肖立康，董永輝，鄭稼

激素性股骨頭壞死（steroid-induced osteonecrosis of femoral head, SONFH）是一種非創(chuàng)傷性股骨頭壞死（osteonecrosis of the femoral head, ONFH），一般有明確的激素應(yīng)用史，早期可進(jìn)行藥物治療及髓心減壓術(shù)、帶血管蒂骨移植等保髖手術(shù)，如未進(jìn)行有效的治療，80%的患者會在1~4年內(nèi)發(fā)生股骨頭塌陷[1]。股骨頭一旦塌陷，保守治療療效不佳，只能進(jìn)行全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)[2]。隨著糖皮質(zhì)激素廣泛應(yīng)用于血液病、嚴(yán)重急性呼吸綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等免疫系統(tǒng)損傷相關(guān)疾病，SONFH的發(fā)病率逐年上升，且ONFH患者逐漸年輕化。SONFH的發(fā)病機(jī)制包括脂肪栓塞、骨髓內(nèi)壓力升高、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMSC）成骨和成脂分化不平衡及血管生成障礙等[3]。近年來隨著基因研究的深入，SONFN的分子機(jī)制研究有了較大進(jìn)展，但SONFH確切的分子發(fā)病機(jī)制至今尚無定論。因此，有必要繼續(xù)尋找SONFN相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物，并探討其分子發(fā)病機(jī)制，從而尋找更有效、更完善的ONFN診療方法。本研究擬采用生物信息學(xué)分析篩選SONFH新的潛在生物標(biāo)志物，并探索其相關(guān)發(fā)病機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 研究樣本

本研究從高通量基因表達(dá)（gene expression omnibus, GEO）數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）提取了來源于GPL15207平臺的數(shù)據(jù)集GSE123568，其中包括30例SONFH患者和10例非SONFH患者（類固醇給藥后）。

1.2 篩選差異表達(dá)基因（differential expressed gene,DEG）

使用R語言程序（4.1.1版）的LIMMA（微陣列數(shù)據(jù)的線性模型）軟件包對樣本進(jìn)行分析，篩選樣本中閾值標(biāo)準(zhǔn)|log2FC|＞1和P＜0.05的DEG。然后，在R語言程序中使用Pheatmap軟件包（1.0.12版）繪制數(shù)據(jù)集DEG的熱圖。R語言程序中使用的參數(shù)包括分位數(shù)、Median polish和PM矯正。

1.3 DEG的富集分析

基因本體論（gene ontology, GO）為功能基因組學(xué)研究提供全面的資源，包括各個物種的生物過程（biological process, BP）、細(xì)胞成分（cell component,CC）和分子功能（molecular function, MF）。京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG）整合了所有完整測序的基因組和部分基因組，同時附帶最新的基因功能注釋。使用David數(shù)據(jù)庫（6.8版，https://david.ncifcrf.gov/）進(jìn)行富集分析，從分子水平和功能水平研究DEG。

1.4 基因富集分析（gene set enrichment analysis,GSEA）

GSEA是一種不同于GO分析和KEGG分析的富集分析方法，可以協(xié)助找出表達(dá)差異不顯著卻同樣值得關(guān)注的基因。運(yùn)行R語言程序的ClusterProfiler軟件包（3.10.1版）對所有基因進(jìn)行GSEA，為篩選DEG的生物學(xué)功能提供另一種選擇。用R語言程序的Enrichplot軟件包（1.2.0版）繪制ES圖、熱圖和Rank圖。顯著富集標(biāo)準(zhǔn)：P＜5%，F(xiàn)DR＜25%。

1.5 構(gòu)建蛋白相互作用（protein-protein interaction,PPI）網(wǎng)絡(luò)

通過搜索String數(shù)據(jù)庫（http://www.string-db.org/）來預(yù)測PPI網(wǎng)絡(luò)，構(gòu)建了以綜合得分＞0.4為截斷點(diǎn)的DEG的PPI網(wǎng)絡(luò)。應(yīng)用Cytoscape軟件的MCODE插件選出最顯著模塊，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)：Degree Cutoff=2、Max depth=100、Node Score Cutoff=0.2、K-core=2。再次使用David數(shù)據(jù)庫對該模塊中的基因進(jìn)行GO分析和KEGG分析。

1.6 篩選關(guān)鍵基因

使用Cytoscape軟件的Cytohubba插件運(yùn)行12種方法篩選PPI網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵基因，Degree、BottleNeck、Radiality、Stress、Closeness較適合人類。篩選出關(guān)鍵基因后再次構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.7 關(guān)鍵基因在BMSC中的表達(dá)

