余曉靜, 張望明, 賀天輝, 劉小花,艾海鋒, 安麗君, 楊留啟, 潘衛(wèi)東, 劉杰麟,5***

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 免疫學(xué)教研室, 貴州 貴陽 550025; 2.九江學(xué)院附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科, 江西 九江 332000; 3.德江縣民族中醫(yī)院 檢驗(yàn)科, 貴州 銅仁 565200; 4.貴州大學(xué) 藥學(xué)院, 貴州 貴陽 550025; 5.貴州醫(yī)科大學(xué) 省部共建藥用植物功效與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 貴州 貴陽 550014)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率居女性惡性腫瘤之首,呈逐年上升的趨勢(shì),并且趨于年輕化[1]。其中不表達(dá)雌激素受體、孕激素受體及人表皮生長(zhǎng)因子受體-2(human epidermal growth factor receptor 2,HER-2)的乳腺癌稱為三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC),占所有乳腺癌的 15%～20%,對(duì)內(nèi)分泌治療及 HER-2 的靶向治療往往不敏感,積極研制新型靶向治療藥物是臨床科研中亟待解決的問題。多倍體巨瘤細(xì)胞(polyploid giant cancer cells, PGCCs)是導(dǎo)致實(shí)體瘤異質(zhì)性的一類特殊的癌細(xì)胞亞群,在多種癌癥細(xì)胞中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了PGCCs 的存在,顯示出與腫瘤直接的相關(guān)性[2],且PGCCs及其子代細(xì)胞參與了上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相關(guān)癌癥侵襲和轉(zhuǎn)移的發(fā)生,與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移及治療耐藥相關(guān)[3]。有研究表明,PGCCs具有腫瘤干細(xì)胞的特性,能夠表達(dá)腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物白細(xì)胞分化抗原44(cluster of differentiation 44,CD44)和白細(xì)胞分化抗原133(cluster of differentiation 133,CD133)[4],并可在體外形成球型體,導(dǎo)致免疫缺陷小鼠體內(nèi)產(chǎn)生腫瘤[5]。在耐藥性方面,已有研究表明PGCCs對(duì)包括阿霉素、長(zhǎng)春花堿及紫杉醇(paclitaxel,PTX)在內(nèi)的常規(guī)化療藥物具有抵抗能力,PGCCs可以在這些藥物的極端劑量中存活,半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50)值是其親本細(xì)胞的10倍以上[6]。為了治療腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,必須消除促轉(zhuǎn)移、耐藥及腫瘤生長(zhǎng)的PGCCs,所以尋找PGCCs的治療靶標(biāo)就顯得尤為關(guān)鍵。Bloom(BLM) DNA 解旋酶作為人類RecQ家族解旋酶中的重要成員,參與了DNA的修復(fù)、復(fù)制及重組等過程,在維持端粒和染色體的穩(wěn)定性中發(fā)揮著重要作用[7],且與乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌及卵巢癌等發(fā)生發(fā)展有著重要的關(guān)系[8]。此外,亦有研究顯示,小分子ML216 可抑制高表達(dá)BLM DNA解旋酶的癌細(xì)胞增殖[9]。漢防己乙素是從防己科植物粉防己的根中提取的單體化合物,具有抗炎鎮(zhèn)痛、降血壓等藥理作用[10]。有研究表明,漢防己乙素可通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞周期、促進(jìn)凋亡相關(guān)基因的表達(dá),對(duì)肝癌、胰腺癌等多種腫瘤細(xì)胞具有明顯的抑制作用[11]。PGCCs是以有絲分裂失敗導(dǎo)致內(nèi)復(fù)制或者細(xì)胞間的融合形成的單個(gè)巨核或者多核的細(xì)胞, BLM DNA解旋酶參與了DNA代謝的各個(gè)過程,但是目前尚無其與PGCCs相互關(guān)聯(lián)的報(bào)道。本研究擬探討B(tài)LM DNA解旋酶是否能夠成為抑制PGCCs及其子代細(xì)胞的有效靶點(diǎn),尋找有效的小分子化合藥物,從而為臨床治療TNBC提供新的思路及線索。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1細(xì)胞及動(dòng)物來源 TNBC MDA-MB-231細(xì)胞和MDA-MB-436細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫;6周齡雌性無特定病原體(specific pathogen free, SPF)級(jí)無胸腺BALB/c裸鼠12只,體質(zhì)量18～20 g,購自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司。本研究獲學(xué)校動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[2200073,動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK(京)2019-0010]。

