王照翔，魏凡超，黃大源，韓士超，戚若晨，王國輝，張小燕，劉克普，馬帥軍，楊曉劍，秦衛(wèi)軍

(空軍軍醫(yī)大學西京醫(yī)院泌尿外科，陜西 西安 710032)

我國慢性腎衰竭患病比例約為1.5%，發(fā)病率為10.8%。對于這些患者，器官移植是治愈他們最有效的手段。盡管努力增加供體庫，但供體器官數(shù)量仍然短缺[1]。異種移植是解決器官短缺問題的一個重要手段[2]。在2022年美國阿拉巴馬大學以及紐約大學朗格尼研究所先后進行了基因編輯豬-腦死亡受體的異種腎移植[1，3]。盡管異種腎移植研究已有進展，但仍面臨著術(shù)后強烈排斥反應(yīng)的問題。因此，誘導免疫耐受策略成為器官移植臨床前研究的主要目標。

胸腺是中樞性免疫器官，發(fā)揮對T淋巴細胞的選擇發(fā)育功能。T淋巴細胞是移植排斥反應(yīng)的關(guān)鍵，作為T淋巴細胞的來源，胸腺具有獨特的潛力[4]，通過胸腺移植，可使供體的胸腺在受體體內(nèi)選擇發(fā)育受體 T 淋巴細胞從而誘導受體對供體特異性免疫耐受[5]。在通過胸腺移植誘導免疫耐受時，由于胸腺組織本身富含供體的抗原，易導致胸腺移植完成時、在胸腺血運未完全恢復前發(fā)生強烈的免疫排斥反應(yīng)，使移植的胸腺被宿主清除掉。因此，在移植前切除宿主的胸腺并且通過胸腺照射消除宿主體內(nèi)原有的T細胞、NK細胞是很有必要的[6]。這在嚙齒動物、小型動物中比較容易實現(xiàn)，但是在大型動物中想完全消除其T細胞、NK細胞很難做到，可以通過腎包膜下包埋胸腺來構(gòu)建胸腺血管重建模型，這樣有利于在大型動物中達到構(gòu)建免疫耐受的效果[7]。

目前構(gòu)建血管化的胸腺主要有兩種方法：一是“胸腺腎”移植[8-10]；二是進行血管化的“胸腺小葉”移植[11-14]。兩種方案均取得良好效果，現(xiàn)主要介紹構(gòu)建“胸腺腎”移植。

本文主要介紹胸腺的主要特征、胸腺腎模型的構(gòu)建方式以及胸腺腎實現(xiàn)免疫重建的效果。同時介紹各移植中心在小型動物間、大型動物間以及基因編輯豬-腦死亡受體間通過構(gòu)建胸腺腎成功建立免疫耐受完成異種移植的效果，說明胸腺腎的臨床應(yīng)用具有可行性。

1 胸腺及胸腺腎模型的構(gòu)建及主要特征

胸腺屬于重要的中樞免疫器官，其髓質(zhì)中含成熟的T細胞和巨噬細胞，皮質(zhì)中富含未成熟T細胞。在胸腺微環(huán)境中，未成熟T細胞經(jīng)歷復雜的選擇過程而發(fā)育為成熟的T細胞。隨著年齡的增長，胸腺會發(fā)生退化，主要表現(xiàn)為胸腺實質(zhì)內(nèi)淋巴細胞減少，取而代之的是脂肪細胞和結(jié)締組織[15]。

由于轉(zhuǎn)基因豬已經(jīng)成為很理想的異種器官供體來源[9]，對豬的胸腺結(jié)構(gòu)進行了解，有利于在制備胸腺腎模型時進行操作。解剖學上，豬的胸腺呈“Y”字型，淡粉紅色或黃白色，由胸腺頸葉、中葉、胸葉構(gòu)成。表面覆蓋被膜，腺體被結(jié)締組織分割為許多小葉。1日齡五指山豬胸腺的平均總長度為9.64 cm[16]。組織學上，胸腺表面被覆結(jié)締組織，胸腺實質(zhì)由皮質(zhì)和髓質(zhì)構(gòu)成。皮質(zhì)位于外周，顏色深，以淋巴細胞為主，具有少量的上皮細胞和嗜酸性粒細胞；髓質(zhì)位于內(nèi)部，顏色淺，具有大量小型胸腺小體，少量幼稚胸腺小體；胸腺小體周邊有嗜酸性粒細胞。

