趙鶴嬌,韓慶兵,商營利

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院 山東省動物生物工程與疫病防治重點實驗室,山東 泰安 271018)

視黃醇結(jié)合蛋白4(retinol binding protein,RBP4)屬于脂質(zhì)運載蛋白家族的成員,于1968年首次被發(fā)現(xiàn)能夠特異性結(jié)合視黃醇[1],是體內(nèi)轉(zhuǎn)運維生素A的主要蛋白,其相對分子質(zhì)量大小為21 kDa[2]。RBP4主要在肝臟中合成和表達[3],在血液中以可結(jié)合形式和游離形式存在。RBP4可以分泌至細胞外,與膜受體TLR4、TLR2[4]和STRA6[5]結(jié)合后激活巨噬細胞、單核細胞和樹突狀細胞等免疫細胞[6],誘導(dǎo)促炎細胞因子產(chǎn)生[7]。作為一種脂肪因子,RBP4已被證實與腫瘤、肥胖和Ⅱ型糖尿病等多種代謝性疾病發(fā)生密切相關(guān)[8-10],而豬RBP4在豬繁殖性能和抑制脂肪細胞分化[11]等代謝方面發(fā)揮重要作用[12]。不僅如此,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)RBP4在免疫代謝的調(diào)節(jié)中起重要作用,與丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)[13]、甲型流感病毒(influenza A virus,IAV)[14]、人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)[15]、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)[16]和血吸蟲[17]介導(dǎo)的疾病進展、炎癥和死亡率密切相關(guān)。多種病原感染機體后能上調(diào)RBP4的水平,研究表明敲低RBP4的表達能夠顯著增加HCV的復(fù)制,利用酵母雙雜交系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)RBP4能夠與戊型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV)衣殼蛋白發(fā)生相互作用[18],而在感染了PRRSV的豬肺臟中以及患有壞死性小腸結(jié)腸炎的早產(chǎn)豬中RBP4都是一個典型上調(diào)的免疫應(yīng)答基因[16]。雖然RBP4在病毒感染和炎癥調(diào)控方面可能發(fā)揮重要作用,但RBP4如何調(diào)控病毒感染以及與對病毒致病性的影響尚不十分清楚。鑒于RBP4是一類分泌型蛋白,因此通過體外表達獲得重組蛋白對研究其功能及作用機制具有重要意義。

A.pET32a-pRBP4表達載體構(gòu)建示意圖;B.豬rbp4基因PCR擴增(M.DL2000 DNA Marker;1.PCR擴增產(chǎn)物);C.pET32a-pRBP4表達載體雙酶切驗證(M.DL5000 DNA Marker;2.重組表達載體經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ內(nèi)切酶消化)

A.考馬斯亮藍染色檢測重組pRBP4融合蛋白的表達;B.免疫印跡鑒定重組pRBP4融合蛋白的表達;M.蛋白Marker;EV.空載體組;S.上清,可溶性蛋白;P.沉淀,包涵體蛋白。下同

A.誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化; B.IPTG誘導(dǎo)劑濃度的優(yōu)化;C.誘導(dǎo)時間的優(yōu)化;D.超聲功率的優(yōu)化(1.功率100 W;2.功率150 W;3.功率200 W)

A.考馬斯亮藍檢測不同濃度咪唑結(jié)合緩沖液對pRBP4可溶性蛋白的純化效果(M.蛋白Marker;T.純化前總蛋白);B.考馬斯亮藍染色檢測以最優(yōu)條件誘導(dǎo)及純化pRBP4可溶性蛋白效果(M.蛋白Marker;EV.空載體組;T.純化前總蛋白)

A.IL-1β;B.TNFα;C.IL-6(CTRL.陰性對照組;LPS.陽性對照組;pRBP4.在PAMs細胞中加入1 mg/L純化的豬RBP4蛋白;Inactive pRBP4.失活蛋白對照組)。ns.無顯著差異;*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001