1.1.2主要試劑 漢防己乙素衍生物L(fēng)YY-47由貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供[純度>95%,配制溶劑為二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)],PTX(大連美侖公司),BLM特異性抑制劑ML216(美國APExBIO公司),L15培養(yǎng)基(上海中喬新舟公司),胎牛血清(以色列BI公司),1%青霉素鏈霉素雙抗、胰蛋白酶(美國Gibco公司),胰島素(武漢普諾賽公司),蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin,H&E)染色試劑盒、噻唑藍(lán)(thiazolyl blue tetrazolium bromide,MTT)試劑、蛋白Marker、抗熒光衰減封片劑含4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)、中性樹膠、0.1%結(jié)晶紫染液、3,3-二氨基聯(lián)苯胺鹽酸鹽(3,3-N-diaminobenzidine tertrahydrochloride,DAB)顯色試劑盒(北京索萊寶公司),細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒、Annexin V-FITC/碘化丙啶(propidium iodide,PI)凋亡試劑盒(杭州聯(lián)科公司),二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒(江蘇碧云天公司),細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1(cyclin dependent kinase 1,CDK1)抗體、細(xì)胞周期蛋白B1(cell cycle protein B1 ,cyclin B1)抗體、Rad51抗體、BCL2-相關(guān)X蛋白(Bcl-2-associated X protein,Bax)抗體、B淋巴細(xì)胞瘤蛋白-2 (B-cell lymphoma protein2,Bcl-2)抗體、裂解凋亡蛋白酶-3(cleaved Caspase-3)抗體、裂解凋亡蛋白酶-8(cleaved Caspase-8)抗體(成都正能生物公司),CD44抗體、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白-67(cell cycle regulatory proteins-67,Ki-67)抗體(北京博奧森公司),乙醛脫氫酶1A1(acetaldehyde dehydrogenase1A1,ALDH1A1)抗體、乳腺癌易感基因1(breast cancer susceptibility gene 1,BRCA1)抗體(美國Proteintech公司),CD133抗體、磷酸化組蛋白2AX(phosphorylation of histone 2AX,γ-H2AX)抗體(武漢博士德生物公司),BLM抗體(美國Santa公司),甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體、辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的山羊抗兔抗體和抗鼠抗體、異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)標(biāo)記的山羊抗鼠抗體(武漢塞維爾公司)。

1.1.3主要儀器 正置熒光顯微鏡、倒置熒光顯微鏡(日本Nikon公司),凝膠成像系統(tǒng)(上海天能公司),超微量微孔板分光光度計(jì)(美國biotek 公司),水平電泳儀(北京六一儀器廠),流式細(xì)胞儀(安捷倫生物公司)。

1.2 研究方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) MDA-MB-231細(xì)胞使用L15培養(yǎng)基培養(yǎng),添加10%胎牛血清和1%青霉素鏈霉素雙抗;MDA-MB-436細(xì)胞使用L15培養(yǎng)基培養(yǎng),添加20%胎牛血清和1%青霉素鏈霉素雙抗以及20 U/100 mL胰島素完全培養(yǎng)基。

1.2.2PGCCs的形成 取“1.2.1”項(xiàng)下2種細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時(shí),加500 nmol/L PTX培養(yǎng)18 h,更換為不含PTX的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),每3 天換液1次。

1.2.3H&E染色和PGCCs的計(jì)數(shù) 取“1.2.1”項(xiàng)下2種細(xì)胞以8×104個(gè)/孔接種于預(yù)先放入細(xì)胞爬片的24孔板中,誘導(dǎo)其形成PGCCs,每隔1天取出對(duì)應(yīng)培養(yǎng)時(shí)間的細(xì)胞爬片;4%多聚甲醛固定細(xì)胞10 min,加蘇木素染液染色5 min,水洗;加伊紅染液染色1 min,稍稍水洗;自然晾干,中性樹膠封片;高倍鏡下(400×)選擇5個(gè)視野進(jìn)行PGCCs計(jì)數(shù),計(jì)算PGCCs平均數(shù)量并繪制PGCCs的形成曲線。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 收集“1.2.1”項(xiàng)下MDA-MB-231細(xì)胞和“1.2.2”項(xiàng)下PGCCs子代細(xì)胞,以3×105個(gè)/孔均勻鋪于6孔板;設(shè)置對(duì)照組(0.00 μmol/L或DMSO)、LYY-47(6.50 μmol/L)給藥組,ML216(25 μmol/L、50 μmol/L及100 μmol/L)給藥組,處理48 h; 收集各組細(xì)胞,1 000 r/min 離心 5 min,棄上清液,PBS洗滌;加 DNA Staining solution 1 mL和Permeabilization solution 10 μL ,混勻;室溫避光孵育 30 min,通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析。

1.2.5Western blot檢測(cè)周期相關(guān)蛋白(CDK1、CyclinB1)、干性相關(guān)蛋白(ALDH1A1、CD44、CD133)、DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白(BLM、Rad51、BRCA1)及凋亡相關(guān)蛋白(Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-8)的表達(dá) 收集“1.2.1”項(xiàng)下對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞和“1.2.2”項(xiàng)下PGCCs子代細(xì)胞 ,以3×105個(gè)/孔均勻鋪于6孔板;設(shè)置對(duì)照組(0.00 μmol/L)、LYY-47(5.00 μmol/L)給藥組,加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液(RIPA Lysis Buffer)裂解細(xì)胞,4 ℃低溫12 000 r/min離心15 min,取上清移至新的EP管;BCA法測(cè)定蛋白的濃度后將剩余蛋白與5×上樣緩沖液按4∶1的比例加樣混勻,100 ℃水浴加熱10 min;所得蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis,SDS-PAGE)分離,電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜;5%脫脂奶粉封閉2 h,分別加入對(duì)應(yīng)的 CDK1、CyclinB1、ALDH1A1、CD44、CD133、BLM、Rad51、BRCA1、Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-8抗體,4 ℃冰箱孵育過夜;三乙醇胺緩沖鹽水溶液/吐溫(tris buffered saline/ Tween,TBS/T)洗膜后根據(jù)一抗的來源分別加入對(duì)應(yīng)的山羊抗鼠或者山羊抗兔二抗,室溫?fù)u床孵育2 h;TBST洗膜,使用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence,ECL)顯影。