1.7.1 樣本分組

本研究選擇人BMSC［賽業(yè)（蘇州）生物科技有限公司］進(jìn)行驗(yàn)證，使用不同濃度的地塞米松（dexamethasone, DEX）在37℃、95% O2、5% CO2下處理BSMC 72 h，以模擬細(xì)胞水平SONFH的發(fā)生過程。將BMSC分為5組：①空白對照組，BMSC不進(jìn)行任何處理；②二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide, DMSO）組，用DEX的溶媒DMSO處理BMSC，排除因溶媒引起的mRNA表達(dá)變化；③10-8mol/L組，用10-8mol/L的DEX處理BMSC；④10-7mol/L組，用10-7mol/L的DEX處理BMSC；⑤10-6mol/L組，用10-6mol/L的DEX處理BMSC。

1.7.2 RNA提取

選擇超純總RNA快速提取試劑盒（北京博邁德基因技術(shù)有限公司）進(jìn)行RNA提取，向培養(yǎng)板中加入裂解液RL后迅速搖勻，使RL充分與細(xì)胞接觸，裂解細(xì)胞并滅活RNA酶，使用移液槍吹打混勻。

將得到的混勻樣品室溫下放置孵育5 min。每1 mL RL加0.2 mL氯仿，蓋緊樣品管蓋，劇烈振蕩15 s，并將其在室溫下放置孵育3 min。

在4℃環(huán)境下設(shè)定轉(zhuǎn)速為12 000 r/min（r=5 cm，下同），將樣品離心10 min。取上清液轉(zhuǎn)移至新管中，加入等量的70%乙醇溶液，顛倒混勻后轉(zhuǎn)移至吸附柱RA中。然后在轉(zhuǎn)速12 000 r/min下離心45 s，棄去廢液，將吸附柱RA再次套回收集管中。加400 μL RE，12 000 r/min離心45 s，棄去廢液。

取新的RNase-free離心管，加入10 μL DNase Ⅰ儲存液中和70 μL RDD溶液，輕柔混勻后加入吸附柱RA中央，室溫放置15 min后加入400 μL RE，在轉(zhuǎn)速12 000 r/min下離心45 s，棄去廢液。然后再加入500 μL漂洗液RW，在轉(zhuǎn)速12 000 r/min下離心45 s，棄去廢液。將吸附柱RA放回空的收集管中，再次12 000 r/min離心2 min后去除漂洗液。

取出吸附柱RA，放入RNase-free離心管，根據(jù)預(yù)期RNA產(chǎn)量向吸附柱RA中央加入適量RNase-free H2O，室溫放置2 min后在轉(zhuǎn)速12 000 r/min下離心1 min。使用超微量核酸分析儀NANO-400A（杭州奧盛儀器有限公司）測定RNA濃度，并記錄。

1.7.3 cDNA合成

使用HiFiScript cDNA Synthesis Kit試劑盒（江蘇康為世紀(jì)生物科技股份有限公司）進(jìn)行cDNA合成。將RNA模板、Primer Mix、dNTP Mix、DTT、RT Buffer、HiFiScript和RNase-free H2O溶解并置于冰上備用。配制成20 μL反應(yīng)體系進(jìn)行基因組DNA去除和cDNA合成（表1）。將混合液渦旋震蕩混勻，短暫離心使溶液收集到管底。42℃下孵育15 min，然后85℃下孵育5 min。待反應(yīng)結(jié)束后短暫離心，然后置于冰上等待下一步操作。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行后續(xù)實(shí)時熒光定量PCR。

表1 去除基因組DNA和反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系

1.7.4 實(shí)時熒光定量PCR

使用Universal SYBR Green qPCR Super Mix試劑盒（美國EVERBRIGHT公司）進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR，取2×Universal SYBR Green qPCR Super Mix、引物、cDNA、RNase-free H2O，恢復(fù)至室溫，按照表2制備反應(yīng)體系，輕輕渦旋混勻后轉(zhuǎn)移至PCR管進(jìn)行擴(kuò)增。

表2 熒光定量體系

使用PCR檢測系統(tǒng)對mRNA轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行定量。擴(kuò)增條件：95℃作用5 min，然后分別以95℃作用5 s和60℃作用30 s，進(jìn)行40個循環(huán)，建立熔解曲線，獲得定量數(shù)據(jù)。以GAPDH為參照基因，進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)，重復(fù)3次。采用標(biāo)準(zhǔn)比較法（ΔΔCt）評價候選基因的表達(dá)穩(wěn)定性。用2-ΔΔCt法計(jì)算相對靶基因表達(dá)水平，多樣本間比較采用單因素方差分析，應(yīng)用GraphPad Prism 9軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及圖像處理。本研究中使用的引物序列如表3所示。

