孫 楠，朱熙錦，辛可啟，韓 玲，余群力

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

牦牛棲息在3000～5000 m高海拔、嚴(yán)寒的青藏高原地帶，具有高蛋白（質(zhì)量分?jǐn)?shù)約21.6%）、低脂肪（質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.6%～4.7%）、必需氨基酸含量高（占總氨基酸含量的35%以上）等優(yōu)點(diǎn)[1]，屬于我國適應(yīng)低氧的優(yōu)勢畜種。由于生活在嚴(yán)酷的低氧環(huán)境條件下，機(jī)體無法通過有氧呼吸供給所需的全部能量，因此牦牛形成了特定的代謝機(jī)制維持能量平衡[2]。最近，在牦牛肉體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一種與低氧適應(yīng)相關(guān)的基因——低氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α），此基因作為缺氧適應(yīng)和能量代謝的主要調(diào)節(jié)器，維持牦牛能量供需平衡[3]。Kim[4]和柳宇[5]等發(fā)現(xiàn)HIF-1α在高氧濃度下會迅速降解，只有在缺氧條件下才會積累，與HIF-1β發(fā)生二聚化形成HIF-1，并與缺氧反應(yīng)元件結(jié)合，激活下游級聯(lián)反應(yīng)，調(diào)節(jié)糖酵解，激活細(xì)胞代謝相關(guān)靶點(diǎn)，如葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、糖酵解酶等，使大部分葡萄糖通過糖代謝途徑轉(zhuǎn)化為ATP，提高機(jī)體適應(yīng)缺氧的能力。

NO是一種存在于細(xì)胞或組織內(nèi)的氣體信號分子，在肌肉糖酵解調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵的生化作用[6]。Mateo等[7]提出細(xì)胞中HIF-1α蛋白表達(dá)的激活或抑制與NO濃度有關(guān)。Brix等[8]研究發(fā)現(xiàn)，NO能夠通過有絲分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路激活HIF-1α，從而維持星形細(xì)胞的高糖酵解活性。嚴(yán)潔萍[9]也報道了提高NO濃度可以上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞中HIF-1α活性，激活下游葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）等糖酵解酶活性的表達(dá)，增加乳酸含量。因此，上述研究表明NO誘導(dǎo)HIF-1α對機(jī)體的糖酵解途徑具有重要的調(diào)控作用，然而這一重要作用鮮在宰后肌肉中報道。Wicks等[10]研究發(fā)現(xiàn)糖酵解是調(diào)控宰后肌肉成熟過程的重要途徑，會影響肉的嫩度、保水性、色澤等品質(zhì)。因此，宰后成熟過程中糖酵解的調(diào)控是研究肌肉嫩度的重要機(jī)制。最近，Xin Keqi等[11]研究提出，HIF-1α參與糖酵解途徑是影響宰后牛肉嫩度關(guān)鍵因素，但其相關(guān)調(diào)控機(jī)制尚不完全明晰。而目前關(guān)于NO對HIF-1α的調(diào)控機(jī)制研究主要集中于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，在宰后牦牛肉成熟過程中也鮮見報道。因此，本實(shí)驗(yàn)探討了宰后牦牛肉成熟過程中NO對MAPK/細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signalregulated kinase，ERK）信號通路、HIF-1α表達(dá)以及對嫩度的影響，并闡明它們之間的級聯(lián)調(diào)控機(jī)制，旨在為探尋影響牦牛肉糖酵解的調(diào)控因子，并以此作為靶點(diǎn)進(jìn)而為改善牦牛肉嫩度提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

