李陽昱 李慶蓉 陳孝紅 薛麗 和平安 呂梅 楊旭

摘要：綠原酸是植物體在有氧呼吸過程中經(jīng)莽草酸途徑合成的一種苯丙素類物質(zhì)，自然存在于多種中藥材和食物中，杜仲、金銀花和咖啡等植物中含量較高，具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗癌和免疫調(diào)節(jié)等多種藥理活性。近年來，綠原酸作為研究活性物質(zhì)的焦點(diǎn)之一，因其抗菌譜廣，對(duì)多種細(xì)菌和真菌均有較好的抗菌活性，故綠原酸對(duì)臨床菌株的抗菌作用逐漸被重視和研究。本文綜述了近年來國內(nèi)外關(guān)于綠原酸對(duì)多種致病菌的抗菌作用及機(jī)制的研究進(jìn)展，旨在為綠原酸抗菌作用的深入研究提供參考，為臨床抗感染治療和控制帶來新思路，有助于綠原酸在醫(yī)藥領(lǐng)域的開發(fā)。

關(guān)鍵詞：綠原酸；活性多酚；抗菌作用；臨床耐藥菌；機(jī)制

中圖分類號(hào)：R966文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Advances in research on the antibacterial effects and mechanism of chlorogenic acid

Abstract Chlorogenic acid （CGA） is a phenylpropyl substance synthesized by shikimic acid pathway in plants during aerobic respiration. It naturally exists in a variety of Chinese medicinal materials and foods， with relatively high contents in Eucommia ulmoides， honeysuckle， coffee and other plants， which have various pharmacological activities such as antibacterial， anti-inflammatory， antioxidation， anticancer and immune regulation. In recent years， as one of the focal points of research on active substances， CGAs antibacterial effect on clinical strains has been gradually paid attention to and studied due to its wide antibacterial spectrum and good antibacterial activity against a variety of bacteria and fungi. This study summarized recent developments in research on the antibacterial action and mechanism of CGA against a variety of pathogenic bacteria both at home and abroad， aiming to provide a reference for further research on the antibacterial activity of CGA， bring new ideas for clinical anti-infection treatment and control， and contribute to the development of CGA in the field of medicine.

Key words Chlorogenic acid; Active polyphenol; Antibacterial effects; Clinical drug resistant bacteria; Mechanism

近年來，隨著長期抗生素的過度使用，臨床出現(xiàn)多重耐藥菌，常與高發(fā)病率和高死亡率密切相關(guān)。傳統(tǒng)抗生素有效性下降，新抗生素研發(fā)慢且細(xì)菌易獲得耐藥性，加大了臨床抗感染治療的難度，因此，迫切需要尋找潛在的抗生素替代藥物。綠原酸（chlorogenic acid， CGA） （圖1）是由咖啡酸和奎寧酸縮合而成的縮酚酸，又名咖啡鞣酸，是植物體在有氧呼吸過程中由肉桂酸和奎寧酸經(jīng)莽草酸途徑合成的一種苯丙素類物質(zhì)[1]。國內(nèi)外的研究發(fā)現(xiàn)CGA具有抗菌、抗炎、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)等多種藥理活

性[2-4]。CGA作為一種天然活性多酚，廣泛存在于各種植物中，在杜仲和金銀花中含量較為豐富，其他植物如咖啡、綠茶、蘋果和胡蘿卜中也有分布，廉價(jià)易得，副作用小。CGA抗菌譜廣且抗菌機(jī)制復(fù)雜多樣，對(duì)多種常見致病菌有較好的抗菌作用，但是關(guān)于CGA抗菌作用及機(jī)制的研究進(jìn)展鮮有報(bào)道，本文綜述近年來國內(nèi)外關(guān)于CGA抗菌作用及機(jī)制的研究進(jìn)展，以期為臨床抗菌藥物的研發(fā)提供新思路。