1.2.6MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 收集“1.2.1”項(xiàng)下對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞和“1.2.2”項(xiàng)下PGCCs子代細(xì)胞,按照1.0×104/孔的密度接種于96孔板;設(shè)置對(duì)照組(0.00 μmol/L)、LYY-47(1.25 μmol/L、2.50 μmol/L、5.00 μmol/L、10.00 μmol/L、20.00 μmol/L及30.00 μmol/L)給藥組、ML216(6.25 μmol/L、12.50 μmol/L、25.00 μmol/L、50.00 μmol/L及100.00 μmol/L)給藥組;培養(yǎng)特定時(shí)間后取出培養(yǎng)板,每孔加培養(yǎng)基100 μL 和MTT試劑10 μL ,避光孵育 4 h,每孔加入二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)150 μL,37 ℃搖床上充分溶解結(jié)晶10 min,酶標(biāo)儀于490 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的光密度(optical density,OD)值。

1.2.7克隆形成實(shí)驗(yàn) 收集“1.2.1”項(xiàng)下對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞和“1.2.2”項(xiàng)下PGCCs子代細(xì)胞,計(jì)數(shù)后以800個(gè)/孔接種于6孔板;設(shè)置對(duì)照組(0.00 μmol/L)、LYY-47(0.25 μmol/L、0.50 μmol/L及0.75 μmol/L)給藥組、ML216(0.625 μmol/L、1.250 μmol/L及2.500 μmol/L)給藥組。繼續(xù)培養(yǎng)12 d,終止培養(yǎng),期間每2～3 天換液1次;棄原有培養(yǎng)液,PBS洗滌細(xì)胞2次;4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞20 min,PBS洗滌2次;0.1%結(jié)晶紫染液染色20 min,自來水沖洗;空氣干燥,拍照,使用Image J軟件計(jì)數(shù)細(xì)胞集落數(shù)。

1.2.8細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)γ-H2AX的表達(dá) 收集“1.2.1”項(xiàng)下對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的的MDA-MB-231細(xì)胞和“1.2.2”項(xiàng)下PGCCs子代細(xì)胞,以8×104個(gè)/孔接種于預(yù)先放入細(xì)胞爬片的24孔板中,待細(xì)胞長(zhǎng)至合適的融合度后,4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞20 min,0.3% Triton X-100室溫透化細(xì)胞20 min;5%山羊血清室溫封閉20 min;洗滌后加鼠抗γ-H2AX抗體(1∶400稀釋),放入濕盒,4 ℃冰箱孵育過夜;洗滌,加FITC標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(1∶100稀釋),37 ℃溫箱避光孵育30 min;洗滌,滴加適量含DAPI的封片劑于載玻片上,蓋上爬片,讓細(xì)胞接觸封片液,使用正置熒光顯微鏡觀察拍照。

1.2.9熒光偏振實(shí)驗(yàn)檢測(cè)漢防己乙素衍生物對(duì)BLM DNA 解旋酶酶活性的影響 反應(yīng)緩沖液(20 mmol/L Tris、25 mmol/L NaCl、3 mmol/L MgCl2、0.1 mmol/L DTT及pH 7.9)中加2 nmol/L熒光標(biāo)記DNA [dsDNA或ssDNA (21 nt)],檢測(cè)熒光各向異性值,直至穩(wěn)定;加不同濃度(0.00～6.67 μ mol/L)漢防己乙素衍生物,檢測(cè)熒光各向異性值,直至其穩(wěn)定;加500 nmol/L BLM642-1290DNA解旋酶,使DNA底物浸泡后檢測(cè)熒光各向異性值,直至其穩(wěn)定;記錄熒光各向異性值。漢防己乙素衍生物對(duì)BLM642-1290DNA解旋酶解鏈的影響采用相同的方法,漢防己乙素衍生物終濃度調(diào)整為0.00～33.34 μmol/L,最后加終濃度為0.2 mmol/L的腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)。

