)肢保留主干結(jié)構(gòu)完整，在膝關(guān)節(jié)上部留取約3 cm 的股骨，剪去膝關(guān)節(jié)以下的后肢，以玻璃分針游離腓腸肌，用絲線結(jié)扎跟腱處后將其剪斷。實(shí)驗(yàn)過程中不斷將任氏液滴在坐骨神經(jīng)干和腓腸肌上，防止組織干燥。

1.3.2 坐骨神經(jīng)- 腓腸肌標(biāo)本興奮性檢查 標(biāo)本制備好后，用鋅銅弓檢查其反應(yīng)，保證興奮性良好。

1.3.3 數(shù)據(jù)采集與記錄 將坐骨神經(jīng)- 腓腸肌標(biāo)本的股骨端固定在神經(jīng)屏蔽盒中，另一端用細(xì)線連接在張力傳感器上；將脊柱段放入神經(jīng)屏蔽盒，坐骨神經(jīng)干搭在刺激電極上。連接BL- 420F 生物信息采集分析系統(tǒng)，選擇生理學(xué)實(shí)驗(yàn)—神經(jīng)肌肉實(shí)驗(yàn)—刺激強(qiáng)度與骨骼肌收縮張力的關(guān)系、刺激頻率與骨骼肌收縮形式的關(guān)系。用直流電刺激坐骨神經(jīng)干，在CH1 通道，波寬0.1 ms，分別記錄不同刺激強(qiáng)度（刺激頻率為1 Hz、初始刺激強(qiáng)度為0.040 V、增益為0.002 V）和不同刺激頻率下（刺激強(qiáng)度為1 V，初始刺激頻率為1 Hz、增益為1 Hz），腓腸肌發(fā)生收縮活動時的波形。

1.3.4 給藥方法 待波形穩(wěn)定后，先滴加5%復(fù)方當(dāng)歸注射液0.1 mL，記錄給藥前后波形的變化；給標(biāo)本滴加任氏液0.2 mL，靜置20min，待波形恢復(fù)正常后，滴加0.2 mL維拉帕米（10-5mol·L-1），5 min 后再滴加0.2 mL 復(fù)方當(dāng)歸注射液，記錄波形的變化。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 23.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，采用t 檢驗(yàn)分析給藥前后骨骼肌收縮張力的變化，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 滴加復(fù)方當(dāng)歸注射液后，腓腸肌發(fā)生單收縮活動時刺激強(qiáng)度的變化

與給藥前相比，在刺激頻率保持1 Hz 不變的情況下，逐漸增加電流刺激強(qiáng)度（增益為0.002 V），復(fù)方當(dāng)歸注射液可降低使腓腸肌單收縮時的閾強(qiáng)度、半高刺激強(qiáng)度、最適刺激強(qiáng)度，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01），使腓腸肌單收縮時的最大收縮張力、最小收縮張力、平均收縮張力升高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01）。由此可見，復(fù)方當(dāng)歸注射液可降低腓腸肌發(fā)生反應(yīng)的閾強(qiáng)度，提高其發(fā)生單收縮反應(yīng)的興奮性，也能增強(qiáng)其單收縮時的最大、最小收縮張力（見表1、圖1、表2、圖2）。

圖2 給藥10 min 后刺激強(qiáng)度與腓腸肌單收縮張力的變化曲線Figure 2 Change curve of stimulation intensity and single contraction tension of gastrocnemius muscle 10 minutes after administration

表1 復(fù)方當(dāng)歸注射液對刺激強(qiáng)度與腓腸肌單收縮關(guān)系的影響（±s） 單位：VTable 1 Effect of compound angelica sinensis injection on the relationship between stimulation intensity and single contraction of gastrocnemius muscle（±s） Unit：V

表1 復(fù)方當(dāng)歸注射液對刺激強(qiáng)度與腓腸肌單收縮關(guān)系的影響（±s） 單位：VTable 1 Effect of compound angelica sinensis injection on the relationship between stimulation intensity and single contraction of gastrocnemius muscle（±s） Unit：V

