王玉榮，侯強(qiáng)川，田龍新，劉菊珍，周加平，郭 壯,

（1.湖北文理學(xué)院 湖北省食品配料工程技術(shù)研究中心，湖北 襄陽(yáng) 441053；2.襄陽(yáng)市醬香型白酒固態(tài)發(fā)酵企校聯(lián)合創(chuàng)新中心，湖北 襄陽(yáng) 441053；3.醬香型白酒固態(tài)發(fā)酵襄陽(yáng)市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 襄陽(yáng) 441614）

白酒作為我國(guó)一款傳統(tǒng)的酒精飲品，不僅歷史悠久，還因其以酯類(lèi)為主體的復(fù)合香味而深受各族人民的喜愛(ài)[1-2]。中國(guó)白酒最早確立的香型有清香型、醬香型、濃香型和鳳香型，隨著研究的深入，白酒香型已經(jīng)擴(kuò)展至12 種[3]。相較于其他香型，醬香型白酒具有醬香細(xì)膩、醇厚柔和、酒體豐滿(mǎn)和空杯留香持久等特點(diǎn)[4]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，白酒作為一種微生物發(fā)酵制品，酒曲不僅為其發(fā)酵過(guò)程提供了豐富的微生物和酶類(lèi)物質(zhì)[5]，并直接或間接地影響著酒體的品質(zhì)[6-7]。因此，在我國(guó)也有“曲為酒之骨”的說(shuō)法。

根據(jù)生產(chǎn)原料差異大致可將酒曲分為麥曲、大曲和小曲等類(lèi)型，而根據(jù)發(fā)酵工藝又可分為高溫曲、中高溫曲和中溫曲等。傳統(tǒng)酒曲的制作環(huán)境較為開(kāi)放，容易受到制作環(huán)境和原料的影響，導(dǎo)致各曲樣間存在較大差異[8-9]。科研人員針對(duì)酒曲展開(kāi)了大量卓有成效的研究，Hou Qiangchuan等[10]發(fā)現(xiàn)不同類(lèi)型酒曲中微生物群落結(jié)構(gòu)和功能之間存在明顯的差異；Wang Yurong等[11]進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)不同類(lèi)型高溫大曲顯著影響著醬香型白酒的發(fā)酵過(guò)程，如黑色高溫大曲中主要以Thermoactinomyces和Staphylococcus為主，其不僅可以分泌淀粉酶、酯酶和纖維素酶等，還能產(chǎn)生具有醬香風(fēng)味的吡嗪類(lèi)物質(zhì)和其他風(fēng)味物質(zhì)，對(duì)于醬香型白酒的風(fēng)味品質(zhì)具有重要的意義。同時(shí)，相關(guān)研究證實(shí)芽孢桿菌在白酒的發(fā)酵過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，其不僅具有多種酶，可以在發(fā)酵過(guò)程中分解一些復(fù)雜的底物，釋放營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)促進(jìn)酵母和其他微生物的生長(zhǎng)和代謝，部分芽孢桿菌還會(huì)產(chǎn)生一些特殊風(fēng)味的化合物，影響白酒的最終風(fēng)味。茅臺(tái)鎮(zhèn)作為我國(guó)“醬酒圣地”，域內(nèi)白酒業(yè)興盛，這也使得本研究能較好地解析該地區(qū)高溫曲中微生物的結(jié)構(gòu)差異，并探究在發(fā)酵過(guò)程中的積極作用。