平均年齡3～4 歲、平均體質(zhì)量（350±20）kg、飼養(yǎng)條件相同、健康無病害的9 頭牦牛 青海裕泰食品有限公司。

NO、糖原、己糖激酶（hexokinase，HK）、PK、LDH活性檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所；乳酸索萊寶科技有限公司；ERK1/2、p-ERK1/2抗體 北京博奧森生物科技有限公司；肌動蛋白（Actin）多克隆抗體（一抗）、山羊抗兔（二抗）北京百奧思科生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司；HIF-1α抗體 武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司；S-亞硝基谷胱甘肽（S-nitrosoglutathione，G S N O）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；PD98059、YC-1 上海源葉生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FSH-2A高速均質(zhì)機(jī) 常州越新儀器制造有限公司；FA-E分析天平 常州幸運(yùn)電子設(shè)備有限公司；722N可見分光光度計 上海儀電有限公司；Spectramax M型酶標(biāo)儀美國美谷分子儀器有限公司；H-1850R高速冷凍離心機(jī)上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；TS-100脫色搖床海門市其林貝爾儀器制造公司；BG-subMIDI電泳儀北京白晶生物技術(shù)有限公司；ChemiScope6100化學(xué)發(fā)光成像儀 上海勤翔科學(xué)儀器有限公司；Bulader TS100嫩度儀 北京布拉德科技發(fā)展有限公司；Testo 205 pH meter便攜式pH計 上海玖榮實(shí)業(yè)有限公司；SPECTRA ST全自動蘇木精-伊紅（hematoxylin and eosin，HE）染色機(jī) 廣州東銳科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料處理

按照DB63/T1785—2020《牦牛屠宰技術(shù)規(guī)程》方式進(jìn)行屠宰后，立即將背最長肌切成每塊約（200±30）g的肉塊，隨機(jī)分為4 組：1）對照組：肌肉注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9% NaCl；2）GSNO組：肌肉注射GSNO（200 μmol/L）；3）GSNO+YC-1組：肌肉注射GSNO（200 μmol/L）和YC-1（100 μmol/L）；4）GSNO+PD98059組：肌肉注射GSNO（200 μmol/L）和PD98059（50 μmol/L）。溶液注射量為肉質(zhì)量的10%[12]，注射器從肉塊的各個部位垂直插入，深度為肉厚度的一半，充分按摩使肉樣中的溶液分布均勻。真空包裝后，在4 ℃分別成熟3、6、9、12、24、72 h，測定pH值和剪切力，之后用液氮速凍，放入-80 ℃冰箱待用。

1.3.2 NO含量測定

NO含量采用市售檢測試劑盒測定。將1.0 g肉樣以1∶9（g/mL）的比例在冰浴中以10000×g的速度勻漿30 s，重復(fù)3 次。在4 ℃、8000×g離心5～10 min后，立即丟棄上清液。后續(xù)步驟按照試劑盒具體步驟進(jìn)行操作，最后，使用酶標(biāo)儀測定各孔吸光度（A550nm）。

1.3.3 免疫印跡分析

參考Chen Kuanchou等[13]提出的方法提取組織樣本中蛋白質(zhì)。凝膠電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（0.22 μm）上，用封閉液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的脫脂奶粉溶液）在室溫、搖床上緩慢搖動狀態(tài)下封閉1 h，4 ℃與以下一抗孵育過夜：HIF-1α抗體（1∶500）、ERK1/2抗體（1∶1000）、p-ERK1/2抗體（1∶1000）、Actin抗體（1∶5000）。洗去一抗后，加入二抗繼續(xù)孵育60 min（室溫、避光緩慢搖動）。最后，用TBST溶液洗膜，放入化學(xué)發(fā)光成像儀曝光成像，Alpha軟件處理?xiàng)l帶。

1.3.4 相關(guān)糖酵解酶活性測定

HK、PK、LDH活性采用市售比色法檢測試劑盒進(jìn)行評估。稱取0.1 g肉樣，加入1 mL各自提取液在冰浴中均質(zhì)，隨后4 ℃、8000×g離心10 min，取上清液放在冰上進(jìn)行測定。根據(jù)試劑盒的說明進(jìn)行測定。HK、PK活力按照樣本鮮質(zhì)量計算，以U/g表示，LDH活力以U/g表示（以蛋白質(zhì)量計）。

1.3.5 糖酵解潛力計算

糖原、乳酸含量均使用市售商業(yè)試劑盒測定。糖原含量測定步驟：取約100 mg肉樣與3 倍體積的堿液于沸水中加熱20 min，流水冷卻后用16 倍體積的雙蒸水稀釋，取顯色液∶雙蒸水∶樣液按20∶9∶1混合后，在沸水中加熱5 min，流水冷卻。最后，根據(jù)糖原分析試劑盒具體步驟測定糖原水平，單位為mg/g。乳酸含量測定步驟：稱取肉樣0.1 g加入1 mL 50 mmol/L預(yù)冷磷酸鹽緩沖溶液，冰浴勻漿后于4 ℃、12000×g離心10 min，收集上清液放置冰上待測。將標(biāo)準(zhǔn)液稀釋不同濃度后繪制乳酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。最后，根據(jù)乳酸分析試劑盒具體步驟評估乳酸水平，單位為μmol/g。