注：與給藥前比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

最適刺激強(qiáng)度0.076±0.030 0.068±0.020*時間 閾強(qiáng)度0.060±0.004 0.044±0.002**給藥前給藥10 min 后半高刺激強(qiáng)度0.068±0.040 0.054±0.030**

表2 復(fù)方當(dāng)歸注射液對腓腸肌單收縮張力的影響（±s） 單位：gTable 2 Effect of Compound angelica sinensis injection on single contraction tension of gastrocnemius muscle（±s）Unit：g

表2 復(fù)方當(dāng)歸注射液對腓腸肌單收縮張力的影響（±s） 單位：gTable 2 Effect of Compound angelica sinensis injection on single contraction tension of gastrocnemius muscle（±s）Unit：g

注：與給藥前比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

平均收縮張力7.98±0.56 12.98±0.74**時間 最大收縮張力45.18±1.56 50.36±1.03*給藥前給藥10 min 后最小收縮張力6.65±0.32 11.10±0.49**

2.2 復(fù)方當(dāng)歸注射液對腓腸肌強(qiáng)直收縮的影響

與給藥前相比，在刺激強(qiáng)度為1 V、逐漸增加電流刺激頻率（增益為1 Hz）的情況下，復(fù)方當(dāng)歸注射液能降低腓腸肌發(fā)生不完全強(qiáng)直收縮和完全強(qiáng)直收縮時所需的刺激頻率（P＜0.05），增加腓腸肌完全強(qiáng)直收縮過程中的最大收縮張力和最小收縮張力（P＜0.01），見圖3、圖4、表3。

圖3 給藥前刺激頻率與腓腸肌收縮形式的變化曲線Figure 3 Curve of change of stimulation frequency and contraction form of gastrocnemius muscle before administration

圖4 復(fù)方當(dāng)歸注射液對腓腸肌收縮形式的影響Figure 4 Effect of compound angelica sinensis injection on the contraction form of gastrocnemius muscle

表3 復(fù)方當(dāng)歸注射液對腓腸肌收縮形式的影響（±s）Table 3 Effect of compound angelica sinensis injection on the contraction form of gastrocnemius muscle（±s）

表3 復(fù)方當(dāng)歸注射液對腓腸肌收縮形式的影響（±s）Table 3 Effect of compound angelica sinensis injection on the contraction form of gastrocnemius muscle（±s）

注：與給藥前比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

完全強(qiáng)直收縮時最小收縮張力/g 9.45±0.48 20.99±0.98**時間 完全強(qiáng)直收縮時的刺激頻率/Hz 20.00±1.89 16.00±0.68*給藥前給藥10 min 后不完全強(qiáng)直收縮時的刺激頻率/Hz 6.00±0.49 3.00±0.16*完全強(qiáng)直收縮時最大收縮張力/g 130.23±2.89 189.26±3.16**

2.3 維拉帕米+復(fù)方當(dāng)歸注射液對腓腸肌單收縮活動的影響

腓腸肌發(fā)生單收縮時，維拉帕米可阻斷復(fù)方當(dāng)歸注射液增強(qiáng)腓腸肌完全強(qiáng)直收縮時最大、最小和平均收縮張力的效應(yīng)（P＜0.05），但對復(fù)方當(dāng)歸注射液下調(diào)腓腸肌發(fā)生完全強(qiáng)直收縮時所需的刺激頻率的效應(yīng)無阻斷作用，見圖5、表4。

圖5 維拉帕米+復(fù)方當(dāng)歸注射液對腓腸肌完全強(qiáng)直收縮時張力的影響Figure 5 The effect of Verapamil+compound angelica sinensis injection on the tension of gastrocnemius muscle during complete tetanic contraction

表4 維拉帕米+復(fù)方當(dāng)歸注射液對腓腸肌收縮形式的影響（±s）Table 4 Effect of Verapamil+compound angelica sinensis injection on contraction form of gastrocnemius muscle（±s）