酒曲的研究是一個(gè)逐步發(fā)展的過(guò)程，科研人員最初采用純培養(yǎng)技術(shù)對(duì)酒曲中的細(xì)菌和真菌進(jìn)行分離鑒定，初步探討了酒曲中微生物的構(gòu)成和多樣性[12]。純培養(yǎng)技術(shù)具有自身的局限性，不能準(zhǔn)確分析酒曲樣本中微生物的構(gòu)成[13]，但仍可以通過(guò)使用選擇性培養(yǎng)基實(shí)現(xiàn)對(duì)酒曲中目標(biāo)微生物的分離和鑒定，為后續(xù)優(yōu)良菌株的篩選奠定基礎(chǔ)。隨著高通量測(cè)序和生物信息學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，高通量測(cè)序被廣泛應(yīng)用于傳統(tǒng)發(fā)酵食品中[14-16]。值得注意的是，受限于擴(kuò)增偏好和測(cè)序片段長(zhǎng)度，該方法在解析物種構(gòu)成和豐度上存在一定誤差，無(wú)法充分挖掘樣本中的微生物信息。近年來(lái)，隨著測(cè)序成本的快速下降，越來(lái)越多的科研人員采用宏基因組測(cè)序技術(shù)挖掘樣本中的微生物信息[17]，而通過(guò)加大測(cè)序深度（超高深宏基因組測(cè)序）不僅可以獲得更加準(zhǔn)確的物種鑒定和分類(lèi)結(jié)果，還可以利用Binning技術(shù)獲得更加完整的基因組，并發(fā)現(xiàn)更多的低豐度物種，為解析生態(tài)中微生物的構(gòu)成、多樣性和功能提供有利的手段。高溫大曲中的微生物結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，因此，通過(guò)超高深宏基因組測(cè)序技術(shù)解析其微生物多樣性十分必要。

本研究以茅臺(tái)鎮(zhèn)兩個(gè)酒廠(chǎng)的6 份高溫大曲為研究對(duì)象，分別采用純培養(yǎng)技術(shù)和超高深宏基因組測(cè)序技術(shù)對(duì)高溫大曲中可培養(yǎng)微生物和微生物群落結(jié)構(gòu)及功能進(jìn)行分析，通過(guò)對(duì)比茅臺(tái)鎮(zhèn)不同酒廠(chǎng)高溫大曲中微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的差異，以期為提升高溫大曲的品質(zhì)提供必要的數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高溫大曲樣本均采集自貴州省遵義市仁懷市茅臺(tái)鎮(zhèn)，從A酒廠(chǎng)和B酒廠(chǎng)各采集3 份成品高溫大曲樣本，均生產(chǎn)自2022年6月21號(hào)，編號(hào)分別為A1～A3和B1～B3。兩酒廠(chǎng)高溫酒曲的制作工藝除曲母添加量存在差異外（A酒廠(chǎng)的曲母添加量為4.5%～8.0%，B酒廠(chǎng)的曲母添加量為6.0%～8.0%），其他工藝基本一致。

DNeasy mericon Food Kit DNA基因組提取試劑盒 德國(guó)QIAGEN公司；蛋白胨 北京陸橋技術(shù)股份有限公司；牛肉膏 南京全隆生物技術(shù)有限公司；氯化鈉、氫氧化鈉 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；5×TransStartTMFastPfu緩沖液、FastPfu Fly DNA聚合酶、dNTPs Mix 北京全式金生物技術(shù)有限公司；引物27F/1495R 武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

YH-2004電子天平 惠州市英衡電子科技有限公司；DG250型厭氧工作站 英國(guó)Don Whitley公司；CR21N型高速離心機(jī) 日本日立金屬株式會(huì)社；R930機(jī)架式服務(wù)器 美國(guó)Dell公司；Illumina Xten高通量測(cè)序平臺(tái) 美國(guó)Illumina公司；ND-2000C微量紫外分光光度計(jì) 美國(guó)Thermo Scientific公司；MGC-300H培養(yǎng)箱上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

將收集的高溫大曲樣本破碎為粉，混合均勻后暫存于－80 ℃冰箱直至開(kāi)展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 芽孢桿菌的分離鑒定