胸腺腎的制備過程主要是在腎移植的2個月前進行預處理[2]：將供體基因編輯豬的胸腺剝離出來，搗碎或切成薄片，包埋在供體的腎包膜下。由于腎包膜的血供極其豐富，在進行正式腎移植手術(shù)前，腎包膜下已形成具有完整血管化的胸腺，此時的血管化胸腺具有正常胸腺的功能，這一過程就是胸腺腎的制備。經(jīng)過隨后的移植，在受者體內(nèi)，胸腺腎可以通過選擇性發(fā)育，產(chǎn)生具有正常功能的T細胞，同時產(chǎn)生的T細胞對移植的組織具有免疫耐受[17]，從而減少受體對移植物排斥反應(yīng)的發(fā)生。

2 胸腺腎實現(xiàn)免疫重建的研究

在廣州中山大學第一附屬醫(yī)院器官移植科建立的大鼠自體胸腺腎模型中，將大鼠自體的胸腺切除，放入0～4 ℃生理鹽水中保存，隨后取其中部分大鼠胸腺，將胸腺剪成3～4片，分別放入雙腎腎包膜下[6]，構(gòu)建雙側(cè)自體胸腺腎模型。術(shù)后2周可看到明顯的血管從腎門部發(fā)出，進入胸腺組織中，胸腺組織由最初的暗紅色變?yōu)檎Ｐ叵俳M織的白色。術(shù)后6～8周，胸腺組織增厚，組織學可看到正常的胸腺組織結(jié)構(gòu)。術(shù)后6周，只切除胸腺，未建立胸腺腎模型的大鼠CD4+T、CD8+T細胞逐漸下降；而構(gòu)建胸腺腎的大鼠CD4+T、CD8+T細胞開始回升，并維持穩(wěn)定。由此可見，胸腺腎的構(gòu)建可以實現(xiàn)免疫重建。

在大鼠自體胸腺腎模型中，將建立自體胸腺腎模型的大鼠與只切除胸腺未建立胸腺腎模型大鼠的CD4+T、CD8+T細胞含量進行對比，結(jié)果顯示建立自體胸腺腎模型的大鼠在術(shù)后CD4+T、CD8+T細胞含量逐漸回升，且呈時間依賴性。從而驗證了胸腺腎模型實現(xiàn)免疫重建的可行性。但本模型僅構(gòu)建了自體胸腺腎模型，未進行同種異體或異種胸腺腎模型構(gòu)建的實驗，對于異種胸腺腎實現(xiàn)免疫重建并沒有足夠的說服力。

3 小型動物胸腺腎建立免疫耐受的研究

在原第三軍醫(yī)大學西南醫(yī)院燒傷研究所構(gòu)建的F344近交系大鼠與裸小鼠的模型中，將F344近交系大鼠的胎胸腺移植入裸小鼠的左腎包膜下，以此來構(gòu)建胸腺腎模型[18]。由于裸小鼠屬于先天性免疫缺陷動物，先天胸腺發(fā)育異常，T淋巴細胞功能缺陷[19]，從而實現(xiàn)了受體T細胞的完全清除。100 mg/kg異戊巴比妥鈉鹽腹腔注射麻醉后，將孕15 d的F344大鼠胎胸腺組織1 mm3植入裸小鼠左腎包膜下，隨后在SPF級飼養(yǎng)室培育。術(shù)后第2個月和術(shù)后第3個月，通過細胞流式儀觀察到經(jīng)過胸腺移植后的裸小鼠CD4+T淋巴細胞與CD8+T淋巴細胞均有重建，且重建程度呈時間依賴性。具體表現(xiàn)為正常BALB/c小鼠CD4+T細胞百分率為13.02%，接受胸腺移植的裸小鼠術(shù)后第2個月和術(shù)后第3個月的CD4+T細胞百分率分別為2.77%、7.75%。正常BALB/c小鼠CD8+T細胞百分率為8.89%，接受胸腺移植的裸小鼠術(shù)后第2個月和術(shù)后第3個月的CD8+T細胞百分率分別為3.10%、10.14%。其中在移植后第3個月裸小鼠的CD8+T淋巴細胞甚至高于免疫健全的小鼠CD8+T細胞的比率[18]。由此可見，胸腺腎的構(gòu)建可以在免疫缺失動物中實現(xiàn)免疫重建并誘導受體對供體特異性T細胞的耐受。