已有多項研究通過大腸桿菌[19]、畢赤酵母或桿狀病毒系統(tǒng)表達了人[20]、小鼠以及兔[21]重組RBP4蛋白,并證實了RBP4可以直接參與血管內(nèi)皮炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展[22-24],以及引發(fā)脂肪組織炎癥[4],但目前對于豬重組RBP4(pRBP4)的體外研究較少。已有的研究顯示重組pRBP4蛋白在原核表達系統(tǒng)中不易溶[25]且難以確保其生物活性[26]。有學(xué)者通過畢赤酵母系統(tǒng)和pEASY-E1原核載體制備了pRBP4蛋白,但制備過程受到溶解性低、表達量少或成本高等限制因素的影響。因此制備可溶性的、高活性的豬重組RBP4蛋白對于研究其在病毒感染、炎性反應(yīng)和疾病防控中的功能及作用機制具有重要意義。本研究利用大腸桿菌表達系統(tǒng),構(gòu)建了pET32a-pRBP4原核表達載體,實現(xiàn)了pRBP4蛋白的可溶性表達,通過優(yōu)化表達和純化條件獲得了具有良好生物學(xué)活性的重組蛋白,為RBP4的功能研究提供了有利工具。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與抗體pET-32a質(zhì)粒、BL21(DE3)菌株、DH5α菌株由本實驗室保存;LPS、青鏈霉素混合液購自Thermo Fisher公司;PBS購于Biological Industries公司;RPMI 1640 培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司;His-tag鼠單克隆抗體(貨號:66005-1-1g)購于Proteintech公司;辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;PrimeSTAR HS DNA Polymerase、限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、反轉(zhuǎn)錄酶 M-MLV (RNase H-)、RRI、DNA Marker、Premixed Protein Marker等均購自寶生物工程(大連)有限公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒、透析袋、PEG8000購于索萊寶生物科技有限公司;總RNA提取試劑盒購自普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司;DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購于天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 載體構(gòu)建根據(jù)豬rbp4基因mRNA序列 (NM_214057.1),設(shè)計擴增引物,分別在上、下游引入BamHⅠ、XhoⅠ酶切位點。序列如下,prbp4-F:CGGGATCCATGGAATGGGTTTGGGCGC;pr-bp4-R:CCGCTCGAGCTACAAAATGTTTCTTT-CCG。使用PrimeSTAR高保真酶以豬腎細胞(PK-15)的cDNA為模板擴增prbp4基因片段,長度為606 bp。反應(yīng)體系按照說明書進行,反應(yīng)程序為98℃ 10 s變性,56℃ 5 s退火,72℃ 45 s延伸,35個循環(huán);4℃ 20 min。PCR產(chǎn)物以0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測,DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段,與pET-32a載體連接。陽性克隆質(zhì)粒經(jīng)雙酶切驗證后,由上海生工公司進行測序。

1.3 重組蛋白表達與提取將序列比對正確的陽性質(zhì)粒pRBP4-pET32a及空載體pET-32a分別轉(zhuǎn)化到BL21(DE3) 感受態(tài)細胞中,挑取單克隆,在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h。隨后按照1∶100的比例將菌液接種至新鮮LB液體培養(yǎng)基中,置于37℃搖床培養(yǎng)至對數(shù)生長中期。加入1.0 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)劑,16℃ 150 r/min振搖過夜,4℃離心收集菌體沉淀后稱重,以1 g/20 mL比例加入預(yù)冷的超聲緩沖液(1 mol/L Tris,5 mol/L NaCl,1‰ Triton-X100,pH=7.5)重懸。使用超聲破碎儀(新芝生物)以150 W功率,運行5 s停止5 s,在冰水浴中超聲30 min。4℃離心分別收集上清(可溶性蛋白)和沉淀(包涵體蛋白),并以相同比例1 g/20 mL用超聲緩沖液重懸包涵體沉淀,通過考馬斯亮藍染色和免疫印跡鑒定蛋白表達情況。

1.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)與考馬斯亮藍染色配制10% 聚丙烯酰胺凝膠,將蛋白溶液與6×SDS loading按照5∶1的比例混勻,金屬浴100℃煮沸10 min,取15 μL蛋白樣品進行SDS-PAGE。電泳結(jié)束將分離膠浸入考馬斯亮藍R-250染色液(10%冰醋酸、25%異丙醇、1‰R-250)中,搖床孵育染色5 h后更換脫色液(10%冰醋酸、30%甲醇),重復(fù)換液直至脫色液不再變藍。

1.5 免疫印跡取蛋白樣品進行10%的SDS-PAGE,將蛋白質(zhì)由凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜,5%脫脂奶粉室溫封閉,4℃過夜孵育His-tag鼠單克隆抗體,山羊抗小鼠二抗室溫孵育后顯影拍照。