使用無(wú)菌勺挖取10 g高溫大曲粉加入90 mL生理鹽水中振蕩均勻，使用倍比稀釋法將培養(yǎng)物稀釋至10－4～10－8梯度后涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂（nutrient agar，NA）培養(yǎng)基上，37 ℃倒置培養(yǎng)24 h[18]。選取菌落數(shù)在30～300的培養(yǎng)皿，并觀察平板中各菌落的形態(tài)，根據(jù)形態(tài)、顏色和大小等特征挑選不同的單菌落進(jìn)行劃線(xiàn)純化。純化3 次后挑選恰當(dāng)?shù)木w進(jìn)行涂片和革蘭氏染色，使用十六烷基三甲基溴化銨法對(duì)疑似芽孢桿菌菌株的DNA進(jìn)行提取，并使用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1495R（5’-CTACGGCTACCTTCTTACGA-3’）對(duì)其16S rRNA全序列進(jìn)行擴(kuò)增。使用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢驗(yàn)，并將檢驗(yàn)合格的擴(kuò)增產(chǎn)物連接到T載體后轉(zhuǎn)化至Escherichia colitop10中。最后，將陽(yáng)性克隆子寄往測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，并將反饋回的序列拼接后在國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[19]。

1.3.3 宏基因組DNA提取和測(cè)序

參照DNeasy mericon Food Kit DNA基因組提取試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟對(duì)高溫大曲樣本進(jìn)行宏基因組DNA提取，通過(guò)超聲將提取的宏基因組DNA打斷為350 bp左右，并將DNA末端進(jìn)行補(bǔ)齊后添加A-tailed構(gòu)建DNA文庫(kù)。最后，將構(gòu)建好的DNA文庫(kù)使用Illumina Xten測(cè)序儀進(jìn)行宏基因組測(cè)序。

1.3.4 生物信息學(xué)分析

使用KneadData軟件對(duì)下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，并去除人體基因組序列，將剩下的高質(zhì)量宏基因組序列用于后續(xù)分析[20]。

本研究使用MegaHit軟件將高質(zhì)量序列組裝成contigs，選擇長(zhǎng)度大于1000 bp的contigs構(gòu)建序列集，并基于Sembin軟件對(duì)構(gòu)建的序列集進(jìn)行宏基因組Binning以獲得宏基因組組裝基因組（metagenome assembly genomes，MAGs）[21]；使用CheckM軟件對(duì)每一個(gè)MAG的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估，并依照完整度和污染率將MAGs劃分為高質(zhì)量（完整度＞80%，且污染率＜10%）、中等質(zhì)量（60%＜完整度≤80%，且10%≤污染率＜20%）和低質(zhì)量（完整度≤60%，或污染率≥20%）[22]；使用FastANI軟件將MAGs與NCBI非冗余核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)（Nucleotide Sequence Database，NT）和人體腸道微生物的基因組集（Unified Human Gastrointestinal Genome，UHGG）比對(duì)以獲得MAGs的注釋信息[23]。使用HUMAnN2（HMP Unified Metabolic Analysis Network 2）分析流程對(duì)質(zhì)控后的宏基因組序列進(jìn)行分析[24]，并通過(guò)MetaphlAn 3軟件對(duì)高溫大曲中微生物的構(gòu)成和相對(duì)豐度進(jìn)行解析[25]。

1.3.5 核酸登錄號(hào)

本研究所用測(cè)序數(shù)據(jù)正在上傳國(guó)家生物技術(shù)信息中心SRA數(shù)據(jù)庫(kù)保存，該數(shù)據(jù)在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的編號(hào)為PRJNA1008639。

1.4 數(shù)據(jù)分析及可視化

本研究基于R軟件對(duì)茅臺(tái)鎮(zhèn)不同酒廠(chǎng)高溫大曲中微生物的相對(duì)含量、α多樣性指數(shù)和微生物代謝通路的差異進(jìn)行分析；使用PAST軟件對(duì)微生物的群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行主坐標(biāo)分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）。本研究所有數(shù)據(jù)可視化均使用Origin 2021或R軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫大曲中芽孢桿菌的分離鑒定