1.2.10ML216對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞形成PGCCs的影響 收集“1.2.1”項(xiàng)下對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞,以3×105個(gè)/孔均勻鋪于6孔板,隔天細(xì)胞貼壁后,將細(xì)胞分為對(duì)照組、PTX組、ML216組及ML216+PTX組, ML216組和ML216+PTX組分別加3 μmol/L 的ML216,對(duì)照組和 PTX 組分別加入同等體積的完全培養(yǎng)基;各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h至細(xì)胞融合度達(dá)80%～90%后,PTX組加500 nmol/L PTX、ML216組加3 μmol/L ML216及ML216+PTX組分別加PTX和ML216至PTX藥物終濃度為500 nmol/L ,ML216藥物終濃度為3 μmol/L,對(duì)照組加入同等體積的完全培養(yǎng)基;置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h,無菌PBS輕輕洗滌2次, ML216組和ML216+PTX組加3 μmol/L ML216、對(duì)照組和PTX組加同等體積的完全培養(yǎng)基;繼續(xù)培養(yǎng)9 d,期間每2～3 天進(jìn)行換液;到達(dá)培養(yǎng)時(shí)間后, PBS洗滌細(xì)胞2次,4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞20 min,0.1%結(jié)晶紫染液染色20 min,自來水沖洗,使用Image J軟件計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)。

1.2.11流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集“1.2.1”項(xiàng)下MDA-MB-231細(xì)胞和“1.2.2”項(xiàng)下PGCCs子代細(xì)胞,以3×105個(gè)/孔均勻鋪于6孔板;設(shè)置對(duì)照組(0.00 μmol/L)、LYY-47(2.50 μmol/L、5.00 μmol/L及6.50 μmol/L)給藥組,處理48 h;不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化收集細(xì)胞(包括培養(yǎng)上清中的細(xì)胞),預(yù)冷 PBS 離心洗滌2次;雙蒸水稀釋 5×Binding Buffer 為 1×工作液,取1×Binding Buffer 500 μL重懸各組細(xì)胞;每管加Annexin V-FITC 5 μL 和 PI 10 μL,吸頭吹吸混勻,室溫避光孵育 5 min,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.2.12皮下成瘤動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 裸鼠皮下分別注射5×106個(gè)“1.2.1”項(xiàng)下的MDA-MB-231細(xì)胞和“1.2.2”項(xiàng)下誘導(dǎo)形成的PGCCs子代細(xì)胞,每隔3天測(cè)量1次腫瘤體積,測(cè)量29 d,頸椎脫臼處死裸鼠,剝離腫瘤,稱重并拍照;剝離的腫瘤組織浸泡于4%多聚甲醛制作石蠟切片,H&E染色和免疫組織化學(xué)染色觀察細(xì)胞形態(tài)并檢測(cè)BLM與Ki-67的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 PTX誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞形成PGCCs及其子代細(xì)胞

人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞和MDA-MB-436細(xì)胞經(jīng)500 nmol/L PTX處理18 h,更換不含PTX的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞,鏡下發(fā)現(xiàn)單個(gè)巨核或者多核的PGCCs;MDA-MB-231細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)20～25 d時(shí)觀察到細(xì)胞通過出芽的方式產(chǎn)出了子代細(xì)胞,至27～35 d時(shí)產(chǎn)生了更多的子代細(xì)胞群體。誘導(dǎo)MDA-MB-436細(xì)胞形成PGCCs后,繼續(xù)培養(yǎng)9 d時(shí),PGCCs同樣通過出芽的方式產(chǎn)出了子代細(xì)胞,至15～35 d時(shí),子代細(xì)胞群體明顯,H&E染色計(jì)數(shù)了PTX處理后35 d內(nèi)PGCCs百分比的變化情況,并繪制了MDA-MB-231 PGCCs的形成曲線,可以看到PTX處理后的20 d內(nèi), PGCCs的百分比逐漸增加,比例達(dá)100%后保持穩(wěn)定;產(chǎn)生子代細(xì)胞后,PGCCs的百分比開始下降,直至趨于0%。見圖1。

注：A為MDA-MB-231細(xì)胞、MDA-MB-436細(xì)胞與各自 PGCCs及其子代細(xì)胞的形態(tài)(H&E,×400),B為500 nmol/L PTX處理MDA-MB-231細(xì)胞后產(chǎn)生PGCCs的定量結(jié)果。

2.2 細(xì)胞周期和細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)

與未經(jīng)誘導(dǎo)的細(xì)胞相比,MDA-MB-231細(xì)胞來源的PGCCs S期(P<0.01)和G2/M期細(xì)胞增加(P<0.05),其子代細(xì)胞則S期細(xì)胞增加(P<0.01),但G2/M期細(xì)胞減少(P<0.01);PGCCs 中G2/M期周期蛋白CDK1和CyclinB1表達(dá)均下調(diào)(P<0.05),子代細(xì)胞中的表達(dá)則上調(diào)(P<0.05)。見圖2。

注：A為細(xì)胞周期圖,B為細(xì)胞周期分布的定量結(jié)果,C、D為MDA-MB-231細(xì)胞和PGCCs及其子代細(xì)胞中CDK1、CyclinB1蛋白的表達(dá)及定量結(jié)果;與MDA-MB-231細(xì)胞組比較,(1)P<0.01,(2)P<0.05。

2.3 干性相關(guān)蛋白的表達(dá)和增殖能力

與MDA-MB-231細(xì)胞比較,PGCCs及其子代細(xì)胞中干性相關(guān)蛋白ALDH1A1、CD44及CD133表達(dá)上調(diào)(P<0.05),PGCCs子代細(xì)胞的增殖和克隆形成能力增強(qiáng)(P<0.05),PGCCs子代細(xì)胞中DNA損傷標(biāo)志物γ-H2AX的表達(dá)上調(diào)(P<0.01)。見圖3。