表3 實(shí)時熒光定量PCR基因引物序列

2 結(jié)果

2.1 確定SONFH的DEG

數(shù)據(jù)集GSE123568中包含402個DEG，其中189個基因表達(dá)上調(diào)，213個基因表達(dá)下調(diào)。圖1和圖2分別顯示了所有DEG的火山圖和差異明顯的前50個表達(dá)上調(diào)基因和前50個表達(dá)下調(diào)基因的熱圖。

圖1 DEG的火山圖

圖2 差異基因表達(dá)熱圖

2.2 GO和KEGG富集分析

考慮到某些表達(dá)上調(diào)基因和表達(dá)下調(diào)基因可能參與同一個通路，所以本研究將所有DEG一起進(jìn)行GO和KEGG富集分析，運(yùn)行R語言程序ggplot包進(jìn)行分析和可視化（圖3）。GO富集分析結(jié)果表明，BP的DEG顯著富集了炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、血小板脫顆粒。對于CC，DEG在質(zhì)膜、胞質(zhì)、外泌體中顯著富集。對于MF，DEG在蛋白結(jié)合、受體活性、趨化因子受體活性和銨鹽跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性中顯著富集。KEGG富集分析結(jié)果表明，DEG主要富集于破骨細(xì)胞分化、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、趨化因子信號通路。

圖3 GO與KEGG富集分析氣泡圖

2.3 GSEA

使用GSEA富集ONFH所有可能的通路（圖4）。其中最顯著富集的基因集與ONFH的發(fā)生呈正相關(guān)，包括細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用效應(yīng)、趨化因子信號通路、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用、JAK-STAT信號通路、Toll樣受體信號通路、溶酶體。

圖4 GSEA富集最明顯的通路

圖5 關(guān)鍵基因的篩選過程

圖6 DEX處理后mRNA表達(dá)變化

2.4 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)和確定關(guān)鍵基因

基于String數(shù)據(jù)庫搜索到402個DEGs互相作用信息，利用Cytoscape軟件聚集成一個由326個節(jié)點(diǎn)和1 193條邊組成的網(wǎng)絡(luò)（圖5A），使用MCODE插件確定了最顯著模塊（圖5B）。對最顯著模塊中的基因再次進(jìn)行了富集分析。結(jié)果顯示，最顯著模塊中的基因主要在GO中的免疫反應(yīng)、Toll樣受體（Toll-like receptors, TLR）1∶TLR2信號通路和三?；?xì)菌脂肽對細(xì)胞的反應(yīng)中顯著富集，在KEGG中主要在吞噬體、破骨細(xì)胞分化和Toll樣受體信號通路等通路中富集（表4）。

表4 顯著模塊基因進(jìn)行富集分析的結(jié)果

選擇Cytohubba插件中5種最合適分類方法篩選中心基因（表5）。最后從中取交集，得到了8個關(guān)鍵基因，分別是TLR2、TYROBP、IRF8、SNCA、PECAM1、SLC4A1、HCK、CD14（圖5C），對關(guān)鍵基因再次構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)（圖5D）。

表5 Cytohubba插件5種方法篩選的關(guān)鍵基因

2.5 關(guān)鍵基因在BMSC中的表達(dá)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述關(guān)鍵基因，本研究選擇了TLR2、IRF8、HCK、CD14、SNCA和SLC4A1進(jìn)行了驗(yàn)證。