1.6 蛋白純化與濃縮將超聲提取的可溶性蛋白液用0.45 μm濾器過濾去除大顆粒雜質(zhì),利用AKTA蛋白純化系統(tǒng)和HisTrap層析柱(GE Healthcare)純化pRBP4蛋白。分別用含有60,80,100 mmol/L咪唑的洗滌緩沖液(50 mmol/L Na2HPO4、0.3 mol/L NaCl)平衡層析柱,待紫外吸收峰穩(wěn)定后,將蛋白溶液分批上機,吸附于層析柱上。待紫外吸收值趨于穩(wěn)定,用洗脫緩沖液(50 mmol/L Na2HPO4、0.3 mol/L NaCl、500 mmol/L 咪唑)剝離pRBP4蛋白,分別收集蛋白樣品進行SDS-PAGE,通過考馬斯亮藍染色分析最佳去除雜蛋白的咪唑濃度。根據(jù)pRBP4融合蛋白大小選擇截留相對分子質(zhì)量8～14 kDa的透析袋,按照說明書預(yù)處理透析袋。將純化的蛋白溶液加入至透析袋中,根據(jù)蛋白溶液體積以1∶100的比例在燒杯中加入1×PBS無菌透析液,在透析后4,8,12 h更換透析液。隨后在透析袋表面孵育PEG8000進行濃縮,用BCA試劑盒測定最終蛋白濃度,加入30%甘油分裝儲存于-80℃。

1.7 細胞培養(yǎng)豬原代肺泡巨噬細胞(porcine alveolar macrophages,PAMs)分離參考此前的方法進行[27],以含1%青鏈霉素、10% 胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。PAMs細胞以0.7×106細胞/mL接種于12孔板中,分別加入PBS、LPS、pRBP4蛋白以及100℃煮沸后的pRBP4蛋白,與細胞共孵育6 h后收集細胞。

1.8 細胞總RNA提取與熒光定量(qPCR)分析根據(jù)說明書的步驟,使用總RNA提取試劑盒提取細胞總RNA(Promega)。使用反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV、隨機引物和oligo(dT)20對提取的RNA進行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,稀釋至5 mg/L,以此作為模板取10 ng進行熒光定量分析。使用2×RealSTAR Green Fast Mixture (GenStar) 通過ABI Step One (Applied Biosystems,USA) 熒光定量儀器對cDNA進行qPCR測定分析。PAMs細胞GAPDH基因用作內(nèi)參對照,用于qPCR測定的特異性引物序列顯示在表1中,每個樣品進行3次生物學(xué)重復(fù)試驗,通過2-ΔΔCt方法分析數(shù)據(jù)。

表1 qPCR引物序列

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析試驗數(shù)據(jù)均進行3次獨立重復(fù),P值通過Prism GraphPad(v8.0)軟件中配對樣品t檢驗或未配對樣品t檢驗計算,P<0.05被認為具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 豬RBP4原核表達載體的構(gòu)建為了構(gòu)建原核表達載體,利用設(shè)計的特異性引物,以PK-15細胞的cDNA為模板,特異性擴增prbp4基因,與pET-32a載體經(jīng)內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ線性化后,使用T4連接酶連接(圖 1A)。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測,出現(xiàn)1條約606 bp的基因片段,大小與預(yù)期一致(圖1B)。陽性質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后,產(chǎn)生目的片段和線性化載體(圖1C),且測序比對正確,表明pET32a-pRBP4表達載體構(gòu)建成功。

2.2 豬重組RBP4融合蛋白表達鑒定為了驗證pRBP4蛋白表達情況,將原核表達載體轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)表達菌中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達后超聲破碎提取蛋白,經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳后通過考馬斯亮藍染色和免疫印跡檢測可溶性蛋白和包涵體蛋白表達情況。考馬斯亮藍染色可見在41.2 kDa處有明顯條帶,與預(yù)期大小相符,pRBP4蛋白雖然大量存在于包涵體中,但也能夠形成可溶性蛋白(圖 2A)。將上清經(jīng)40 mmol/L咪唑濃度的洗滌緩沖液純化后,1 g菌可以獲得0.066 mg蛋白。目的蛋白用His-tag鼠單克隆抗體進行免疫印跡,可在約41.2 kDa處檢測到單一條帶(圖 2B),以上結(jié)果表明重組pRBP4融合蛋白表達成功。