注：A為MDA-MB-231細(xì)胞和PGCCs及其子代細(xì)胞中CD44、ALDH1A1、CD133的表達(dá),B為干性相關(guān)蛋白定量結(jié)果,C為細(xì)胞克隆形成圖,D為MDA-MB-231細(xì)胞與PGCCs子代細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,E為細(xì)胞克隆形成數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果,F為MDA-MB-231細(xì)胞與PGCCs子代細(xì)胞中DNA損傷標(biāo)志物γ-H2AX的表達(dá)(免疫熒光染色,×400),G為γ-H2AX熒光強(qiáng)度的定量結(jié)果;與MDA-MB-231細(xì)胞組比較,(1)P<0.01, (2)P<0.05。

2.4 BLM DNA解旋酶對(duì)PGCCs形成的影響

檢測(cè)MDA-MB-231細(xì)胞和PGCCs子代細(xì)胞中DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白的表達(dá),結(jié)果顯示,PGCCs子代細(xì)胞中DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白BLM、Rad51、BRCA1的表達(dá)均上調(diào)(P<0.05);進(jìn)一步研究了藥物抑制BLM DNA解旋酶對(duì)PGCCs形成的影響,在用PTX誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞形成PGCCs的過程中加入BLM DNA解旋酶抑制劑ML216,結(jié)果顯示,與PTX組相比,PTX+ML216組PGCCs的形成數(shù)目明顯減少(P<0.01)。見圖4。

注：A、B為Western blot檢測(cè)MDA-MB-231細(xì)胞與PGCCs子代細(xì)胞中BLM、Rad51及BRCA1蛋白的表達(dá)及定量結(jié)果,C為PGCCs形成數(shù)目的結(jié)晶紫染色圖(40×),D為PGCCs形成數(shù)目的統(tǒng)計(jì)結(jié)果;(1) 與MDA-MB-231細(xì)胞組比較,P<0.05;(2)與500 nmol/L PTX組比較,P<0.01。

2.5 MDA-MB-231細(xì)胞和PGCCs子代細(xì)胞的裸鼠成瘤能力

檢測(cè)MDA-MB-231細(xì)胞和PGCCs子代細(xì)胞的裸鼠成瘤能力,結(jié)果顯示,PGCCs子代細(xì)胞組瘤體的體積和重量均極明顯高于MDA-MB-231細(xì)胞組(P<0.001),PGCCs子代細(xì)胞組的腫瘤生長(zhǎng)速度也明顯快于MDA-MB-231細(xì)胞組(P<0.01);PGCCs子代細(xì)胞組中BLM、增殖相關(guān)蛋白Ki-67均呈高表達(dá)(P<0.01)。見圖5。

注：A為MDA-MB-231細(xì)胞與PGCCs子代細(xì)胞小鼠移植瘤模型示意圖,B為裸鼠瘤體照片,C為腫瘤最終瘤體重量統(tǒng)計(jì)結(jié)果, D為腫瘤體積生長(zhǎng)曲線,E為H&E染色和免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)圖(紅色箭頭所指為Ki-67陽性細(xì)胞,DAB顯色,200×),F為Ki-67陽性細(xì)胞統(tǒng)計(jì)結(jié)果;與MDA-MB-231細(xì)胞組比較,(1)P<0.001,(2)P<0.01。

2.6 漢防己乙素衍生物L(fēng)YY-47對(duì)BLM642-1290DNA解旋酶的酶活性及蛋白表達(dá)的影響

檢測(cè)LYY-47對(duì) BLM642-1290DNA解旋酶酶活性的影響,結(jié)果顯示,LYY-47能夠使得BLM642-1290DNA解旋酶的DNA結(jié)合活性、ATPase活性及解鏈活性下調(diào);且LYY-47作用于MDA-MB-231細(xì)胞和PGCCs子代細(xì)胞后,細(xì)胞中DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白BLM、Rad51、BRCA1的表達(dá)均下調(diào)(P<0.05)。見圖6。

注：A為L(zhǎng)YY-47 對(duì) dsDNA 的影響及BLM DNA解旋酶與 dsDNA 復(fù)合物的熒光各向異性值, B為 LYY-47 與 dsDNA 結(jié)合后對(duì)其與BLM DNA解旋酶 結(jié)合活性的影響,C 為 LYY-47對(duì) ssDNA的影響及BLM DNA解旋酶與 ssDNA復(fù)合物的熒光各向異性值,D為L(zhǎng)YY-47與 ssDNA結(jié)合后對(duì)其與 BLM DNA解旋酶結(jié)合活性的影響,E為L(zhǎng)YY-47對(duì)BLM DNA解旋酶ATPase活性的影響,F為 LYY-47對(duì)BLM DNA解旋酶解鏈活性的影響,G為L(zhǎng)YY-47對(duì) BLM DNA解旋酶解鏈時(shí)間曲線的影響, H、I為L(zhǎng)YY-47藥物處理后,MDA-MB-231細(xì)胞和PGCCs子代細(xì)胞中BLM、Rad51、 BRCA1蛋白的表達(dá)及定量結(jié)果; A0 為 LYY-47 -DNA 復(fù)合物的熒光各向異性值,A1為BLM-LYY-47-DNA 復(fù)合物的熒光各向異性值,A2為加入終濃度0.2 mmol/L ATP 后反應(yīng)體系的熒光各向異性值;與對(duì)照組比較,(1)P<0.001,(2)P<0.01,(3)P<0.05。