SONFH組CD14、SNCA、HCK、IRF8和SLC4A1在DEX處理后表達(dá)顯著增加（P＜0.05），而TLR2的表達(dá)并無明顯增加，在使用10-7mol/L DEX處理后其表達(dá)反而有所減少（圖6）。CD14在使用10-8mol/L DEX處理后較DMSO處理后表達(dá)顯著增加（P＜0.05），在使用10-7mol/L和10-6mol/L DEX分別處理后較10-8mol/L DEX處理后其表達(dá)均顯著增加（P＜0.001）。SNCA在使用10-6mol/L DEX處理后較DMSO、10-8mol/L和10-7mol/L DEX分別處理后其表達(dá)均顯著增加（P＜0.001）。SLC4A1在使用10-6mol/L DEX處理后較DMSO、10-8mol/L、10-7mol/L DEX分別處理后其表達(dá)均顯著增加（P＜0.001）。IRF8在使用10-8mol/L DEX處理后較DMSO處理后表達(dá)顯著增加（P＜0.05），在使用10-6mol/L DEX處理后較DMSO、10-8mol/L和10-7mol/L DEX分別處理后表達(dá)均顯著增加（P＜0.001）。HCK在使用10-8mol/L DEX處理后較DMSO處理后表達(dá)顯著增加（P＜0.001），在使用10-7mol/L DEX處理后較10-8mol/L DEX處理后表達(dá)卻顯著減少（P＜0.01），而在使用10-6mol/L DEX處理后較10-8mol/L和10-7mol/L DEX分別處理后表達(dá)均顯著增加（P＜0.001）。

3 討論

ONFH是股骨頭缺血引起骨細(xì)胞和骨髓成分死亡及之后的修復(fù)，繼而導(dǎo)致股骨頭結(jié)構(gòu)改變、股骨頭塌陷，引起髖關(guān)節(jié)疼痛、功能障礙的疾病，按病因可分為創(chuàng)傷性和非創(chuàng)傷性兩大類。隨著糖皮質(zhì)激素在臨床上的廣泛應(yīng)用，以及一部分患者因病情需要長期服用激素，使得SONFH的發(fā)病率逐年上升。SONFH一旦發(fā)生，隨著病程進(jìn)展會造成股骨頭不可逆損傷，致殘率極高，嚴(yán)重影響患者的生活。本研究采用生物信息學(xué)分析篩選SONFH的DEG，并對其發(fā)病機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步探討。

3.1 富集通路的具體作用

在富集分析過程中，本研究將表達(dá)上調(diào)基因和表達(dá)下調(diào)基因一同分析，避免遺漏表達(dá)上調(diào)基因與表達(dá)下調(diào)基因共同的通路。GO富集分析結(jié)果顯示，DEG主要富集于免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)過程。免疫反應(yīng)與SONFH發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，腫瘤壞死因子-α激活巨噬細(xì)胞打破成骨與破骨的平衡最終可導(dǎo)致骨壞死[4]。同時，在BP中，血小板脫顆粒也明顯富集，血清-糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)激酶（serum and glucocorticoids-inducible kinase-1, SGK1）在DEG中表達(dá)顯著上調(diào)，推測可能是遺傳性或者獲得性因素導(dǎo)致，繼而出現(xiàn)個體對糖皮質(zhì)激素敏感性不同的情況[5]。SGK1可調(diào)節(jié)血小板Orai1蛋白豐度，隨后活化血小板，出現(xiàn)血小板脫顆粒，使局部處于高凝狀態(tài)[6]。激素可直接損傷骨微血管內(nèi)皮細(xì)胞，產(chǎn)生過多的活性氧自由基，致使血管損傷或栓塞，最終發(fā)生局部血供中斷而壞死[7]。推測血小板脫顆粒可能與這種微血管損傷學(xué)說呈協(xié)同作用，共同導(dǎo)致SONFH。KEGG富集分析結(jié)果表明，DEG主要參與破骨細(xì)胞的分化。近年研究顯示，破骨細(xì)胞在SONFH進(jìn)展和股骨頭塌陷的發(fā)生中起重要作用，股骨頭壞死區(qū)的破骨細(xì)胞明顯增多[8-9]。股骨頭是糖皮質(zhì)激素過量而產(chǎn)生不良反應(yīng)的敏感解剖部位，前人利用小鼠模型證明，糖皮質(zhì)激素可延長破骨細(xì)胞壽命，縮短成骨細(xì)胞壽命，骨質(zhì)破壞與硬化骨的形成導(dǎo)致了股骨頭塌陷這一結(jié)局[10]。研究破骨細(xì)胞分化過程中的分子機(jī)制對SONFN的早期診斷與治療可以起到指導(dǎo)作用。