本研究從6 份茅臺(tái)鎮(zhèn)高溫大曲中共分離鑒定到212 株芽孢桿菌，其中從A酒廠(chǎng)高溫大曲中共分離鑒定到114 株芽孢桿菌（A1、A2和A3分別鑒定到41、38 株和35 株），而從B酒廠(chǎng)高溫大曲中共分離鑒定到98 株芽孢桿菌（B1、B2和B3分別鑒定到31、35 株和32 株），部分純化后的芽孢桿菌菌株在NA培養(yǎng)基中的菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)如圖1所示。

由圖1A可知，分離株的菌落形態(tài)多為圓形，表面粗糙、部分菌落中間凸起，顏色為透明或不透明的乳白色。由圖1B可知，菌株在電子顯微鏡下呈現(xiàn)短桿狀或桿狀，分離的菌株總體符合芽孢桿菌的典型特征。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，A酒廠(chǎng)分離的菌落形態(tài)多為圓形、中間凸起，呈不透明的乳白色，而B(niǎo)酒廠(chǎng)分離的菌落形態(tài)大多表面粗糙，呈透明的乳白色。由此可見(jiàn)，不同酒廠(chǎng)高溫大曲中分離的芽孢桿菌的形態(tài)存在較大差異。為進(jìn)一步確定分離菌株的分類(lèi)學(xué)地位，本研究對(duì)菌株的16S rRNA基因全長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定，并在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST比對(duì)，同時(shí)將所獲得的序列與模式菌株序列通過(guò)MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果如圖2所示。

圖2 基于16S rRNA的212 株芽孢桿菌與標(biāo)準(zhǔn)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of 212 Bacillus stains and standard strains based on 16S rRNA sequencing

本研究分離出的212 株芽孢桿菌被鑒定為20 個(gè)種，分別為77 株索諾拉沙漠芽孢桿菌（Bacillus sonorensis）、39 株地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）、19 株解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）、16 株暹羅芽孢桿菌（B.siamensis）、15 株地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）、13 株擬蕈狀芽孢桿菌（B.paramycoides）和11 株貝萊斯芽孢桿菌（B.velezensis）等。進(jìn)一步分析可知，B.sonorensis主要由B酒廠(chǎng)中分離得到，B.licheniformis和B.amyloliquefaciens主要由A酒廠(chǎng)中分離得到，而其他菌株在兩酒廠(chǎng)中分布差異不明顯。綜上所述，茅臺(tái)鎮(zhèn)高溫大曲中的芽孢桿菌以B.sonorensis、B.licheniformis和B.amyloliquefaciens等為主，占比63.68%。相關(guān)研究顯示，B.sonorensis、B.licheniformis和B.amyloliquefaciens等為高溫大曲中的主要芽孢桿菌，不僅參與醬香型白酒的發(fā)酵過(guò)程，還可以控制有害微生物的生長(zhǎng)，產(chǎn)生一些具有特殊風(fēng)味的化合物，并可能影響白酒風(fēng)味。由此可見(jiàn)，通過(guò)對(duì)高溫大曲的芽孢桿菌進(jìn)行分離鑒定和保藏，可為后續(xù)優(yōu)良菌種的開(kāi)發(fā)提供必要的原材料。

2.2 高溫大曲中微生物構(gòu)成和多樣性分析

本研究在純培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，通過(guò)超高深宏基因組測(cè)序?qū)Ω邷卮笄⑸镱?lèi)群進(jìn)行解析，6 個(gè)樣品共獲得867530532 條高質(zhì)量序列，測(cè)序總量為124.08 Gb，每個(gè)樣本平均獲得144588422 條高質(zhì)量序列，平均測(cè)序量為20.68 Gb。在獲得宏基因組數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，本研究采用Binning技術(shù)對(duì)茅臺(tái)鎮(zhèn)高溫大曲中微生物的基因組進(jìn)行組裝，結(jié)果如圖3所示。