糖酵解潛力值參考陳騁等[14]方法進(jìn)行計算：2×糖原含量+乳酸含量；單位為mg/g。

1.3.6 pH值測定

使用前用標(biāo)準(zhǔn)溶液校準(zhǔn)便攜式pH計。pH計用去離子水沖洗干凈后，隨機(jī)選擇肉塊3 個不連續(xù)的位置，沿著肌肉纖維將pH計的頭部緩慢插入，待讀數(shù)穩(wěn)定后記錄每個成熟時間的pH值，pH值為3 次讀數(shù)的平均值。

1.3.7 HE染色

參考Zhang Jiaying等[15]的方法，并稍作修改。將1 g肉樣組織從4 %多聚甲醛固定液中取出，切片后乙醇梯度脫水，用HE染色1～3 min，二甲苯溶液中脫水透明，中性樹膠封片。在光學(xué)顯微鏡下采集照片，用Image-Pro plus軟件測量肌纖維橫截面積、直徑和細(xì)胞之間的空隙，每幅圖像至少選取30 個肌細(xì)胞測定。

1.3.8 剪切力測定

稱取肉樣60 g裝入蒸煮袋，置于80 ℃的恒溫水浴鍋中，待肉樣的中心溫度達(dá)到70 ℃時恒溫30 min，取出肉樣冷卻至室溫，立即使用嫩度儀進(jìn)行測定，單位為N。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛肉宰后成熟過程中NO含量的變化

動物屠宰后，組織在缺氧條件下會抑制一氧化氮合酶途徑產(chǎn)生NO，從而激活亞硝酸鹽還原途徑補(bǔ)充NO[16]。如圖1所示，在宰后成熟過程中NO含量隨著成熟時間的延長呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢（P＜0.05）。GSNO組NO的含量顯著高于對照組（P＜0.05），并在6 h達(dá)到最大值，是對照組的1.31 倍。宰后成熟至72 h，GSNO組NO含量為5.48 μmol/g，但仍顯著高于對照組（P＜0.05）。Hou Qin等[17]也研究報道，宰后牛肉中加入GSNO可以充分釋放NO，并在肌細(xì)胞中調(diào)控生化途徑，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。以上結(jié)果說明，宰后成熟過程中GSNO處理能夠提高宰后牦牛肉中NO水平。