1 CGA的抗菌作用

1897年科學(xué)家發(fā)現(xiàn)向日葵籽中含有一種物質(zhì)，可以導(dǎo)致向日葵籽蛋白變黑；1909年經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)證明了此化合物就是CGA；1947年Nelson和Rudkin通過研究首次確定CGA的化學(xué)結(jié)構(gòu)，是一種由咖啡酸和奎寧酸形成的酯[5]。目前已有大量研究證明CGA對(duì)多種致病菌有廣譜抗菌活性，包括革蘭陰性菌，如大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、鼠傷寒沙門菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、痢疾志賀菌、嗜麥芽窄食單胞菌，以及革蘭陽性菌，如金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌、化膿鏈球菌、肺炎鏈球菌

等[6-10]，見表1。2005年，屈景年等[7]從金銀花中提取CGA后，通過平板法測定抑菌圈大小確定了CGA對(duì)大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌有較好的抗菌活性，抑菌圈直徑與CGA濃度呈正相關(guān)，且抗金黃色葡萄球菌的活性較大腸埃希菌強(qiáng)。元超等[8]從艾納香中分離出CGA成分，通過微量稀釋法測定最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）顯示，CGA對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌有較強(qiáng)的抗菌活性，MIC值均為64 ?g/mL，優(yōu)于大腸埃希菌（MIC>

128 ?g/mL）。Su等[9]研究了銅綠假單胞菌對(duì)CGA的敏感性，發(fā)現(xiàn)經(jīng)CGA處理后，銅綠假單胞菌的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）含量降低，其內(nèi)膜通透性增高，致使重要內(nèi)容物被釋出，最終引起細(xì)菌死亡。CGA可通過誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)代謝失衡抑制枯草芽孢桿菌生長[11]，影響化膿性鏈球菌中的脂質(zhì)代謝和清除活性氧（reactive oxygen species， ROS）[12]。Primavilla等[13]還發(fā)現(xiàn)從藏紅花瓣中提取的CGA對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌、肉毒梭菌和艱難梭菌有抗菌作用。

更為重要的是，已有研究證明CGA對(duì)多重耐藥菌也有抗菌作用。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌、多重耐藥大腸埃希菌和多重耐藥銅綠假單胞菌是臨床常見的耐藥性致病菌，隨著細(xì)菌耐藥性日益嚴(yán)重，臨床可選擇的有效抗生素越來越少，而CGA抗耐藥菌活性的發(fā)現(xiàn)，為臨床尋找潛在的抗生素替代藥物帶來新思路。CGA的抗菌機(jī)制復(fù)雜多樣，首先，CGA直接靶向細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，損傷細(xì)胞表面，增加細(xì)胞膜通透性，這是CGA對(duì)不同細(xì)菌的共同作用機(jī)制；其次，CGA抑制耐藥菌生物膜形成，一定濃度的CGA及其代謝產(chǎn)物可抑制耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的生物膜形成并消除已成熟生物膜[14]，調(diào)節(jié)耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌和多重耐藥銅綠假單胞菌的群體感應(yīng)（quorum sensing，QS） 系統(tǒng)，降低胞外多糖和莢膜多糖（capsular polysaccharide，CPS ）的產(chǎn)生，抑制其生物膜形成[15-16]；最后，CGA靶向多重耐藥大腸埃希菌的外排泵并抑制其活性，下調(diào)耐藥性相關(guān)基因Tsr、Tar、CheA和CheW[17-18]，此外也有CGA抗β-內(nèi)酰胺酶活性的報(bào)道[19]，這些研究表明CGA能遏制細(xì)菌耐藥性發(fā)展，進(jìn)一步為臨床治療多重耐藥菌感染提供了新希望。以上研究還發(fā)現(xiàn)CGA可提高細(xì)菌對(duì)抗生素的敏感性，與抗生素聯(lián)合表現(xiàn)出協(xié)同抗菌作用，如在CGA治療多重耐藥大腸埃希菌引起的小鼠乳腺炎模型中，CGA聯(lián)合頭霉素C或者替米考星具有協(xié)同作用[20]，CGA與左氧氟沙星協(xié)同抵抗多重耐藥銅綠假單胞菌[21]，原因可能是CGA損傷細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)，破壞細(xì)胞完整性，促使足夠濃度的抗生素進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮抗菌效應(yīng)。此外，CGA還有抗真菌作用，并伴有一定的劑量效應(yīng)[22]。綜上，CGA作為天然活性分子，抗菌活性強(qiáng)，可緩解細(xì)菌耐藥性，具有作為新型抗菌藥物的潛力，有很大的臨床開發(fā)應(yīng)用價(jià)值。