2.3 豬重組RBP4可溶性蛋白表達條件優(yōu)化為了增加可溶性蛋白表達量,對誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時間、誘導(dǎo)溫度以及超聲破碎功率等方面對重組蛋白的表達條件進行全面優(yōu)化,以期獲得大量高活性的可溶性重組pRBP4蛋白。將生長至對數(shù)期的菌液設(shè)置于不同條件下誘導(dǎo)表達后(表2),收集菌體后進行超聲裂解,提取上清和沉淀中的總蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳,考馬斯亮藍染色檢測重組蛋白表達情況。為了確定最佳誘導(dǎo)溫度,在將菌液放置在不同溫度下誘導(dǎo)表達,結(jié)果顯示在16℃下誘導(dǎo)表達上清中可溶性蛋白表達量最高(表2A組,圖3A)。為進一步確定最適誘導(dǎo)劑濃度,16℃條件下在菌液中加入不同濃度的IPTG進行誘導(dǎo)表達,結(jié)果表明0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)的條件下可獲得最高的可溶性蛋白表達量,同時包涵體蛋白含量有所降低(表2B組,圖3B)。在16℃和0.5 mmol/L IPTG條件下誘導(dǎo)表達不同時間,發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)表達 12 h時,上清中可溶性蛋白含量最多(表2C組,圖3C)。同時檢測了不同超聲功率對菌液裂解和蛋白提取情況的影響,發(fā)現(xiàn)150 W功率條件下可以獲取更多的可溶性蛋白(表2D組,圖3D)。以上結(jié)果表明,重組pRBP4最佳表達條件為16℃、0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達12 h,重組蛋白提取最佳超聲功率為150 W。

表2 重組pRBP4不同誘導(dǎo)表達條件的優(yōu)化

2.4 可溶性豬重組RBP4融合蛋白純化利用AK-TA蛋白純化系統(tǒng)以1 mL HisTrap HP層析柱純化可溶性pRBP4蛋白,為了確定去除雜蛋白的最佳咪唑濃度,分別用含有不同濃度咪唑的緩沖液洗滌蛋白?？捡R斯亮藍染色可見純化后在41.2 kDa處有1條明顯且單一的目的條帶,相比于60 mmol/L緩沖液純化的效果,80和100 mmol/L緩沖液純化后的蛋白純度沒有顯著提升,且蛋白含量有所下降(圖4A)。表明以60 mmol/L咪唑的洗滌緩沖液純化蛋白能在保證蛋白純度的情況下最大量地回收到pRBP4蛋白。為了避免高濃度咪唑?qū)Φ鞍谆钚约昂罄m(xù)細胞試驗的影響,對純化的蛋白溶液進行透析,將高濃度咪唑置換為PBS,濃縮后進行考馬斯亮藍染色,結(jié)果顯示獲得了單一純凈的重組pRBP4可溶性蛋白(圖4B)。經(jīng)過蛋白濃度測定,1 g菌最終獲得0.42 mg蛋白,相比于優(yōu)化條件前,所獲蛋白量提升了5.4倍。

2.5 豬重組RBP4可溶性蛋白的生物活性鑒定為了驗證純化后pRBP4蛋白的生物學(xué)活性,檢測了重組pRBP4蛋白是否能夠誘導(dǎo)炎癥細胞因子的產(chǎn)生。在PAMs細胞中加入pRBP4蛋白,以LPS做陽性對照,PBS做陰性對照,通過qPCR檢測炎癥細胞因子mRNA表達水平。同時,為了排除蛋白表達過程中產(chǎn)生的內(nèi)毒素影響,以100℃煮沸后的重組pRBP4蛋白溶液作對照。結(jié)果顯示純化的重組pRBP4可溶性蛋白可以顯著誘導(dǎo)炎癥因子IL-1β、TNFα以及IL-6的表達(圖5)。表明該研究獲得的豬重組RBP4可溶性蛋白可以有效增加巨噬細胞中促炎細胞因子的分泌,具有良好的生物學(xué)活性。

3 討論

體內(nèi)研究表明RBP4在生殖發(fā)育、慢性炎癥以及病毒感染等過程中具有重要作用[16,28],但其體外功能研究較少。有研究通過畢赤酵母分泌表達獲得了重組pRBP4蛋白[29],但表達量較低;隨后通過原核表達載體pEASY-E1成功表達了重組pRBP4蛋白[25],但以包涵體形式存在。由于包涵體重組蛋白在復(fù)性、重折疊和純化過程較為復(fù)雜,因此限制了pRBP4的制備。本研究通過摸索和優(yōu)化表達條件,成功實現(xiàn)了pRBP4蛋白的可溶性原核表達,且獲得的重組蛋白具有良好的生物活性,為進一步研究RBP4在體內(nèi)外的功能和制備pRBP4抗體奠定了良好基礎(chǔ)。