表4 維拉帕米+復(fù)方當(dāng)歸注射液對腓腸肌收縮形式的影響（±s）Table 4 Effect of Verapamil+compound angelica sinensis injection on contraction form of gastrocnemius muscle（±s）

注：與滴加復(fù)方當(dāng)歸注射液10 min 后比較，*P＜0.05。

滴加復(fù)方當(dāng)歸注射液10 min 后維拉帕米+ 復(fù)方當(dāng)歸注射液不完全強(qiáng)直收縮時的刺激頻率/Hz 3.00±0.16 4.00±0.16完全強(qiáng)直收縮時的刺激頻率/Hz 16.00±0.68 15.00±0.56完全強(qiáng)直收縮時最大收縮張力/g 189.26±3.16 145.18±3.76*完全強(qiáng)直收縮時最小收縮張力/g 20.99±0.98 15.92±0.89*

2.4 琥珀膽堿+復(fù)方當(dāng)歸注射液對腓腸肌單收縮活動的影響

在腓腸肌單收縮反應(yīng)良好的情況下，加入琥珀膽堿3 min后，收縮反應(yīng)波形消失變?yōu)橹本€，肉眼觀察腓腸肌無收縮活動。此時，加入復(fù)方當(dāng)歸注射液，10 min 后，刺激反應(yīng)波形依然是平直狀態(tài)，說明琥珀膽堿可阻斷復(fù)方當(dāng)歸注射液對離體坐骨神經(jīng)-腓腸肌收縮活動的作用，見圖6。

圖6 琥珀膽堿+復(fù)方當(dāng)歸注射液對腓腸肌收縮張力的影響Figure 6 The effect of suxamethonium chloride+compound angelica sinensis injection on the contractile tension of gastrocnemius muscle

2.5 乙酰膽堿（Ach）+復(fù)方當(dāng)歸注射液對腓腸肌單收縮活動的影響

與單純給Ach 相比，Ach+復(fù)方當(dāng)歸注射液可下調(diào)腓腸肌收縮反應(yīng)的閾值，降低最適刺激強(qiáng)度（P＜0.05）。由此可見，Ach 與復(fù)方當(dāng)歸注射液對腓腸肌發(fā)生收縮反應(yīng)的閾強(qiáng)度和最適刺激強(qiáng)度的影響有協(xié)同效應(yīng)，見表5、圖7、圖8。

圖7 Ach 對腓腸肌收縮活動的影響Figure 7 Effect of Ach on contractile activity of gastrocnemius muscle

圖8 Ach+復(fù)方當(dāng)歸注射液對腓腸肌收縮的影響Figure 8 Effect of Ach+compound angelica sinensis injection on contraction of gastrocnemius muscle

表5 Ach 和復(fù)方當(dāng)歸注射液對刺激強(qiáng)度的影響 單位：mVTable 5 Ach and the effect of compound angelica sinensis injection on stimulation intensityUnit：mV

2.6 復(fù)方當(dāng)歸注射液對坐骨神經(jīng)干產(chǎn)生動作電位的閾強(qiáng)度的影響

與給藥前相比，在波寬1 ms、延時21 ms 的情況下，給予坐骨神經(jīng)起始為0.1 mV 的電流刺激（增益為0.1 mV），與給藥前相比，復(fù)方當(dāng)歸注射液可下調(diào)坐骨神經(jīng)干產(chǎn)生動作電位的閾強(qiáng)度，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。閾值是衡量興奮性的指標(biāo)，其大小與興奮性呈反比。由此可見，復(fù)方當(dāng)歸注射液能提高坐骨神經(jīng)干產(chǎn)生動作電位的興奮性，見表6、圖9、圖10。

圖9 給藥前坐骨神經(jīng)干產(chǎn)生動作電位的閾強(qiáng)度Figure 9 Threshold intensity of action potential produced by sciatic nerve trunk before administration