2.7 LYY-47和ML216對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞和其PGCCs子代細(xì)胞增殖和克隆形成的影響

檢測(cè)LYY-47和ML216對(duì)正常乳腺上皮MCF-10A細(xì)胞、MDA-MB-231細(xì)胞和PGCCs子代細(xì)胞增殖和克隆形成能力的影響,結(jié)果顯示,不同濃度的LYY-47和ML216作用于MCF-10A細(xì)胞、MDA-MB-231細(xì)胞和PGCCs子代細(xì)胞后,細(xì)胞的增殖和克隆形成能力下調(diào)(P<0.05)。見圖7。

注：A、B、C為L(zhǎng)YY-47處理后MCF-10A細(xì)胞、MDA-MB-231細(xì)胞及PGCCs子代細(xì)胞的OD值,D為L(zhǎng)YY-47對(duì)MCF-10A細(xì)胞、MDA-MB-231細(xì)胞及PGCCs子代細(xì)胞增殖抑制的IC50, E、F為ML216處理后對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞和PGCCs子代細(xì)胞的OD值, G、H、I 為L(zhǎng)YY-47對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞、PGCCs子代細(xì)胞克隆形成能力的檢測(cè)結(jié)果和定量結(jié)果(結(jié)晶紫染色),J、K及L為ML216對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞、PGCCs子代細(xì)胞克隆形成能力的檢測(cè)結(jié)果和定量結(jié)果(結(jié)晶紫染色);與對(duì)照組比較,(1)P<0.05,(2)P<0.01,(3)P<0.001;(4) 與MCF-10A細(xì)胞比較,P<0.001。

2.8 LYY-47對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞和PGCCs子代細(xì)胞周期的影響

檢測(cè)LYY-47對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞和其PGCCs子代細(xì)胞周期的影響,結(jié)果顯示,LYY-47能夠使得MDA-MB-231細(xì)胞和PGCCs子代細(xì)胞G2 /M 期細(xì)胞數(shù)量增多(P<0.05),S 期細(xì)胞數(shù)量減少(P<0.05),將細(xì)胞阻滯于 G2/M期;與對(duì)照組相比,LYY-47給藥組CDK1 與 CyclinB1 的表達(dá)水平均被明顯抑制了(P<0.05)。見圖8。

注：A、B為L(zhǎng)YY-47處理后MDA-MB-231細(xì)胞和PGCCs子代細(xì)胞周期的檢測(cè)結(jié)果和定量結(jié)果,C、D為MDA-MB-231細(xì)胞和PGCCs子代細(xì)胞中細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CDK1、CyclinB1的表達(dá)和定量結(jié)果;與對(duì)照組比較, (1)P<0.05,(2)P<0.01。

2.9 ML216對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞和PGCCs子代細(xì)胞周期的影響

檢測(cè)ML216對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞和其PGCCs子代細(xì)胞周期的影響,結(jié)果顯示,不同濃度ML216能夠引起MDA-MB-231細(xì)胞和PGCCs子代細(xì)胞G1期細(xì)胞數(shù)量的增加(P<0.05),使得細(xì)胞難以進(jìn)入S期,S期細(xì)胞數(shù)量減少(P<0.05)。見圖9。

注：A、B為ML216處理后MDA-MB-231細(xì)胞和PGCCs子代細(xì)胞周期的檢測(cè)結(jié)果和定量結(jié)果;與DMSO組比較,(1)P<0.01,(2)P<0.05,(3)P<0.001。

2.10 LYY-47對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞和PGCCs子代細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

檢測(cè)LYY-47對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞和其PGCCs子代細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,LYY-47給藥組的細(xì)胞總凋亡比例(總凋亡率=晚期細(xì)胞凋亡率+早期細(xì)胞凋亡率)增加(P<0.05);實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞經(jīng)5 μmol/L LYY-47處理48 h后,檢測(cè)各組凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá);結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,LYY-47給藥組細(xì)胞中Bax、cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-8的表達(dá)均上調(diào)(P<0.05),Bcl-2的表達(dá)則下調(diào)(P<0.05)。見圖10。

注：A、B為MDA-MB-231細(xì)胞和PGCCs子代細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果和定量結(jié)果,C、D為MDA-MB-231細(xì)胞和PGCCs子代細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3 及cleaved Caspase-8的表達(dá)和定量結(jié)果;與對(duì)照組比較, (1)P<0.05,(2)P<0.001。

