[摘" "要]" "目的：探討珠蛋白轉(zhuǎn)錄因子1（globin transcription factor 1，GATA 1）和B細(xì)胞淋巴瘤因子（B-cell leukemia/lymphoma xL，BCL-xL）在骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndromes，MDS）患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)以及Notch信號(hào)通路相關(guān)機(jī)制。方法：以36例MDS患者為MDS組，20例定期獻(xiàn)血的健康人為對(duì)照組。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞中GATA 1、BCL-xL、Notch 1及其下游分子HES 1和Herp 2的表達(dá)，分析GATA 1和BCL-xL的表達(dá)與MDS患者血小板計(jì)數(shù)和血紅蛋白的相關(guān)性，采用流式細(xì)胞術(shù)分析外周血單個(gè)核細(xì)胞的凋亡。結(jié)果：與對(duì)照組比較，MDS患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中GATA 1和BCL-xL mRNA表達(dá)量明顯降低（Plt;0.05），而Notch 1、HES 1、Herp 2 mRNA表達(dá)量顯著增加（Plt;0.05）。GATA 1 mRNA表達(dá)水平與MDS患者血小板計(jì)數(shù)呈正相關(guān)（r=0.7575，P=0.0181）。與對(duì)照組比較，凋亡細(xì)胞比例增高（Plt;0.01）。結(jié)論：MDS患者GATA 1和BCL-xL mRNA表達(dá)下降，Notch信號(hào)通路下游因子HES 1和Herp 2增高，可能是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡顯著增加的原因。

[關(guān)鍵詞]" "骨髓增生異常綜合征；珠蛋白轉(zhuǎn)錄因子1；B細(xì)胞淋巴瘤因子；Notch信號(hào)通路；凋亡

[中圖分類(lèi)號(hào)]" "R551.3 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]" "A [DOI]" "10.19767/j.cnki.32-1412.2024.04.001

Study on the expression of GATA1 and BCL-xL in peripheral blood cells of patients with myelodysplastic syndrome

MA Sifei， YANG Hongmei

（Changzhou Central Blood Bank， Blood Transfusion Laboratory， Jiangsu 213003）

[Abstract]" "Objective： To investigate the expression of globin transcription factor 1" （GATA 1） and B-cell leukemia/lymphoma xL （BCL-xL） in peripheral blood cells of patients with myelodysplastic syndromes （MDS） and explore the mechanism related to Notch signaling pathway. Methods： A total of 36 MDS patients were selected as the MDS group and 20 healthy people who donated blood regularly were selected as the control group. Real-time fluorescence quantitative PCR was used to detect the expression of GATA 1， BCL-xL， neurogenic gene Notch homologous protein 1（Notch 1） and its downstream molecules" HES 1 and Herp 2 in peripheral blood cells. The correlation between the expression of GATA 1， BCL-xL and platelet count， hemoglobin in MDS patients was analyzed. The apoptosis of peripheral blood cells was observed by flow cytometry. Results： Compared with the control group， the mRNA levels of GATA 1 and BCL-xL were significantly decreased in peripheral blood of MDS patients（Plt;0.05），while the mRNA levels of Notch 1， HES 1 and Herp 2 were significantly increased（Plt;0.05）. Moreover， the expression of GATA 1 mRNA was positively correlated with the platelet count in MDS patients（r=0.7575，P=0.0181）. Compared with the control group， the apoptotic cells increased in the MDS group（Plt;0.01）. Conclusion： The expression of GATA 1 and BCL-xL decreased， and the expression of Notch 1， HES 1 and Herp 2 increased in MDS patients， which may be the cause of significant increase in cell apoptosis.

[Key words]" "myelodysplastic syndromes; globin transcription factor 1; B-cell leukemia/lymphoma xL; Notch signaling pathway; apoptosis

* [基金項(xiàng)目] 常州市中心血站課題（xz202402）。

** [作者簡(jiǎn)介] 馬思飛，女，漢族，黑龍江齊齊哈爾人，生于1994年3月，碩士，主管技師。研究方向：輸血免疫學(xué)。" "通信作者：楊紅梅，E-mail：yhmei83@126.com

骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndro-

mes，MDS）是高度異質(zhì)性的骨髓惡性腫瘤，臨床上以外周血細(xì)胞減少和造血功能障礙為特征，約30%患者會(huì)發(fā)展為急性髓系白血病，其病理機(jī)制是由于祖細(xì)胞凋亡增加以及成熟缺陷所致[1]。血小板減少是MDS患者較常見(jiàn)的臨床表現(xiàn)，5%～10%患者以血小板減少為首診癥狀，嚴(yán)重患者常需要輸注紅細(xì)胞或血小板支持性治療[2]。