蛋白表達載體及系統(tǒng)是影響蛋白表達形式的關(guān)鍵因素之一,不同的載體表達相同蛋白會產(chǎn)生不同的效果。原核表達載體具有快速、簡便、成本低等優(yōu)點,但表達的重組蛋白常以無活性的包涵體形式存在[30]。研究發(fā)現(xiàn)不同原核表達載體表達融合蛋白的活性不同,且蛋白在溶解性和生物學(xué)活性方面存在明顯差異[31]。例如,以原核表達載體pET-28a[19]、pET-19b[32]等大腸桿菌[33-34]中表達人源RBP4,重組蛋白均以包涵體形式存在。在pRBP4表達過程中,研究使用了不同原核表達載體表達pRBP4蛋白,發(fā)現(xiàn)pET-30a-pRBP4重組載體中不能表達目的蛋白,在PGEX-6P-1-pRBP4重組載體表達的蛋白以包涵體形式存在。為了實現(xiàn)pRBP4的可溶性表達,最終選擇了含有硫氧還蛋白 (TrxA) 標(biāo)簽的pET-32a作為載體表達目的蛋白。TrxA作為一種分子伴侶,可通過與目標(biāo)蛋白共表達來幫助蛋白正確折疊,增加目的蛋白的水溶性,有利于蛋白的可溶性表達以及大量制備和蛋白純化[35]。雖然本研究成功實現(xiàn)了pRBP4的部分可溶性表達,但仍有大部分重組蛋白形成包涵體,這可能是由于初始誘導(dǎo)條件使得早期大部分肽鏈合成過快,超過折疊形成正確構(gòu)型的速度,僅有小部分肽鏈正確折疊形成可溶性蛋白分泌至上清中[36]。另外,RBP4本身的結(jié)構(gòu)特性可能也會影響其蛋白表達形式,造成極易形成包涵體,目前已有學(xué)者利用生物信息分析對蛋白突變進行設(shè)計以改變其結(jié)構(gòu)和活性特征,并實現(xiàn)了高活性、穩(wěn)定可溶性蛋白的表達[37]。因此我們進一步通過降低誘導(dǎo)溫度、增加誘導(dǎo)時間、優(yōu)化IPTG濃度和超聲功率,提升了上清中可溶性蛋白的表達量。本研究發(fā)現(xiàn)隨著溫度逐漸降低,可溶性蛋白含量升高,表明在低溫條件下可以誘導(dǎo)產(chǎn)生更多的可溶性pRBP4蛋白。因為低溫能有效防止菌體厭氧生長,抑制乙酸生成對蛋白表達的影響[37]。除此之外,在菌體超聲破碎時的功率也會影響pRBP4可溶性蛋白的含量,這可能是由于不同的超聲功率影響了聲強、聲壓進而對細菌壁的破碎程度不同,釋放蛋白含量不同[38]。減緩培養(yǎng)速度以及優(yōu)化IPTG濃度等這些處理均可以有效降低蛋白合成速度,避免了蛋白合成過快導(dǎo)致其不能正確折疊[39]。

重組原核蛋白的活性對后續(xù)的功能研究至關(guān)重要。研究表明RBP4與TLR2、TLR4等受體結(jié)合,激活JNK和NF-κB信號炎癥因子表達和釋放[4]。因此,RBP4對細胞炎癥因子的表達水平可反映其生物學(xué)活性。此前純化的人源重組RBP4蛋白[40]在終質(zhì)量濃度為25～100 mg/L可以顯著誘導(dǎo)原代人視網(wǎng)膜毛細血管內(nèi)皮細胞[32]以及鼠原代骨髓巨噬細胞中IL-1β、TNFα、IL-6等炎癥因子表達[4,41],而本研究獲得的可溶性pRBP4蛋白,在終質(zhì)量濃度為1 mg/L情況下即能夠誘導(dǎo)PAMs中表達相同或更高倍數(shù)的炎癥因子,表明該方法能夠獲得具有較高活性的重組pRBP4蛋白。本研究獲得的可溶性重組蛋白,避免了包涵體蛋白在復(fù)性過程中對蛋白天然構(gòu)象和活性可能產(chǎn)生的不利影響[42],使其更接近天然蛋白?？傊?本研究利用原核表達系統(tǒng)通過優(yōu)化表達條件成功制備了大量可溶性的、高活性的豬重組RBP4融合蛋白,為進一步研究RBP4在豬疾病中的功能奠定了基礎(chǔ)。