圖1 宰后成熟過程中NO含量變化Fig.1 Changes in NO content during postmortem aging

2.2 牦牛肉宰后成熟過程中MAPK/ERK表達(dá)水平變化

MAPK/ERK信號通路是哺乳動物細(xì)胞中最重要的信號系統(tǒng)之一，在各種生理過程（如細(xì)胞增殖、凋亡和應(yīng)激）中發(fā)揮重要調(diào)控作用[18]。因此，為了探究該信號通路，加入了ERK1/2抑制劑（50 μmol/L）PD98059進(jìn)行了免疫印跡實(shí)驗(yàn)。如圖2A、B所示，3 個處理組的E R K 1/2 表達(dá)水平隨時間延長而增加（P＜0.05），并在24 h達(dá)到最大值，然后下降。其中，GSNO組的ERK1/2表達(dá)水平較對照組和GSNO+PD98059組顯著上調(diào)（P＜0.05），24 h分別增加15.1%和9.6%，表明宰后GSNO處理提高了NO水平后激活了胞漿中ERK1/2的表達(dá)，隨后迅速向細(xì)胞核內(nèi)遷移，從而使其表達(dá)量迅速提高[19]。此外，p-ERK1/2是ERK1/2的一種磷酸化形式。從圖2C、D看出，宰后成熟3～24 h內(nèi)3 個處理組的p-ERK1/2表達(dá)水平持續(xù)升高，同樣在24 h達(dá)到峰值（P＜0.05）。其中，GSNO組p-ERK1/2表達(dá)水平在24 h高于對照組33.2%（P＜0.05），與Zhu Xijin等[20]研究結(jié)果相似。然而，GSNO+PD98059處理減弱了上述效應(yīng)，表明在牦牛宰后成熟前期NO可能是MAPK/ERK信號通路的關(guān)鍵激活劑。徐世偉[21]報道加入PD98059抑制劑阻斷了缺氧處理6、16 h的Hep B3細(xì)胞中ERK的磷酸化水平，顯著降低了HIF-1α的活性。此外，Kasuno等[22]研究發(fā)現(xiàn)NO供體NOC18上調(diào)了HIF-1α的表達(dá)，同樣用MAPK抑制劑處理細(xì)胞后可阻斷NOC18對HIF-1α蛋白表達(dá)。上述結(jié)果研究發(fā)現(xiàn)，在宰后牦牛肉組織中可能存在NO/MAPK/ERK/HIF-1α級聯(lián)調(diào)節(jié)途徑。因此，后續(xù)測定了不同處理中HIF-1α表達(dá)量，試圖揭示NO通過MAPK/ERK信號通路對HIF-1α的影響。

圖2 宰后成熟過程中ERK1/2和p-ERK1/2表達(dá)水平變化Fig.2 Changes in ERK1/2 and p-ERK1/2 expression levels duringpostmortem aging

2.3 牦牛肉宰后成熟過程中HIF-1α表達(dá)水平的變化

HIF-1α作為調(diào)節(jié)機(jī)體能量代謝的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在宰后糖酵解中發(fā)揮著重要作用[11]。如圖3所示，3 個處理組中HIF-1α表達(dá)水平隨著成熟時間的延長均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢（P＜0.05），且GSNO組的表達(dá)水平顯著高于對照組（P＜0.05）。造成其原因是宰后由于牦牛屠宰后機(jī)體處于缺氧狀態(tài)，NO水平增加后迅速激活MAPK/ERK通路誘導(dǎo)其HIF-1α表達(dá)水平增加。其中，與對照組相比，GSNO組HIF-1α表達(dá)水平在3～12 h內(nèi)顯著升高（P＜0.05），并在12 h達(dá)到峰值，相比對照組，GSNO組HIF-1α表達(dá)水平分別增加了56.9%、52.3%、48.3%和52.2%（P＜0.05）。然而，GSNO+YC-1組在宰后12 h比GSNO組低27.4%（P＜0.05），可能是由于YC-1并不能完全消除NO對HIF-1α的影響，這表明其他途徑也可能參與了宰后肌肉中HIF-1α的激活。此外，Pan Yinghao等[23]采用熒光探針監(jiān)測發(fā)現(xiàn)缺氧條件下肝癌細(xì)胞HIF-1α表達(dá)水平的上調(diào)與NO有關(guān)。董越等[24]也報道了NO誘導(dǎo)激活星形膠質(zhì)細(xì)胞中HIF-1α的表達(dá)。但是，Sogawa等[25]研究發(fā)現(xiàn)，缺氧條件下NO抑制肝癌細(xì)胞系Hep3B中HIF-1α的表達(dá)，這與本研究結(jié)果相矛盾，這可能是因?yàn)榻M織類型差異導(dǎo)致，這有待進(jìn)一步探究。

圖3 宰后成熟過程中HIF-1α表達(dá)水平變化Fig.3 Changes in HIF-1α expression levels during postmortem aging