珠蛋白轉(zhuǎn)錄因子1（globin transcription factor 1，GATA 1）屬于鋅指轉(zhuǎn)錄因子家族，調(diào)控紅系前體細(xì)胞的存活、增殖和終末分化，是紅系基因表達(dá)的中心介質(zhì)[3]。GATA 1基因位于X染色體p11.23，主要表達(dá)于紅細(xì)胞和巨核細(xì)胞，在其他細(xì)胞中也有少量表達(dá)（如肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等）[3-4]，在MDS紅細(xì)胞生成分化過(guò)程中GATA 1表達(dá)異常。B細(xì)胞淋巴瘤因子（B-cell leukemia/lymphoma xL，BCL-xL）屬于細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)蛋白BCL-2家族[5]，常作為GATA 1的合作者存在。

Notch信號(hào)通路在造血、惡性轉(zhuǎn)化和白血病發(fā)生過(guò)程以及在細(xì)胞命運(yùn)決定和器官發(fā)生中起著重要作用，其配體分子在MDS中呈現(xiàn)高表達(dá)[5]，其下游因子HES 1和Herp 2通過(guò)某些物理構(gòu)象[6]以及化學(xué)解離作用[7]抑制GATA 1表達(dá)，從而破壞紅細(xì)胞分化和紅系未成熟前體細(xì)胞的存續(xù)。此外，Notch 1信號(hào)通路還可下調(diào)BCL-xL，損害紅系及巨核細(xì)胞祖細(xì)胞的凋亡耐受性，加劇異常凋亡[8]。本研究探討GATA 1、BCL-xL在MDS患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)及其與Notch信號(hào)通路相關(guān)機(jī)制。

1" "資料與方法

1.1" "一般資料" "收集2022年1月—2023年9月送至本中心交叉配血的36例MDS患者外周靜脈血標(biāo)本（MDS組），其中男性18例，女性18例；年齡32～84歲，中位年齡68歲。MDS診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《骨髓增生異常綜合征診斷與治療中國(guó)專(zhuān)家共識(shí)（2014版）》[9-10]，均為初診MDS，尚未接受相關(guān)治療。另收集同期20例定期獻(xiàn)血的健康人外周靜脈血標(biāo)本作為對(duì)照組，其中男性10例，女性10例；年齡45～55歲，中位年齡52歲。兩組性別、年齡的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）。

1.2" "實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1" "外周血細(xì)胞RNA提取和cDNA反轉(zhuǎn)錄：Ficoll淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，利用超微量分光光度計(jì)測(cè)量RNA濃度和純度。采用一步法反轉(zhuǎn)定量試劑盒去除基因組DNA后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行后續(xù)定量PCR實(shí)驗(yàn)。

1.2.2" "實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）：GATA 1、BCL-xL、Notch 1、HES 1、Herp 2和GAPAH引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，見(jiàn)表1。使用qPCR試劑盒，反應(yīng)體系為20 μL，每個(gè)樣品重復(fù)至少2次。GATA 1、BCL-xL、Notch 1、HES 1和Herp 2 mRNA表達(dá)量以GAPDH作為內(nèi)參基因，用2-ΔΔCt表示目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3" "流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡：生理鹽水重懸單個(gè)核細(xì)胞，300 g離心5 min，棄上清，加入500 μL 1×Annexin V Binding Buffer工作液重懸細(xì)胞，再加入5 μL Annexin V- FITC染色液和5 μL PI染色液。輕柔混勻，避光孵育15min，1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3" "統(tǒng)計(jì)學(xué)處理" "使用STAT View 5.01統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用方差分析；采用Spearman秩相關(guān)分析法分析GATA 1、BCL-xL mRNA表達(dá)與患者血小板計(jì)數(shù)、血紅蛋白的關(guān)系。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2" "結(jié)" " " 果

2.1" "兩組外周血單個(gè)核細(xì)胞GATA 1、BCL-xL mRNA表達(dá)比較" "與對(duì)照組比較，MDS組外周血單個(gè)核細(xì)胞中GATA 1、BCL-xL mRNA表達(dá)量分別為0.721±0.078和0.478±0.062，低于對(duì)照組的1.003±0.060和1.017±0.140（Plt;0.05）。見(jiàn)圖1。

2.2" "GATA 1、BCLxl表達(dá)量與MDS患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性" "MDS患者血小板計(jì)數(shù)為（107.1±38.12）×109/L，血紅蛋白為（62.33±3.460）g/L。Spearman相關(guān)分析顯示，GATA 1 mRNA表達(dá)水平與患者血小板計(jì)數(shù)正相關(guān)（r=0.7575，P=0.0181），與血紅蛋白水平無(wú)關(guān)（r=-0.1681，P=0.6656）；BCL-xL mRNA表達(dá)水平與患者血小板計(jì)數(shù)（r=-0.1709，P=0.6603）及血紅蛋白水平（r=0.2223，P=0.5654）無(wú)關(guān)。見(jiàn)圖2A～D。