對于GSEA，本研究將表達(dá)矩陣中包括DEG在內(nèi)的所有基因放在一起進(jìn)行分析。結(jié)果表明，樣本中患者的大部分基因主要富集于細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、趨化因子信號通路、JAK-STAT信號通路、自然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用、Toll樣受體信號通路和溶酶體。這些都被證實(shí)是糖皮質(zhì)激素促進(jìn)炎癥反應(yīng)的重要機(jī)制，從而參與了SONFH的發(fā)病機(jī)制。糖皮質(zhì)激素促進(jìn)Toll樣受體信號通路激活是促進(jìn)炎癥的重要因素，根據(jù)GO富集分析結(jié)果，考慮是通過激活MyD88信號通路來實(shí)現(xiàn)的。此外，還涉及溶酶體途徑，推測自噬參與了SONFH的發(fā)病機(jī)制。自噬是一把雙刃劍，可以通過清除損傷細(xì)胞器來保護(hù)細(xì)胞，過度自噬則會導(dǎo)致細(xì)胞死亡[11]。糖皮質(zhì)激素可通過誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄調(diào)控來保護(hù)破骨細(xì)胞破壞成骨細(xì)胞，進(jìn)一步導(dǎo)致ONFH，然而這仍需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。JAK-STAT信號通路在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)過程中起著至關(guān)重要的作用，多種促炎細(xì)胞因子會通過此途徑介導(dǎo)軟骨的炎癥與降解[12]。對PPI網(wǎng)絡(luò)的顯著模塊基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析，結(jié)果與之前的分析一致。這些機(jī)制可能解釋了SONFH發(fā)生的具體過程。

3.2 關(guān)鍵基因的具體作用

糖皮質(zhì)激素可能是通過改變關(guān)鍵基因的表觀遺傳狀態(tài)從而調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)，最終發(fā)揮在人體內(nèi)抗炎、允許、免疫抑制等作用[13]。為了篩選關(guān)鍵基因，本研究借助Cytohubba插件，選擇了5種適用于人類的測序方法，結(jié)果取交集，得到了8個關(guān)鍵基因：TLR2、TYROBP、IRF8、SNCA、PECAM1、SLC4A1、HCK、CD14，其中SNCA和SLC4A1在SONFH組表達(dá)下調(diào)，其余6個基因皆表達(dá)上調(diào)。TLR2是最為重要的關(guān)鍵基因，已有文獻(xiàn)報道同樣位于細(xì)胞膜上的TLR4在小鼠SONFH模型發(fā)揮重要作用。根據(jù)上述結(jié)果推測，TLR2與TLR1協(xié)同介導(dǎo)的先天免疫反應(yīng)，通過MyD88起作用，然后啟動了股骨頭的破壞程序。通常糖皮質(zhì)激素能夠抑制單核細(xì)胞表達(dá)和釋放CD14（脂多糖），但是本研究結(jié)果顯示CD14在SONFH組表達(dá)上調(diào)，這種現(xiàn)象可能與糖皮質(zhì)激素劑量相關(guān)而產(chǎn)生不同的效應(yīng)[14-15]。高表達(dá)的CD14可參與到TLR2介導(dǎo)的通路中導(dǎo)致核因子κB（nuclear factor κB, NF-κB）激活、細(xì)胞因子分泌和炎癥反應(yīng)[16]。SNCA（α-突觸核蛋白）能參與多巴胺釋放和運(yùn)輸?shù)恼{(diào)節(jié)，可導(dǎo)致caspase-3激活減少并降低神經(jīng)元對各種凋亡刺激的反應(yīng)。TLR2可介導(dǎo)胞外SNCA聚集體的神經(jīng)毒性和促炎效應(yīng)，同時本研究篩選出表達(dá)下調(diào)的SNCA，這將間接導(dǎo)致激活增加，之前已有報道提出caspase-3參與了與ONFH相關(guān)的細(xì)胞凋亡，然而目前這種機(jī)制在骨組織中需要更多的實(shí)驗(yàn)來進(jìn)行驗(yàn)證[17]。HCK（酪氨酸蛋白激酶）是非受體酪氨酸蛋白激酶家族成員，主要表達(dá)于髓系細(xì)胞，在調(diào)節(jié)先天免疫反應(yīng)中起重要作用，包括中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞功能、吞噬作用、細(xì)胞存活和增殖、細(xì)胞黏附和遷移。目前已經(jīng)證實(shí)HCK抑制劑可改善與炎癥相關(guān)的骨破壞，這可能是通過介導(dǎo)NLRP3（結(jié)節(jié)樣受體家族蛋白3）炎性小體的激活來實(shí)現(xiàn)的[18-19]。TYROBP（酪氨酸蛋白激酶結(jié)合蛋白）在關(guān)鍵基因中僅次于TLR2，可與HCK結(jié)合進(jìn)行接下來的一系列反應(yīng)[20]。IRF8（干擾素調(diào)節(jié)因子8）可起到轉(zhuǎn)錄激活劑或阻遏物的作用，對破骨細(xì)胞的形成至關(guān)重要[21]。PECAM1（血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子）是白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移所需的細(xì)胞黏附分子，參與大多數(shù)炎癥反應(yīng)過程[22]。同時PECAM1對先天免疫和獲得性免疫都是必不可少的，使組織能夠?qū)ρ装Y刺激做出適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)，屬于一種保護(hù)性機(jī)制，本課題組推測這是在ONFH發(fā)生過程中的代償性高表達(dá)，在股骨頭缺血時代償性地促進(jìn)新血管的生成。SLC4A1（陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）具有維持正常紅細(xì)胞形狀的功能，也是維持人類腎臟遠(yuǎn)端碳酸氫鹽正常酸堿平衡所必需的，疾病組中SLC4A1下調(diào)導(dǎo)致的腎小管性酸中毒將需要骨骼釋放鈣鹽來緩沖，間接影響股骨頭的骨質(zhì)狀況。