2.4 牦牛肉宰后成熟過程中糖酵解酶活性的變化

糖酵解酶類作為HIF-1α下游靶點(diǎn)結(jié)合位點(diǎn)，缺氧條件下啟動HIF-1α介導(dǎo)的糖酵解途徑[26]。HK、PK作為糖酵解途徑過程中的限速酶，不可逆地調(diào)節(jié)宰后肌肉的糖酵解反應(yīng)。此外，LDH在此過程中催化丙酮酸生成乳酸，也是糖酵解水平的關(guān)鍵標(biāo)志[27]。如圖4所示，隨著宰后成熟時間的延長，3 個處理組的HK、PK、LDH活性總體呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢（P＜0.05）。GSNO組在宰后3～9 h顯著激活HK活性（P＜0.05），并在9 h達(dá)到峰值，隨后成熟至72 h相比9 h降低了17.5%，與Chen Cheng 等[26]研究結(jié)果相似。GSNO組PK、LDH活性在3～72 h內(nèi)顯著高于對照組（P＜0.05），均在12 h達(dá)到峰值，與HK活性高峰時間出現(xiàn)相比延遲了6 h，可能是因?yàn)镠IF-1α與靶點(diǎn)結(jié)合位點(diǎn)以及作用時間差不同所致[27]。然而，GSNO+YC-1組的糖酵解酶活性減弱，表明HIF-1α在調(diào)控糖酵解中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究表明，LDH表達(dá)增加是由HIF-1α上升引起的，這有助于糖酵解產(chǎn)物乳酸的生成[28]。黨永明等[29]研究大鼠心肌細(xì)胞發(fā)現(xiàn)糖酵解關(guān)鍵酶是HIF-1α的下游糖酵解靶點(diǎn)，缺氧環(huán)境中被HIF-1α激活表達(dá)，繼而啟動了糖酵解反應(yīng)。Brix等[8]也報道了NO通過激活糖酵解酶表達(dá)從而促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞中糖酵解水平的增加。因此，宰后成熟前期，NO通過上調(diào)HIF-1α表達(dá)水平進(jìn)一步調(diào)控牦牛肉中糖酵解酶的活性，啟動糖酵解。

圖4 宰后成熟過程中糖酵解酶活性變化Fig.4 Changes in glycolytic enzyme activities during postmortem aging

2.5 牦牛肉宰后成熟過程中糖酵解潛力變化

為了探究宰后NO/HIF-1α信號軸對牦牛肉糖酵解水平的影響，對糖原和乳酸含量進(jìn)行測定。如圖5A所示，3 個處理組中糖原含量隨著宰后成熟時間延長整體呈現(xiàn)下降的趨勢（P＜0.05）。宰后3～72 h GSNO組糖原含量顯著低于對照組，而GSNO+YC-1組糖原含量高于GSNO組（P＜0.05），是由于NO提高了糖酵解酶活性，糖酵解反應(yīng)加強(qiáng)，糖原消耗量增加，而YC-1部分抑制了HIF-1α的表達(dá)，與靶點(diǎn)結(jié)合變?nèi)酰沟锰墙徒馑俾式档?，糖原消耗量減少。乳酸是肌肉發(fā)生糖酵解的終產(chǎn)物，它的積累會引起肌肉內(nèi)環(huán)境發(fā)生變化[30]，如圖5B所示，與對照組相比，GSNO組在72 h顯著增加了24.2%（P＜0.05），而GSNO+YC-1組的乳酸含量相對于GSNO組顯著降低了12.6%（P＜0.05），與陳騁等[14]研究結(jié)果相似。從糖原和乳酸的含量可以估算出糖酵解潛力的變化，如圖5C所示，3 個處理組糖酵解潛力變化隨時間延長呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢（P＜0.05）。其中，GSNO組的糖酵解潛力在12 h達(dá)到最大值，與對照組相比增加了5.6%，與Chen Cheng等[26]最近的研究結(jié)果相似。此外，周曉黎等[31]發(fā)現(xiàn)在缺氧條件下抑制HIF-1α表達(dá)時，糖酵解信號分子表達(dá)降低，乳酸含量顯著下降。因此，宰后成熟前期，NO提高了HIF-1α表達(dá)水平進(jìn)而加速了牦牛肉的糖酵解反應(yīng)速率。