圖3 基于宏基因組Binning技術(shù)的物種構(gòu)成分析Fig.3 Species composition analysis based on metagenome binning technology

本研究共獲得303 個(gè)MAGs，其中高質(zhì)量的MAGs有55 個(gè)。由圖3A可知，本研究獲得的55 個(gè)高質(zhì)量MAGs分別隸屬于13 個(gè)屬的26 個(gè)種。進(jìn)一步分析可知，Virgibacillussp.和Saccharopolyspora rectivirgula在所有酒曲樣本中均能被鑒定到，而Oceanobacillus caeni、Kroppenstedtiasp.和K.eburnea僅在A酒廠(chǎng)的所有大曲中被鑒定到。值得注意的是，Staphylococcus和Streptomyces僅在A酒廠(chǎng)的大曲中被鑒定到，而Lactobacillus僅在B酒廠(chǎng)的大曲中被鑒定到。

將高質(zhì)量MAGs與數(shù)據(jù)庫(kù)中基因組的平均核苷酸相似度（average nucleotide identity，ANI）進(jìn)行計(jì)算發(fā)現(xiàn)，55 個(gè)高質(zhì)量的MAGs中有37 個(gè)與數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因組具有較高水平的ANI（≥97%），而剩余18 個(gè)與數(shù)據(jù)庫(kù)中基因組的ANI較低（＜97%）。由此可見(jiàn)，37 個(gè)高質(zhì)量MAGs可以在種水平被注釋?zhuān)渌?8 個(gè)為疑似新種（Pseudogracilibacillussp.、Virgibacillussp.、Bacillussp.、Kroppenstedtiasp.、Lactobacillussp.、Staphylococcussp.、Weissellasp.和Streptomycessp.）。在此基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步對(duì)茅臺(tái)鎮(zhèn)高溫大曲中微生物的物種構(gòu)成和多樣性進(jìn)行解析，結(jié)果如圖4所示。

圖4 茅臺(tái)鎮(zhèn)高溫大曲中微生物的組成和多樣性Fig.4 Composition and diversity of microorganisms in high temperature Daqu from Maotai town

本研究一共注釋到6 個(gè)菌門(mén)和109 個(gè)菌種。由圖4A可知，高溫大曲中的優(yōu)勢(shì)（平均相對(duì)含量大于1.00%）菌屬有8 個(gè)，分別為43.21%芽胞鏈菌屬（Desmospora）、22.99%芽孢桿菌屬（Bacillus）、7.07%曲霉科_未識(shí)別（Aspergillaceae_unclassified）等。由圖4B可知，優(yōu)勢(shì)菌種有13 個(gè)，主要為48.46%Desmosporasp.8437、6.93%B.sonorensis和5.65%B.amyloliquefaciens等。值得注意的是，A酒廠(chǎng)高溫大曲中子囊菌門(mén)（Ascomycota）的相對(duì)含量高達(dá)12.74%，其真菌相對(duì)含量較高。本研究進(jìn)一步對(duì)不同酒廠(chǎng)高溫酒曲中優(yōu)勢(shì)菌屬和菌種的相對(duì)豐度進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)Desmospora和Bacillus是高溫酒曲中的主要菌屬，而Desmospora_sp_8437是高溫酒曲中的主要菌種。差異分析發(fā)現(xiàn)，在優(yōu)勢(shì)菌屬方面，僅Staphylococcus在A酒廠(chǎng)高溫大曲中顯著較高（P＜0.05），而其他優(yōu)勢(shì)菌屬均差異不顯著（P＞0.05）；在優(yōu)勢(shì)菌種方面，A酒廠(chǎng)高溫大曲在B.sonorensis、B.amyloliquefaciens和B.coagulans等芽孢桿菌的相對(duì)豐度上顯著較低（P＜0.05）。由圖4C、D可知，A酒廠(chǎng)高溫大曲中微生物的Shannon指數(shù)和J指數(shù)分別為1.01和0.28，而B(niǎo)酒廠(chǎng)高溫大曲分別為2.06和0.54。經(jīng)Wilcoxon檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，A酒廠(chǎng)高溫大曲中微生物的Shannon指數(shù)和J指數(shù)均顯著低于B酒廠(chǎng)高溫大曲（P＜0.05）。由此可見(jiàn)，其微生物的多樣性和豐富度均顯著低于B酒廠(chǎng)高溫大曲（P＜0.05）?；贐ray-Curtis和Jaccard距離對(duì)茅臺(tái)鎮(zhèn)不同高溫大曲的菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果如圖5所示。