2 CGA的抗菌機(jī)制

CGA的抗菌機(jī)制復(fù)雜多樣，一直是近年研究的熱點(diǎn)，已有大量研究證明了CGA對(duì)多種致病菌的抗菌機(jī)制，見圖2，據(jù)目前的研究結(jié)果主要總結(jié)為以下幾點(diǎn)。

2.1 抑制細(xì)菌生物膜形成

生物膜是細(xì)菌在相對(duì)惡劣的環(huán)境中形成的一種黏附在物體表面或氣-液交界面、以微菌落為基本單位的膜狀結(jié)構(gòu)，由細(xì)菌及其自身分泌的代謝產(chǎn)物（胞外多糖、蛋白質(zhì)、胞外DNA和脂質(zhì)等）組成，常定植于醫(yī)療設(shè)備和植入物，細(xì)菌從浮游狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樯锬顟B(tài)是一個(gè)受環(huán)境與遺傳因素高度調(diào)控的過程。生物膜形成后，為細(xì)菌提供營養(yǎng)和信息交流，可以逃避宿主免疫攻擊，使細(xì)菌難以被清除并長期持留在宿主內(nèi)形成慢性感染灶，造成持續(xù)的炎癥和組織損傷；生物膜還會(huì)阻止抗生素進(jìn)入細(xì)胞，使細(xì)菌衍生出較強(qiáng)的耐藥性，與浮游菌相比，生物膜保護(hù)的細(xì)菌對(duì)抗生素的耐藥性高出達(dá)1000倍[23]。CGA可通過多種途徑抑制生物膜形成，破壞其屏障作用，使足夠濃度的抗生素進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，具體機(jī)制如下。

2.1.1 下調(diào)生物膜形成相關(guān)基因的表達(dá)

細(xì)菌豐富的菌毛、CPS與LPS共同介導(dǎo)細(xì)菌與物體表面之間的相互作用，對(duì)維持生物膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和細(xì)胞間通訊至關(guān)重要。肺炎克雷伯菌生物膜形成較嚴(yán)重，其3型菌毛是一種由mrkABCDF操縱子編碼的蛋白質(zhì)，促進(jìn)細(xì)菌黏附于物體表面；treC基因通過調(diào)節(jié)CPS的產(chǎn)生在生物膜形成、初始黏附、表面定植和分散中發(fā)揮積極作用；wzm和wbbM是合成LPS的相關(guān)基因，有研究發(fā)現(xiàn)CGA通過下調(diào)mrkA、mrkD和wbbM基因的表達(dá)抑制生物膜形成[16]，且CGA處理后的所有測試菌株在定量和主觀上都顯示出生物膜表面積的顯著減少，進(jìn)一步證實(shí)了上述觀點(diǎn)[19]。此外，CPS的厚度能夠直接影響生物膜的成膜能力，CGA通過下調(diào)treC基因的表達(dá)抑制CPS合成[19]，Wang等[16]最新的研究發(fā)現(xiàn)在1/2或1/4×MIC CGA處理后，透射電鏡下發(fā)現(xiàn)肺炎克雷伯菌的莢膜變薄，經(jīng)掃描電鏡發(fā)現(xiàn)生物膜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)被破壞，菌落數(shù)量減少并出現(xiàn)分散，進(jìn)一步說明CGA對(duì)生物膜有破壞作用。AgrA蛋白是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌生物膜的關(guān)鍵蛋白，曾銘等[14]通過分子對(duì)接技術(shù)發(fā)現(xiàn)CGA的3種體內(nèi)代謝物苯甲酸、對(duì)香豆酸和對(duì)羥基苯甲酸可以結(jié)合在AgrA蛋白表面，占據(jù)DNA與AgrA蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，直接影響AgrA蛋白與DNA的識(shí)別，下調(diào)agrA基因，降低細(xì)菌致病性。