2.11 BLM DNA解旋酶對(duì)PGCCs及其子代細(xì)胞的影響

通過PTX誘導(dǎo)人乳腺癌MDA-MB-231/436細(xì)胞形成的PGCCs及其子代細(xì)胞的性狀以及LYY-47對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞及其PGCCs子代細(xì)胞的影響總結(jié)如圖11所示。

注：↑表示上調(diào),↓表示下調(diào)。

3 討論

以往研究表明,癌癥復(fù)發(fā)往往是耐藥亞群在初始治療后重新產(chǎn)生腫瘤的結(jié)果,而PGCCs就是這樣一個(gè)耐藥亞群,最近研究已證實(shí)其在癌癥進(jìn)展中的相關(guān)性和重要性,它是導(dǎo)致實(shí)體瘤異質(zhì)性的一類特殊的癌細(xì)胞亞群,治療壓力會(huì)誘導(dǎo)形成PGCCs,且PGCCs可通過不對(duì)稱分裂產(chǎn)生具有治療抗性的子代細(xì)胞[2,12-13]。本研究中,通過500 nmol/L PTX誘導(dǎo)TNBC MDA-MB-231和MDA-MB-436細(xì)胞產(chǎn)生PGCCs,并觀察到了PGCCs子代細(xì)胞的產(chǎn)生;采用H&E染色對(duì)PGCCs進(jìn)行染色,根據(jù)Zhang等[14]對(duì)PGCCs的定義對(duì)PGCCs進(jìn)行計(jì)數(shù),并計(jì)算百分比,繪制了PGCCs的形成曲線;與MDA-MB-231細(xì)胞相比,PTX誘導(dǎo)MDA-MB-436細(xì)胞形成的PGCCs 數(shù)量較少,因此,目前沒有展開深入的研究。通過流式細(xì)胞術(shù)對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞、PGCCs以及 PGCCs子代細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期分析,進(jìn)一步證實(shí)了PGCCs表現(xiàn)為多倍體和非整倍體以及經(jīng)歷了G2/M期阻滯,PGCCs產(chǎn)生的子代細(xì)胞又回歸了二倍體屬性。CyclinB1 與 CDK1 是調(diào)控細(xì)胞周期 G2/M 期的核心蛋白,在DNA合成的后期細(xì)胞由S期向G2/M期過渡過程中依賴于CyclinB1 與 CDK1形成的復(fù)合物的調(diào)控,驅(qū)動(dòng)G2期到M期的轉(zhuǎn)換[15]。結(jié)果顯示,與MDA-MB-231細(xì)胞相比,PGCCs 中CyclinB1 與 CDK1表達(dá)下調(diào),PGCCs子代細(xì)胞中CyclinB1 與 CDK1表達(dá)則上調(diào),這與流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果相符合。

PGCCs的形成會(huì)發(fā)生去分化和向胚胎階段的逆轉(zhuǎn)[16]。PGCCs符合癌癥干細(xì)胞的定義,在調(diào)節(jié)人實(shí)體瘤細(xì)胞之間的異質(zhì)性、干性和化學(xué)抗性中起著基本作用[17]。結(jié)果顯示,PGCCs及其子代細(xì)胞中腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD44、ALDH1A1及CD133表達(dá)均上調(diào)。有研究應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分選出CD44+CD24-/low細(xì)胞亞群,并通過NOD/SCID小鼠成瘤實(shí)驗(yàn),確定了CD44/CD24是乳腺癌腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)志物[18],但也有文獻(xiàn)報(bào)道CD24在乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中不表達(dá)[19],因此在本研究中未進(jìn)行CD24的相關(guān)實(shí)驗(yàn)。應(yīng)激壓力使細(xì)胞發(fā)生內(nèi)復(fù)制或者細(xì)胞間的融合產(chǎn)生PGCCs,PGCCs在經(jīng)歷G2/M周期阻滯后能夠產(chǎn)生具有治療抗性、惡性程度更高的子代細(xì)胞[20]。研究結(jié)果顯示,PGCCs子代細(xì)胞較MDA-MB-231細(xì)胞增殖、克隆形成能力均明顯增強(qiáng)。γ-H2AX是DNA雙鏈斷裂(double-strand break,DSB) 的早期標(biāo)志物,在無明顯DSB的情況下,γ-H2AX也與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[21]。結(jié)果顯示,PGCCs子代細(xì)胞中γ-H2AX的表達(dá)較MDA-MB-231細(xì)胞上調(diào)。綜上結(jié)果表明,通過細(xì)胞內(nèi)復(fù)制或者細(xì)胞間融合形成的PGCCs具有腫瘤干細(xì)胞特性,能夠通過不對(duì)稱分裂產(chǎn)生惡性程度更高的子代細(xì)胞,且PGCCs及其子代細(xì)胞與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