圖5 基于Bray-Curtis（A）和Jaccard（B）距離的PCoA圖Fig.5 PCoA plots based on Bray-Curtis (A) or Jaccard (B) distance

由圖5A可知，在基于Bray-Curtis距離的PCoA圖中，A酒廠(chǎng)高溫大曲主要集中在第3象限，而B(niǎo)酒廠(chǎng)高溫大曲則較為分散，不同高溫大曲在空間上呈現(xiàn)明顯的分離趨勢(shì)（F＝1.256，P＝0.204）；由圖5B可知，在基于Jaccard距離的PCoA圖中，A酒廠(chǎng)高溫大曲主要集中在X軸正方向，而B(niǎo)酒廠(chǎng)高溫大曲則主要集中在X軸負(fù)方向，兩種高溫大曲亦在空間上呈現(xiàn)明顯的分離趨勢(shì)（F＝3.453，P＝0.024）。由此可見(jiàn)，高溫大曲中的主要微生物存在較大差異，可能各自含有一些較為獨(dú)特的細(xì)菌類(lèi)群。值得注意的是，A酒廠(chǎng)高溫大曲在空間上較為集中，而B(niǎo)酒廠(chǎng)高溫大曲在空間上較為分散，表明A酒廠(chǎng)高溫大曲中的微生物結(jié)構(gòu)更為相似穩(wěn)定。

2.3 高溫大曲中微生物的代謝途徑

本研究基于Humann2分析流程對(duì)高溫大曲中微生物的功能進(jìn)行預(yù)測(cè)，并通過(guò)MetaCyc數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)微生物的代謝途徑進(jìn)行注釋。茅臺(tái)鎮(zhèn)不同高溫大曲中微生物差異代謝途徑如圖6所示。

圖6 茅臺(tái)鎮(zhèn)不同高溫大曲中微生物差異代謝途徑分析Fig.6 Analysis of microbial differential metabolic pathways between different high-temperature Daqu from Maotai town

由圖6可知，從茅臺(tái)鎮(zhèn)高溫大曲中共注釋到367 條代謝途徑，而有11 條代謝途徑在不同高溫大曲中存在顯著性差異（P＜0.05），其中9 條代謝途徑的相對(duì)豐度在A酒廠(chǎng)高溫大曲中顯著較高（P＜0.05），2 條代謝途徑的豐度在B酒廠(chǎng)高溫大曲中顯著較高（P＜0.05）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在A酒廠(chǎng)高溫大曲中豐度較高的差異代謝通路主要與氨基酸的生物合成相關(guān)，而在B酒廠(chǎng)高溫大曲中豐度較高的差異代謝通路主要與L-鼠李糖的降解相關(guān)。為此，本研究進(jìn)一步對(duì)在差異代謝途徑中各菌的貢獻(xiàn)度進(jìn)行分析，具體結(jié)果如圖7所示。

圖7 部分差異代謝途徑中微生物的貢獻(xiàn)度分析Fig.7 Analysis of the contribution of microorganisms to selected differential metabolic pathways