圖10 復(fù)方當(dāng)歸注射液對坐骨神經(jīng)干產(chǎn)生動作電位閾強(qiáng)度的影響變化曲線Figure 10 Change curve of influence of compound angelica sinensis injection on threshold intensity of action potential produced by sciatic nerve trunk

表6 復(fù)方當(dāng)歸注射液對坐骨神經(jīng)干產(chǎn)生動作電位閾強(qiáng)度的影響（±s）Table 6 Effect of compound angelica sinensis injection on threshold intensity of action potential produced by sciatic nerve trunk（±s）

表6 復(fù)方當(dāng)歸注射液對坐骨神經(jīng)干產(chǎn)生動作電位閾強(qiáng)度的影響（±s）Table 6 Effect of compound angelica sinensis injection on threshold intensity of action potential produced by sciatic nerve trunk（±s）

注：與給藥前比較，*P＜0.05。

時間閾強(qiáng)度/ mV 1.10±0.08 0.80±0.05*給藥前給藥10 min 后

3 討論

中醫(yī)將肌無力歸于“萎癥”“虛勞”等范疇，認(rèn)為其與脾、胃、肝、腎等臟腑功能失調(diào)有關(guān)，治療主張滋補(bǔ)肝腎、強(qiáng)健筋骨、祛風(fēng)通絡(luò)、養(yǎng)心益氣。臨床常用復(fù)方當(dāng)歸注射液治療椎間盤損傷、腰肌勞損、急性腰扭傷、增生性和強(qiáng)直性脊柱炎等，且取得較好效果。

3.1 復(fù)方當(dāng)歸注射液增強(qiáng)腓腸肌收縮的離子通道機(jī)制

毛啟遠(yuǎn)等[5]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸補(bǔ)血湯對小鼠心功能，尤其是處在收縮期的心肌組織有明顯的保護(hù)作用。骨骼肌收縮過程中，會出現(xiàn)一個完整的收縮波曲線，包括潛伏期、收縮期和舒張期，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度開始下降時，進(jìn)入舒張期[6]。目前公認(rèn)的肌肉收縮機(jī)制為肌絲滑動原理，肌肉收縮主要與細(xì)胞內(nèi)液Ca2+濃度升高有關(guān)，骨骼肌收縮時，大部分細(xì)胞內(nèi)Ca2+來自肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，少部分Ca2+源于細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流[7]。骨骼肌收縮的形式與肌肉組織中收縮蛋白的數(shù)量和肌肉內(nèi)部的生理狀態(tài)變化密切相關(guān)，肌肉收縮舒張的速度、張力等也會隨之改變[8]。研究表明，當(dāng)歸含有人體所需的17 種氨基酸和Na+、K+、Ca2+、Mg2+等20 余種無機(jī)物，這些離子物質(zhì)與體內(nèi)多種代謝活動及細(xì)胞興奮性有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)方當(dāng)歸注射液可以升高坐骨神經(jīng)干興奮性，腓腸肌發(fā)生單收縮、不完全強(qiáng)直收縮和完全強(qiáng)直收縮時的最大收縮張力、最小收縮張力；維拉帕米可以阻斷復(fù)方當(dāng)歸注射液增強(qiáng)腓腸肌收縮張力的效應(yīng)，可能與當(dāng)歸促進(jìn)Ca2+內(nèi)流，升高腓腸肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度有關(guān)。