2.1.2 抑制QS系統(tǒng)

CGA還被認(rèn)為是1種有效的QS抑制劑。QS系統(tǒng)，是細(xì)菌群體密度信號(hào)的感受系統(tǒng)，是單個(gè)細(xì)菌為應(yīng)對(duì)外部環(huán)境，通過分泌自誘導(dǎo)信號(hào)分子相互溝通，協(xié)調(diào)和控制細(xì)菌群體中基因表達(dá)的信號(hào)和反應(yīng)；還能響應(yīng)種群密度的變化來調(diào)節(jié)生物學(xué)功能，以適應(yīng)環(huán)境變化，QS系統(tǒng)在生物膜形成全程發(fā)揮作用[24]。Las，Rhl和Pqs是銅綠假單胞菌3種主要的QS系統(tǒng)， CGA通過與這3種QS受體LasR，RhlR和PqsR形成氫鍵，干擾信號(hào)分子與其受體結(jié)合，下調(diào)QS系統(tǒng)本身及相關(guān)基因表達(dá)，減少外膜囊泡和外排DNA的分泌來抑制生物膜形成[15，24]。有研究通過計(jì)算建模進(jìn)一步驗(yàn)證了CGA代謝產(chǎn)物奎寧酸可與RhlR、RhlA和RhlB結(jié)構(gòu)上的芳香族氨基酸殘基形成5～10個(gè)氫鍵，與受體結(jié)構(gòu)上的一個(gè)口袋擬合，可能因抑制QS信號(hào)通路而降低鼠李糖脂含量，減弱對(duì)生物膜的固定、擴(kuò)散、“蘑菇帽”結(jié)構(gòu)形成和通道開放作用。此外，六元環(huán)周圍存在大量芳香族氨基酸殘基，在一定程度上限制了奎寧酸的分子流動(dòng)性，進(jìn)一步增強(qiáng)了與3種蛋白質(zhì)的結(jié)合親和力[21]。肺炎克雷伯菌QS系統(tǒng)中的AI-2信號(hào)分子在生物膜形成中起主要作用，其產(chǎn)生依賴于luxS基因，當(dāng) AI-2濃度達(dá)到閾值時(shí)，可觸發(fā)信號(hào)傳導(dǎo)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)CPS、LPS和菌毛等多種基因表達(dá)，啟動(dòng)生物膜的形成，誘導(dǎo)生物膜成熟[25]。有學(xué)者篩選了CGA抗肺炎克雷伯菌QS的生物活性，發(fā)現(xiàn)luxS基因表達(dá)不受CGA影響，說明CGA對(duì)肺炎克雷伯菌生物膜形成的抑制與LuxS-QS系統(tǒng)無關(guān)，而是受其他途徑調(diào)控[19]。還有研究發(fā)現(xiàn)，盡管CGA下調(diào)了耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌株（FK8002）中l(wèi)uxS的表達(dá)水平，但沒有顯著差異[16]，與上述觀點(diǎn)類似，這可能與菌株特性以及形成生物膜的能力有關(guān)系。CGA作為QS抑制劑的潛力已經(jīng)被證明，但是不同的細(xì)菌CGA抗QS的活性不同。未來研究還應(yīng)集中在CGA如何影響細(xì)菌生物膜空間結(jié)構(gòu)，以阻止有害細(xì)菌的群體感應(yīng)，促進(jìn)有益細(xì)菌的群體感應(yīng)。