本研究對(duì)11 條差異代謝途徑的物種貢獻(xiàn)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)有9 條差異代謝途徑的物種貢獻(xiàn)為未知，僅有2 條差異代謝途徑的物種貢獻(xiàn)較為明確。由圖7可知，白三烯的生物合成主要由釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、黃曲霉（Aspergillus flavus）和構(gòu)巢曲霉（A.nidulans）等貢獻(xiàn)，而L-鼠李糖降解則主要由B.sonorensis、B.coagulans和乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）等貢獻(xiàn)。值得注意的是白三烯生物合成的差異主要是由A酒廠(chǎng)高溫大曲中的未知物種所貢獻(xiàn)。

3 討論與結(jié)論

酒曲作為白酒發(fā)酵的靈魂，在白酒的生產(chǎn)發(fā)酵中扮演著重要的角色。作為白酒生產(chǎn)過(guò)程中重要的糖化劑和發(fā)酵劑，其不僅提供發(fā)酵過(guò)程中所需要的各種微生物，還提供各種酶類(lèi)及風(fēng)味物質(zhì)的前體，直接或間接影響著酒體最終品質(zhì)的形成[26]。在高溫大曲制作時(shí)，大量環(huán)境或原材料中的微生物進(jìn)入發(fā)酵體系進(jìn)行富集，并經(jīng)過(guò)一段時(shí)間高溫發(fā)酵，最終形成其所特有的微生物菌群和多樣性[27]。有研究發(fā)現(xiàn)高溫發(fā)酵會(huì)導(dǎo)致大曲中微生物的構(gòu)成發(fā)生明顯變化，使得如Bacillus、嗜熱真菌屬（Thermomyces）和熱子囊菌屬（Thermoascus）等對(duì)高溫耐受性較強(qiáng)的微生物占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位，而酵母等對(duì)高溫耐受性相對(duì)較差的微生物豐度顯著降低[28]。通常酵母的存在能有效提高白酒中酮類(lèi)、酯類(lèi)和酚類(lèi)等揮發(fā)性化合物的濃度，從而提升白酒的感官品質(zhì)。本研究通過(guò)純培養(yǎng)技術(shù)從茅臺(tái)鎮(zhèn)高溫大曲中分離得到212 株芽孢桿菌，其中大部分為B.sonorensis、B.licheniformis和B.amyloliquefaciens等。侯強(qiáng)川等[29]對(duì)茅臺(tái)和堯治河高溫大曲中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析時(shí)亦發(fā)現(xiàn)Bacillus是高溫大曲主要菌屬，且不同地區(qū)和類(lèi)型的高溫大曲中Bacillus的相對(duì)含量存在明顯差異。Wu Xue等[30]也證實(shí)了Bacillus對(duì)醬香型白酒中的風(fēng)味物質(zhì)具有較大的影響，在醬香型白酒發(fā)酵過(guò)程中具有廣泛的應(yīng)用。由此可見(jiàn)，通過(guò)對(duì)高溫大曲中的芽孢桿菌進(jìn)行分離、鑒定和保藏，可為后期菌株的開(kāi)發(fā)利用做準(zhǔn)備。