哈佛大學醫(yī)學院麻省總醫(yī)院移植生物學研究中心構(gòu)建的豬-小鼠模型中[20]，通過將胎豬胸腺移植入小鼠腎包膜下來建立免疫耐受，隨后進行供體豬到小鼠的異種皮膚移植。首先將小鼠胸腺切除，在胸腺移植前6 d和1 d腹腔注射mAbs GK1.5、30-H12、PK136等藥物來達到耗盡T細胞和NK細胞的目的，在胸腺移植當日對小鼠進行3 Gy全身照射，將胎豬的胸腺組織以1 mm3移植到受體小鼠腎包膜下。2周后將胎豬皮膚移植入小鼠后外側(cè)胸腔上。術(shù)后4周觀察到CD4+T細胞擴增并有效的填充外周[21]。重建的功能性T細胞表現(xiàn)出對供體豬以及受體小鼠的耐受性，供體豬的皮膚移植物并未發(fā)生排斥反應(yīng)[22-23]。

在大鼠與裸小鼠的異種胸腺腎模型中，術(shù)后對裸小鼠CD4+T淋巴細胞與CD8+T淋巴細胞含量的測定顯示，CD4+T淋巴細胞與CD8+T淋巴細胞含量逐漸恢復，且含量的增長與時間成正比。本模型證明了胸腺腎模型在異種移植中實現(xiàn)免疫重建的可行性，同時宿主并未對移植胸腺有明顯的排斥反應(yīng)，證明胸腺腎模型在異種移植中具有建立免疫耐受的功能。但本實驗術(shù)后僅測定了淋巴細胞的含量與亞型，并未通過有效的檢測方式對新生成的淋巴細胞進行溯源，如果能發(fā)現(xiàn)新生成的淋巴細胞的來源，將對胸腺腎實現(xiàn)免疫重建機制的研究有所指導。

豬-小鼠模型中，使用了單克隆抗體與胸腺照射來增加胸腺腎模型建立的成功率。在小鼠體內(nèi)異種胸腺腎模型的構(gòu)建，讓宿主小鼠成功耐受了供體豬的皮膚移植物，說明胸腺腎模型構(gòu)建對異種移植免疫耐受的形成具有幫助。

4 大型動物胸腺腎建立免疫耐受的研究

在哈佛大學醫(yī)學院麻省總醫(yī)院移植生物學研究中心對豬與狒狒模型的研究中，通過狒狒胸腺切除、眼鏡蛇毒因子來消耗T細胞和補體[24]。在移植前40～80 d將供體豬的胸腺埋入自體雙腎包膜下，制備雙側(cè)胸腺腎，隨后將構(gòu)建的右側(cè)胸腺腎原位移植給狒狒。術(shù)后免疫抑制劑使用嗎替麥考酚酯、抗胸腺細胞球蛋白、環(huán)磷酰胺、眼鏡蛇毒因子。5例實驗中有1例豬腎在狒狒體內(nèi)存活超過6個月。最終由于腎臟的過度生長導致腎皮質(zhì)壞死，并無排斥反應(yīng)的證據(jù)，胸腺腎移植物顯示腎小球以及腎血管表現(xiàn)良好，并無血管病變及炎癥反應(yīng)[25-26]。

哥倫比亞大學轉(zhuǎn)化免疫學中心YAMADA實驗室在對基因編輯豬-非人靈長類動物進行的研究中[27]，將GGTA1單基因敲除的供體豬的胸腺取出并切碎，分別包埋入自體雙側(cè)腎包膜下。6～8周后，將構(gòu)建的胸腺腎取出，取出時應(yīng)保留部分腎周脂肪，防止在之后的移植中造成組織粘連。將胸腺腎移入狒狒體內(nèi)，使用的方法是右側(cè)腎原位移植，移植后有尿產(chǎn)生后切除受體左腎。文章主要介紹了手術(shù)方法，并未介紹試驗后的結(jié)果。該團隊先前的研究顯示：單基因GGTA1敲除豬血管化胸腺腎移植后，受體肌酐維持正常水平長達83 d，未構(gòu)建血管化胸腺的受體肌酐維持正常僅34 d，在34 d時腎臟及胸腺移植物均先后被排斥[28]。隨著誘導方案及手術(shù)技術(shù)的改進，該中心2017年實現(xiàn)了胸腺腎在受者體內(nèi)存活超過6個月的案例[29-30]。