3.2 復(fù)方當(dāng)歸注射液可促進(jìn)Ach 釋放并促進(jìn)其與N2 受體結(jié)合

坐骨神經(jīng)支配腓腸肌收縮時，其接頭處興奮的傳遞過程需要電信號觸發(fā)突觸前膜的Ca2+通道，突觸小泡前移釋放Ach，Ach 與終板膜中N2 型Ach 受體結(jié)合產(chǎn)生終板電位，從而完成興奮傳遞，隨后Ach 被終板膜中膽堿酯酶水解[9]。琥珀膽堿屬于去極化型非選擇性N2 受體阻斷劑，作用于運(yùn)動神經(jīng)終板膜以阻斷神經(jīng)- 骨骼肌接頭處Ach 向骨骼肌傳遞信息的過程，使肌肉松弛。研究結(jié)果顯示，琥珀膽堿可阻斷復(fù)方當(dāng)歸注射液對腓腸肌單收縮活動的興奮作用，而乙酰膽堿卻能增強(qiáng)其對腓腸肌單收縮時閾值和最適刺激強(qiáng)度的影響效應(yīng)，提高其興奮性。由此可見，復(fù)方當(dāng)歸注射液可能通過觸發(fā)突觸前膜Ca2+通道開放，進(jìn)而促進(jìn)Ach 釋放，促進(jìn)Ach 與N2 受體結(jié)合，從而增強(qiáng)腓腸肌在電流刺激下發(fā)生單收縮反應(yīng)的興奮性和收縮張力。

3.3 復(fù)方當(dāng)歸注射液可增強(qiáng)大小運(yùn)動單位的興奮性

腓腸肌屬于可興奮組織。閾強(qiáng)度是指能夠引起其發(fā)生收縮反應(yīng)（腓腸肌細(xì)胞膜上產(chǎn)生動作電位）的最小刺激強(qiáng)度；最大刺激強(qiáng)度是指腓腸肌的收縮張力不會隨著刺激強(qiáng)度的增加而逐漸升高的臨界值；半高刺激強(qiáng)度是腓腸肌收縮張力達(dá)到最大收縮張力的1/2 時的刺激強(qiáng)度[10-11]。衡量可興奮細(xì)胞、組織興奮性的指標(biāo)是閾強(qiáng)度，其與興奮性呈反比[12]。骨骼肌發(fā)生收縮活動時遵循大小原則，即運(yùn)動單位的動員是由小到大逐步逐級動員。這是因?yàn)樾∵\(yùn)動單位興奮性高，首先被動員；大運(yùn)動單位興奮性低，只有當(dāng)刺激強(qiáng)度足夠大時，才能被動員[13]。腓腸肌組織內(nèi)的運(yùn)動單位為1 934 個，肌纖維為3 868 000 個。許培宏等[14]研究發(fā)現(xiàn)，間接刺激和直接刺激都可以引起腓腸肌收縮，但通過刺激神經(jīng)間接引起肌肉收縮的效率更高（閾強(qiáng)度和最適刺激強(qiáng)度更小，而最大單收縮幅度更大），可能是因?yàn)殚g接刺激通過神經(jīng)纖維末梢、以運(yùn)動單位的形式可更方便地動員更多肌肉纖維參與收縮，因而更敏感，收縮力也更大。本研究結(jié)果顯示，復(fù)方當(dāng)歸注射液可下調(diào)腓腸肌單收縮時的閾強(qiáng)度、半高刺激強(qiáng)度和最適刺激強(qiáng)度。由此可見，復(fù)方當(dāng)歸注射液可以通過降低電流刺激腓腸肌時發(fā)生收縮反應(yīng)的閾值，增強(qiáng)其興奮性，其機(jī)制可能與復(fù)方當(dāng)歸注射液能促進(jìn)Ach 與骨骼肌細(xì)胞膜上N2 受體結(jié)合，促進(jìn)神經(jīng)- 骨骼肌接頭結(jié)構(gòu)處信息的傳遞，從而增強(qiáng)大小運(yùn)動單位的興奮性有關(guān)。

綜上所述，復(fù)方當(dāng)歸注射液既可以通過增強(qiáng)坐骨神經(jīng)干傳導(dǎo)動作電位的能力，又可以提高腓腸肌興奮性，使腓腸肌發(fā)生單收縮、不完全強(qiáng)直收縮和完全強(qiáng)直收縮的最大、最小收縮張力、平均收縮張力增加。但是，正常生理狀態(tài)下，軀體的運(yùn)動幾乎都是以完全強(qiáng)直收縮的形式進(jìn)行。由此可見，復(fù)方當(dāng)歸注射液在一定程度上可以有效緩解肌無力，其具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。