通過(guò)Binning技術(shù)共獲得55 個(gè)高質(zhì)量MAGs，其中有18 個(gè)疑似新菌株，主要為Bacillussp.、Lactobacillussp.和Weissellasp.等。本團(tuán)隊(duì)在前期研究中通過(guò)超高深宏基因測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)房縣小曲中存在一株疑似的新菌株Weissellasp.[31]，并在后期實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行了驗(yàn)證，同時(shí)證明其在房縣黃酒的發(fā)酵過(guò)程中扮演著重要的角色[32]。由此可見(jiàn)，通過(guò)超高深宏基因組測(cè)序結(jié)合Binning技術(shù)可以為新菌株的鑒定提供可靠技術(shù)支持。相關(guān)研究證實(shí)，真菌在醬香型白酒的發(fā)酵過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，對(duì)于其發(fā)酵進(jìn)程和風(fēng)味形成均有著積極影響[33]。值得注意的是，A酒廠(chǎng)高溫大曲中芽孢桿菌的相對(duì)含量相較于B酒廠(chǎng)高溫大曲明顯較低，而這可能與酒曲的制作和發(fā)酵環(huán)境，以及微生物的相互作用有著緊密的聯(lián)系[33]。對(duì)高溫大曲中微生物的多樣性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，A酒廠(chǎng)高溫大曲中微生物的多樣性和豐富度均顯著低于B酒廠(chǎng)高溫大曲，兩者微生物的菌群結(jié)構(gòu)存在明顯的差異。微生物的多樣性與發(fā)酵過(guò)程中酵母的代謝活性有著密切聯(lián)系，多樣的微生物群落可以在發(fā)酵中利用不同底物，從而加速發(fā)酵的進(jìn)行。侯強(qiáng)川等[29]研究發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)采集的大曲中細(xì)菌的群落結(jié)果存在明顯差異。由此可見(jiàn)，除地區(qū)因素外，酒曲的制作工藝也會(huì)造成高溫大曲中微生物群落結(jié)構(gòu)的差異。而值得注意的是，A酒廠(chǎng)高溫大曲中微生物的群落結(jié)構(gòu)較為相似，B酒廠(chǎng)高溫大曲中微生物群落結(jié)構(gòu)存在較大的差異，而微生物群落的不同組成可以影響酒的感官特性，使其呈現(xiàn)出個(gè)性化風(fēng)味。

在功能方面，兩種高溫大曲存在多條差異代謝通路，其中在A酒廠(chǎng)高溫大曲中顯著較高的差異代謝通路大多與氨基酸的代謝相關(guān)，而B(niǎo)酒廠(chǎng)高溫大曲中的差異代謝通路主要與L-鼠李糖的降解相關(guān)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)L-谷氨酸和L-異亮氨酸降解加快不僅可以加速發(fā)酵的進(jìn)程，促進(jìn)酒精的產(chǎn)生，還可能在分解過(guò)程中產(chǎn)生香氣化合物（如酯類(lèi)、醛類(lèi)和酮類(lèi)等）和一些揮發(fā)性酸（如乙酸和丁酸等），從而賦予白酒特殊的芳香特征和口感[34-35]。L-鼠李糖的降解大多是由酵母菌完成，而更高的L-鼠李糖降解速率不僅可以加快發(fā)酵速率，產(chǎn)生更多的酒精和香氣化合物，還可能產(chǎn)生一些代謝產(chǎn)物，提升酒體的穩(wěn)定性[36]。由此可見(jiàn)，不同酒廠(chǎng)因其獨(dú)特的曲種，可能塑造不同的酒體香味特征和口感。對(duì)部分差異代謝通路的進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，同一代謝通路由多種微生物貢獻(xiàn)。不同菌群的最適生長(zhǎng)條件存在差異，且菌群在不同環(huán)境中生長(zhǎng)狀態(tài)也不相同，這也使得某些代謝途徑容易受到環(huán)境影響，從而影響白酒的發(fā)酵進(jìn)程。因此，當(dāng)同一代謝通路由多種微生物貢獻(xiàn)，不僅可以提升代謝效率，還可以提升其環(huán)境適應(yīng)性，使得代謝通路表達(dá)能維持相對(duì)穩(wěn)定，從而在一定程度上維持酒曲品質(zhì)的穩(wěn)定。綜上所述，后續(xù)研究應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)大酒曲的采樣范圍和數(shù)量，并結(jié)合全基因組測(cè)序技術(shù)進(jìn)一步解析微生物在醬香型白酒發(fā)酵過(guò)程中的積極作用，為后期優(yōu)良菌株的篩選和發(fā)酵工藝的改良提供必要數(shù)據(jù)支持。