目前研究認(rèn)為,有絲分裂失敗是PGCCs形成的一個(gè)重要的原因[22],因此本研究探討了PGCCs及其子代細(xì)胞與BLM DNA解旋酶之間可能存在的關(guān)聯(lián)。本研究檢測(cè)了MDA-MB-231細(xì)胞和PGCCs子代細(xì)胞中BLM、BRCA1及Rad51蛋白表達(dá),結(jié)果顯示,PGCCs子代細(xì)胞較MDA-MB-231細(xì)胞BLM、BRCA1及Rad51蛋白表達(dá)均上調(diào);隨后檢測(cè)了BLM DNA解旋酶特異性抑制劑ML216對(duì)PGCCs形成的影響,在PTX誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞形成PGCCs的過程中加入ML216,結(jié)果顯示,ML216能夠抑制PGCCs的形成,使得PGCCs形成的數(shù)量明顯減少;體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明,PGCCs子代細(xì)胞的裸鼠成瘤能力較MDA-MB-231細(xì)胞明顯增強(qiáng),腫瘤組織中BLM和Ki-67均呈高表達(dá);本課題組前期研究表明,漢防己甲素衍生物HL-42和HL-49能夠抑制TNBC MDA-MB-231細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)其凋亡[23]。在本研究中,以抑制BLM DNA解旋酶的酶活性為靶點(diǎn)對(duì)漢防己乙素衍生物進(jìn)行篩選,通過熒光偏振實(shí)驗(yàn)篩選出漢防己乙素衍生物L(fēng)YY-47對(duì)BLM DNA 解旋酶的酶活性具有顯著的抑制作用,且 LYY-47能夠抑制MDA-MB-231細(xì)胞和PGCCs子代細(xì)胞中BLM、Rad51及BRCA1蛋白的表達(dá)。

大量研究表明,細(xì)胞周期失調(diào)是惡性腫瘤細(xì)胞的重要特征之一,使得細(xì)胞具有無限增殖的能力,最終導(dǎo)致腫瘤的形成[24]。已有文獻(xiàn)報(bào)道,BLM DNA解旋酶與細(xì)胞周期具有重要關(guān)系,抑制BLM DNA解旋酶能夠有效提高PC3細(xì)胞在G0/G1期的細(xì)胞數(shù)量[8]。本研究檢測(cè)了LYY-47和ML216對(duì)MDA-MB-231和PGCCs子代細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響,設(shè)置了不同藥物濃度梯度作用于MDA-MB-231和PGCCs子代細(xì)胞,結(jié)果顯示LYY-47和ML216能夠濃度依賴地抑制MDA-MB-231和PGCCs子代細(xì)胞的增殖以及克隆形成;在此基礎(chǔ)上,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)了LYY-47和ML216對(duì)MDA-MB-231和PGCCs子代細(xì)胞周期的影響,結(jié)果顯示不同濃度的ML216能夠有效提高M(jìn)DA-MB-231和PGCCs子代細(xì)胞G1期的細(xì)胞數(shù)量,G1期細(xì)胞數(shù)目增多,細(xì)胞難以進(jìn)入S期,S期細(xì)胞減少,提示在ML216的干擾下,能夠抑制MDA-MB-231和PGCCs子代細(xì)胞的增殖;LYY-47可導(dǎo)致MDA-MB-231和PGCCs子代細(xì)胞S期細(xì)胞減少,G2/M期細(xì)胞明顯增加,細(xì)胞被阻滯于G2/M期,因此LYY-47可引起MDA-MB-231細(xì)胞和PGCCs子代細(xì)胞G2/M期的阻滯,從而抑制細(xì)胞的增殖。進(jìn)一步通過蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LYY-47對(duì)細(xì)胞周期G2/M期相關(guān)蛋白CDK1、CyclinB1表達(dá)的影響,結(jié)果顯示,LYY-47藥物處理組MDA-MB-231細(xì)胞和PGCCs子代細(xì)胞中CDK1、CyclinB1的表達(dá)均被顯著抑制了。同時(shí)也發(fā)現(xiàn),相同濃度的情況下,LYY-47和ML216對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的增殖抑制以及克隆形成抑制要強(qiáng)于對(duì)PGCCs子代細(xì)胞,而對(duì)PGCCs子代細(xì)胞的周期影響則強(qiáng)于對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞。

已有文獻(xiàn)報(bào)道,BLM DNA 解旋酶在DNA 損傷修復(fù)中起著重要作用[25]。本課題組前期研究表明,沉默BLM DNA解旋酶能夠?qū)е翫NA損傷增加,從而促進(jìn)細(xì)胞的凋亡[26]。本研究中,使用不同濃度LYY-47處理MDA-MB-231和PGCCs子代細(xì)胞后,細(xì)胞凋亡率增加,Bax、cleaved Caspase-3及cleaved Caspase-8表達(dá)上調(diào), Bcl-2表達(dá)下調(diào),提示LYY-47能夠濃度依賴的誘導(dǎo)MDA-MB-231和PGCCs子代細(xì)胞發(fā)生凋亡。相同濃度的情況下,LYY-47對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的促凋亡作用要強(qiáng)于對(duì)PGCCs子代細(xì)胞,表明PGCCs子代細(xì)胞可能更具有藥物治療抗性。

綜上所述,本研究表明,BLM DNA 解旋酶可能參與了PGCCs的形成過程,LYY-47可通過抑制BLM DNA解旋酶誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和阻滯細(xì)胞周期,從而影響PGCCs子代細(xì)胞的增殖。