2.3" "兩組外周血單個(gè)核細(xì)胞Notch 1、HES 1、Herp 2 mRNA表達(dá)比較" "為了研究在MDS中是否發(fā)生Notch信號(hào)通路異常活化，我們檢測(cè)兩組外周血單個(gè)核細(xì)胞Notch通路元件的主要受體Notch 1以及兩種下游效應(yīng)物HES 1和Herp 2的mRNA表達(dá)。與對(duì)照組比較，MDS組外周血單個(gè)核細(xì)胞中Notch 1、HES 1、Herp 2 mRNA表達(dá)量分別為1.888±0.135、1.639±0.153和1.370±0.120，高于對(duì)照組的1.007±0.086、1.008±0.088和1.003±0.051（Plt;0.05或Plt;0.01），提示在MDS疾病進(jìn)程中存在Notch信號(hào)通路顯著活化。見(jiàn)圖3。

2.4" "兩組單個(gè)核細(xì)胞凋亡比較" "在流式細(xì)胞儀散點(diǎn)圖上，左下象限為活細(xì)胞（Annexin V-FITC-/PI-），右下象限為早期凋亡細(xì)胞（Annexin V-FITC+/PI-），左上象限為細(xì)胞碎片（Annexin V-FITC-/PI+），右上象限為晚期凋亡或壞死細(xì)胞（Annexin V-FITC+/PI+）。與對(duì)照組相比，MDS組活細(xì)胞比例降低，凋亡細(xì)胞比例增高（Plt;0.01）。見(jiàn)圖4A～D。

3" "討" " " 論

MDS是一種造血干細(xì)胞疾病，表現(xiàn)為外周血一系或一系以上細(xì)胞減少，骨髓增生亢進(jìn)，病態(tài)造血，細(xì)胞凋亡和增殖異常同時(shí)存在[11]?；虍惓?、表觀遺傳學(xué)異常、造血微環(huán)境改變以及免疫機(jī)制缺陷等在MDS發(fā)病中均起著重要作用[12-13]。有研究發(fā)現(xiàn)，骨髓CD34+細(xì)胞過(guò)度凋亡是MDS主要特征[5]。

GATA 1是紅系分化的關(guān)鍵基因，其表達(dá)水平的變化可引起下游基因表達(dá)調(diào)控的異常，引發(fā)不同的臨床疾病[3，14]。國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)GATA 1（-/-）會(huì)導(dǎo)致紅系祖細(xì)胞發(fā)育遲緩甚至大量凋亡，其中雄性模型小鼠胚胎因嚴(yán)重貧血于E10.5～11.5天死亡[15]。另有研究發(fā)現(xiàn)，GATA 1敲除的成年小鼠出現(xiàn)再障危象[16]，證實(shí)GATA 1異常表達(dá)會(huì)加速細(xì)胞凋亡而誘發(fā)嚴(yán)重貧血。GATA 1聯(lián)合促紅細(xì)胞生成素調(diào)控凋亡抑制基因BCL-xL的表達(dá)，從而保證細(xì)胞穩(wěn)定發(fā)育。BCL-xL參與正常紅細(xì)胞生成，降低對(duì)細(xì)胞死亡信號(hào)的易感性，促進(jìn)成紅細(xì)胞的存活[17-18]。有研究證實(shí)，在正常紅細(xì)胞分化后期，GATA 1和BCL-xL mRNA表達(dá)穩(wěn)步上調(diào)，而在MDS紅細(xì)胞生成過(guò)程中GATA 1和BCL-xL上調(diào)缺失[5]。本研究結(jié)果顯示，MDS患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中GATA 1和BCL-xL mRNA表達(dá)顯著降低，GATA1 mRNA表達(dá)水平與患者血小板計(jì)數(shù)呈正相關(guān)，細(xì)胞凋亡率增高，與相關(guān)研究結(jié)果一致。

Notch信號(hào)通路參與多種疾病進(jìn)程，有研究證實(shí)在MDS發(fā)生發(fā)展中，Notch配體DLK 1異常高表達(dá)，其下游效應(yīng)分子HES 1和Herp 2通過(guò)識(shí)別MDS靶基因順勢(shì)調(diào)控區(qū)的特定結(jié)合位點(diǎn)而對(duì)某些基因發(fā)揮抑制作用。其中Herp 2可通過(guò)直接物理作用抑制GATA 1，導(dǎo)致紅系分化受損和紅系前體細(xì)胞不成熟；HES 1通過(guò)解離必需因子p300與GATA1來(lái)抑制紅細(xì)胞生成[5]。此外，Notch1信號(hào)傳導(dǎo)可下調(diào)BCL-xL，損害紅系/巨核細(xì)胞祖細(xì)胞[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，MDS患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中Notch信號(hào)通路受體Notch 1以及下游分子HES 1和Herp 2 mRNA水平顯著升高，提示Notch信號(hào)通路活化參與MDS疾病進(jìn)程。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)MDS患者GATA 1和BCL-xL mRNA表達(dá)水平下降，Notch信號(hào)通路下游因子HES 1和Herp 2活化，可能是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡顯著增加的原因。

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[收稿日期] 2024-07-14

（本文編輯" "繆宏建）