圖5 宰后成熟過程中糖酵解潛力變化Fig.5 Changes in glycolytic potential during postmortem aging

2.6 牦牛肉宰后成熟過程中pH值變化

如圖6所示，3 個處理組的pH值在3～24 h內(nèi)顯著下降（P＜0.05），72 h有所回升，推測原因可能是因?yàn)樘墙徒鉂摿υ?2 h有所降低，糖酵解供能效果減弱，肌質(zhì)網(wǎng)中Ca2+大量釋放到肌漿中，從而導(dǎo)致鈣蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶等蛋白水解活化，分解肌間蛋白，產(chǎn)生的堿性物質(zhì)使得pH值上升[30]。此外，GSNO組的pH值在3～24 h內(nèi)顯著低于對照組（P＜0.05），而GSNO+YC-1組在宰后成熟至6～9 h顯著高于GSNO組，與Yang Yayuan等[2]研究結(jié)果相似。宰后由于缺氧，糖酵解成為了細(xì)胞主要提供能量的途徑，該過程會產(chǎn)生ATP以及生成丙酮酸及乳酸，并且ATP水解產(chǎn)生的磷酸以及乳酸的積累會促使pH值下降，而YC-1抑制了HIF-1α表達(dá)水平，使得GSNO+YC-1組pH值有所上升。鄭曉寒[32]提出極限pH值由宰后初始糖酵解反應(yīng)（糖酵解限速酶活性、糖原、乳酸含量）決定的。陳騁等[14]也研究發(fā)現(xiàn)宰后成熟初期牛肉糖酵解潛力顯著升高，促使牛肉pH值在短期內(nèi)快速下降并達(dá)到極限pH值，采用YC-1抑制HIF-1α表達(dá)后，能夠減弱HIF-1α對牛肉糖酵解進(jìn)程。因此，在宰后成熟前期，NO通過上調(diào)HIF-1α表達(dá)水平進(jìn)而加速糖酵解的發(fā)生，促使pH值降低。

圖6 宰后成熟過程中pH值變化Fig.6 Changes in pH during postmortem aging

2.7 牦牛肉宰后成熟過程中嫩度的變化

2.7.1 肌細(xì)胞形態(tài)變化

為了評估宰后牦牛肉嫩度，采用HE染色測定宰后牦牛肉的肌原纖維形態(tài)的變化。組織結(jié)構(gòu)圖成像如圖7所示，肌原纖維橫截面積和直徑隨著宰后成熟時間延長呈逐漸減小的趨勢，則肌纖維之間的空隙逐漸增大，與李喬等[33]研究結(jié)果相似。Hopkins等[34]提出，肌肉結(jié)構(gòu)的變化和肌纖維蛋白的變性程度決定了肉的最終嫩度。這包括相關(guān)的肌纖維蛋白的裂解，如肌動蛋白和肌球蛋白，而一些特定的肌纖維細(xì)胞骨架蛋白，如肌聯(lián)蛋白、肌間線蛋白也被降解。而嫩化就是尸僵發(fā)生后一定時間內(nèi)肌纖維碎裂，肌肉重新變軟、嫩度增加的過程[27]。由表1可知，宰后成熟3、9、12、24 h，GSNO組肌細(xì)胞之間的空隙顯著大于對照組（P＜0.05），說明GSNO處理可以在宰后前期使牦牛肉肌纖維加速降解，改善嫩度。然而，GSNO+YC-1組的肌纖維間隙在9、12 h顯著高于GSNO組（P＜0.05），表明YC-1抑制HIF-1α表達(dá)水平，減弱糖酵解速率，使肌纖維降解程度減緩。由此可見，激活NO水平后上調(diào)HIF-1α表達(dá)量，加速糖酵解的發(fā)生，使得牦牛肉肌原纖維降解加快，從而在宰后前期改善牦牛肉嫩度。

圖7 宰后成熟過程中HE染色肌細(xì)胞形態(tài)變化（×200）Fig.7 Morphological changes of muscle cells stained by HE during postmortem aging (×200)