3.3 驗(yàn)證結(jié)果的差異

本研究使用不同濃度DEX處理BMSC，在細(xì)胞水平模擬SONFH發(fā)生過程。然而DEX處理后BMSC中TLR2mRNA的表達(dá)結(jié)果并不令人滿意，不排除技術(shù)原因?qū)е拢黄浯慰赡芘cTLR2在不同樣本類型表達(dá)不同有關(guān)，本課題組之前得出的TLR2表達(dá)上調(diào)的結(jié)果來源于血清樣本，本研究的驗(yàn)證過程則來源于細(xì)胞樣本。結(jié)果中SNCAmRNA表達(dá)與之前分析相反，TLR2可介導(dǎo)胞外SNCA聚集體的神經(jīng)毒性和促炎效應(yīng)。Raffaele等[23]通過動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)小鼠敲除SNCA后，成熟紅細(xì)胞中的活性氧和一氧化氮合酶減少，因此推測SNCA可能在非神經(jīng)組織中具有促進(jìn)氧化應(yīng)激的作用。SLC4A1基因編碼的蛋白又被稱為陰離子交換蛋白1（anion exchanger 1, AE1），在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)方面起重要作用。氧化應(yīng)激會引起AE1結(jié)構(gòu)的變化進(jìn)而影響其轉(zhuǎn)運(yùn)功能，最終引起細(xì)胞損傷，在BMSC中檢測到表達(dá)上調(diào)的SLC4A1可能是代償性反應(yīng)[24]。CD14、HCK和IRF8mRNA表達(dá)明顯上調(diào)，與本研究分析結(jié)果一致。

3.4 優(yōu)點(diǎn)與不足

上述標(biāo)志物可能在SONFH發(fā)生、發(fā)展過程中產(chǎn)生重要作用。本研究通過GEO數(shù)據(jù)庫進(jìn)行深入的生物信息學(xué)分析，并初步進(jìn)行了細(xì)胞水平表達(dá)的驗(yàn)證。本研究在String數(shù)據(jù)庫中應(yīng)用了高可信互相作用網(wǎng)絡(luò)，對各個基因之間的相互作用進(jìn)行了可靠的邏輯學(xué)分析。此外，本研究利用GSEA防止遺漏重要的通路，完善研究中SONFH的發(fā)病機(jī)制。但是，本研究也存在一定的局限性和不足。首先本研究驗(yàn)證這項(xiàng)研究的樣本量偏少，相對缺乏說服力，今后將進(jìn)行大樣本及設(shè)計(jì)更嚴(yán)格的細(xì)胞生物實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步驗(yàn)證。其次本研究進(jìn)行的二次數(shù)據(jù)挖掘沒有實(shí)驗(yàn)組和對照組研究對象的基本特征資料，缺乏糖皮質(zhì)激素劑量、療程等信息。因數(shù)據(jù)庫的更新等原因使得本研究結(jié)果和結(jié)論存在一定的局限性，需進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

TLR2、TYROBP、IRF8、SNCA、PECAM1、SLC4A1、HCK、CD14共8個關(guān)鍵基因是SONFH發(fā)病過程中的潛在標(biāo)志物。同時還發(fā)現(xiàn)脂多糖介導(dǎo)的免疫反應(yīng)在SONFH發(fā)生發(fā)展的過程中發(fā)揮重要作用，CD14、HCK和IRF8可能是介導(dǎo)這一過程的主要標(biāo)志物。本研究揭示了SONFH的可能途徑，對SONFH的早期診斷、潛在治療靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)提供了新的參考。

【利益沖突】所有作者均聲明不存在利益沖突