在豬-非人靈長類動物這類大型動物間的腎移植模型中，要注意由于宿主體內(nèi)的免疫細胞很難像小型動物一樣通過全身照射或免疫抑制劑清除，如果胸腺腎在未完全完成血管化重建時便移植入宿主體內(nèi)，很容易就會被宿主排斥掉。YAMADA實驗室的研究也顯示未構(gòu)建血管化胸腺的受體肌酐維持正常僅34 d，在34 d時腎臟及胸腺移植物均先后被宿主排斥[27]。只有構(gòu)建血管化的胸腺腎，進行異種移植后才能在宿主體內(nèi)發(fā)揮建立免疫耐受的功能。同時，胸腺腎移植術(shù)前對宿主進行胸腺切除以及使用免疫抑制劑也是必要的。胸腺腎在豬-非人靈長類動物間腎移植模型的成功構(gòu)建并建立免疫耐受的實驗也為胸腺腎在臨床上應(yīng)用以減輕異種移植術(shù)后超急性排斥反應(yīng)提供了更充足的理論依據(jù)。

5 動物與人異種移植中胸腺腎的應(yīng)用

紐約大學朗格尼移植研究所在2021年分別對兩位腦死亡患者進行了異種腎移植[4]。采用的方法為GGTA1單基因敲除豬以及構(gòu)建胸腺腎模型進行移植。在獲取器官的兩個月前，將供體豬的胸腺植入腎包膜下[31-32]。獲得胸腺腎器官后保存在SPS-1器官保存液中，隨后進行移植手術(shù)。第一例腎缺血時間為7 h，第二例腎缺血為6 h。移植并且再灌注后，腎臟迅速呈現(xiàn)粉紅色，并在幾分鐘后開始排尿。免疫抑制劑使用嗎替麥考酚酯、甲基潑尼松龍。在觀察的54 h內(nèi)，兩例研究的移植物均表現(xiàn)為動態(tài)eGFR逐漸上升，肌酐逐漸下降。在第6、24、48、54 h進行的活檢中，未發(fā)生超急性排斥反應(yīng)以及抗體介導的排斥反應(yīng)。

紐約大學朗格尼移植研究所于2023年7月14日再次進行了GGTA1基因敲除豬到腦死亡受體的異種腎移植。本次移植中仍然構(gòu)建了胸腺腎模型。本次腎臟功能共維持了61 d。移植腎持續(xù)有尿，未觀察到超急性和急性排斥反應(yīng)，肌酐水平在研究期間處于最佳范圍內(nèi)，并且沒有關(guān)于排斥反應(yīng)活檢的證據(jù)[33]。

朗格尼移植研究所在2021年與2023年的臨床異種腎移植試驗中，均使用胸腺腎作為輔助手段來減輕移植術(shù)后的排斥反應(yīng)。這也是胸腺腎模型首次運用于異種移植的臨床研究中，在他們最近的一次研究中，移植腎功能維持了61 d，超出了原有的世界紀錄60 d，并且在維持功能的61 d中沒有發(fā)現(xiàn)排斥反應(yīng)的證據(jù)。這些數(shù)據(jù)都展示出胸腺腎模型在異種移植中減輕排斥反應(yīng)的可行性。但其建立免疫耐受的機制并不清楚，仍需要在動物間建立模型進行進一步的探究，從而為臨床應(yīng)用提供更有價值的指導。

6 總結(jié)與展望

不論是小型動物、大型動物間異種移植還是在基因編輯豬-腦死亡受體的異種移植中，胸腺腎模型的構(gòu)建都對排斥反應(yīng)的抑制展現(xiàn)出積極的效果。胸腺腎的構(gòu)建可能有助于減少排斥反應(yīng)的發(fā)生[2]。將胸腺腎作為異種移植的輔助手段來建立免疫耐受，對減輕或避免超急性排斥反應(yīng)很有意義。然而對胸腺腎建立免疫耐受的機制仍不清楚；胸腺腎構(gòu)建時胸腺移植在腎臟的不同部位，是否會影響胸腺腎血管化的重建；胸腺腎血管化重建期間是否可以通過用藥加快其重建等仍不清楚，這些都是未來胸腺腎在動物實驗與臨床試驗應(yīng)用所急需解決的問題。未來通過在小型動物間進行異種移植胸腺腎的構(gòu)建，并在移植術(shù)后對重建的淋巴細胞進行檢測，從而對免疫耐受產(chǎn)生的機制進行研究；在對大型動物進行研究時可設(shè)置對照，對比異種移植中構(gòu)建胸腺腎與不構(gòu)建胸腺腎受體移植術(shù)后的存活情況、各項生理生化指標、各項輔助檢查指標，從而為胸腺腎在異種移植的臨床應(yīng)用提供更充分的理論依據(jù)。