2.7.2 剪切力變化

如圖8所示，3 個處理組的剪切力值隨時間變化，呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢（P＜0.05）。與對照組相比，宰后6～24 h，GSNO處理后牦牛肉的剪切力顯著降低（P＜0.05），分別降低了11.8%、14.3%、18.5%、10.2%。與pH值相似，加入YC-1后，宰后牦牛肉剪切力值顯著上升（P＜0.05）。宰后72 h，剪切力降低，說明糖酵解進(jìn)程加快，縮短了宰后僵直時間。研究表明，糖酵解是改善肌肉嫩度的重要生化途徑，糖酵解速度快的肌肉剪切力值較低[26]。此外，本研究結(jié)果與Cook等[35]研究結(jié)果相似，他們發(fā)現(xiàn)宰后2 h向牛肉中注射NO激活劑會導(dǎo)致肌肉變嫩，而在同一時間段內(nèi)注射NO抑制劑會導(dǎo)致肉變硬。然而，Liu Rui等[36]研究發(fā)現(xiàn)40 μL/L和60 μL/L NO處理增強(qiáng)了豬肉的嫩度，而80 μL/L NO處理組嫩度反而降低，推測這可能與NO的濃度有關(guān)。Sun Lina等[37]研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加1%L-精氨酸（NO底物）后羔羊肉屠宰后嫩度顯著增加。綜上，在宰后成熟前期，NO介導(dǎo)HIF-1α表達(dá)進(jìn)而改善了牦牛肉嫩度。

圖8 宰后成熟過程中剪切力變化Fig.8 Changes in shear force during postmortem aging

2.8 牦牛肉宰后成熟過程中NO含量、MAPK/ERK通路水平、HIF-1α表達(dá)量、糖酵解水平、pH值以及剪切力之間的相關(guān)性分析

由表2可知，宰后成熟3～72 h內(nèi)牦牛肉HIF-1α表達(dá)量與N O 含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與嚴(yán)潔萍[9]的研究結(jié)果相似。其次HIF-1α表達(dá)量與ERK1/2、p-ERK1/2表達(dá)量，HK、PK、LDH活性呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與pH值呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）。此外，NO含量與ERK、p-ERK表達(dá)量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與HK、PK、LDH活性呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與剪切力呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。ERK1/2表達(dá)量與p-ERK1/2表達(dá)量，HK、PK、LDH活性，剪切力呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與pH值呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）。p-ERK表達(dá)量與HK、PK、LDH活性，pH值呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）。HK活性與PK、LDH活性以及GP活性呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與pH值呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）。PK活性與LDH活性呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。GP活性與pH值呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），剪切力與pH值呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）。

表2 宰后成熟過程中各指標(biāo)之間的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis between various tested indicators during postmortem aging

相關(guān)性分析結(jié)果表明NO可以通過MAPK信號通路顯著上調(diào)HIF-1α表達(dá)量，并且可以激活下游糖酵解通量，進(jìn)而改善牦牛肉嫩度。研究表明，MAPK/ERK1/2信號通路是NO下游信號分子，通常通過磷酸化和增加核易位參與調(diào)節(jié)HIF-1α水平[38]，與本研究結(jié)果相似。此外，宰后成熟過程中采用NO供體處理牦牛肉后，p-ERK1/2表達(dá)量與HIF-1α表達(dá)量顯著升高，通過介導(dǎo)MAPK/ERK通路促使HIF-1α與下游糖酵解關(guān)鍵酶結(jié)合，激活糖酵解關(guān)鍵酶活性表達(dá)，增加糖酵解潛力。此外，糖酵解反應(yīng)加劇，乳酸大量積累，使得pH值在24 h內(nèi)顯著下降，剪切力降低。因此，牦牛肉宰后成熟過程中外源性NO能夠上調(diào)HIF-1α表達(dá)量從而在宰后前期激活糖酵解間接影響肌肉pH值，改善嫩度。綜上，NO調(diào)控MAPK/ERK-HIF-1α的級聯(lián)反應(yīng)可能是引起宰后糖酵解的關(guān)鍵因素，對于改善牦牛肉嫩度具有潛在的調(diào)控作用。

3 結(jié)論

綜上，在宰后成熟過程中，NO介導(dǎo)MAPK/ERK信號通路上調(diào)HIF-1α表達(dá)水平，進(jìn)而促進(jìn)HIF-1α下游靶點(diǎn)HK、PK、LDH活性，導(dǎo)致糖原快速消耗和乳酸的積累，使得pH值加速下降，糖酵解水平增加，使得宰后牦牛肉肌原纖維降解加快進(jìn)而改善了牦牛肉嫩度。因此，NO介導(dǎo)HIF-1α可能作為影響宰后牦牛肉品質(zhì)的一個潛在調(diào)控途徑，這給宰后成熟過程中牦牛肉嫩度的改善提供了一定的理論依據(jù)和新的思路。