2.1.3 抑制β內(nèi)酰胺酶活性

生物膜形成與某些耐藥菌產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶之間存在很大相關(guān)性，有報(bào)告表明，產(chǎn)生超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（extended-spectrum β-lactamase， ESBLs）的肺炎克雷伯菌比不產(chǎn)ESBLs的菌株形成更嚴(yán)重的生物膜，且耐藥性更普遍[26]。β-內(nèi)酰胺酶通過水解β-內(nèi)酰胺類抗生素賦予細(xì)菌耐藥性，Rajasekharan等[19]進(jìn)一步研究了CGA對(duì)β-內(nèi)酰胺酶的抑制活性，分子對(duì)接結(jié)果顯示CGA與巰基-可變-1β-內(nèi)酰胺酶的活性位點(diǎn)緊密結(jié)合，有效抑制β-內(nèi)酰胺酶活性，進(jìn)而影響生物膜形成。

由于細(xì)菌的持續(xù)存在，細(xì)菌生物膜很難根除，因此，有研究還同時(shí)評(píng)估了CGA去除成熟生物膜的能力，CGA對(duì)大多數(shù)細(xì)菌的成熟生物膜有明顯消除作用，并且呈劑量依賴性[14，27]，但是CGA清除肺炎克雷伯菌生物膜的能力較差，這可能與生物膜中存在持久耐藥性有關(guān)。

2.2 增加細(xì)胞膜通透性，破壞細(xì)胞完整性

Lou等[6]系統(tǒng)闡明了CGA對(duì)革蘭陰性菌的抗菌作用機(jī)理，革蘭陰性菌外膜中的LPS和蛋白質(zhì)通過與二價(jià)陽離子（如Mg2+等）的靜電作用維持在一起，而CGA表面負(fù)電荷通過靜電作用與LPS位點(diǎn)結(jié)合并螯合Mg2+，破壞外膜完整性，增加細(xì)胞膜通透性，使胞質(zhì)內(nèi)電解質(zhì)、ATP及可溶性蛋白、核酸、酶等大分子泄漏，然后使細(xì)胞膜去極化，最終細(xì)胞因失去維持膜電位和代謝產(chǎn)物的能力而死亡。同樣的，Chen[27]和Zhan等[18]的研究結(jié)果表明CGA因分子極性強(qiáng)，對(duì)脂質(zhì)等大分子物質(zhì)親和力高，能與細(xì)菌表面結(jié)合并改變其外膜結(jié)構(gòu)，從而增加膜通透性，使細(xì)胞內(nèi)重要物質(zhì)部分泄漏，進(jìn)而干擾蛋白質(zhì)合成；同時(shí)更容易使細(xì)胞外的有害物質(zhì)進(jìn)入，影響細(xì)胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，使細(xì)胞逐漸死亡，這與一些抗生素在細(xì)胞膜形成孔隙直接殺死細(xì)菌的方式不同。然而，關(guān)于CGA與細(xì)胞膜的哪些成分結(jié)合，如何發(fā)揮作用以及結(jié)合是否影響其他細(xì)胞代謝等還尚未有研究報(bào)道。

此外，CGA誘導(dǎo)大量β-半乳糖苷酶合成并泄漏至胞外，間接說明CGA改變了細(xì)胞膜通透性[28]。Ren等[29]通過楊氏模量和細(xì)菌彈簧常數(shù)K發(fā)現(xiàn)CGA處理后的細(xì)菌因細(xì)胞壁硬度降低而易變形，可能是因?yàn)镃GA對(duì)細(xì)胞膜有損傷，進(jìn)而引起膜通透性增加，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)成分泄漏，致使細(xì)胞內(nèi)膨脹壓力降低，細(xì)胞壁受到細(xì)胞膜的支撐減少，在外界壓力下容易發(fā)生變形。Su等[9]發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌經(jīng)CGA處理4～24 h后掃描電鏡發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表面出現(xiàn)凹陷和空洞，推測CGA可能誘發(fā)了細(xì)胞表面損傷，而細(xì)胞外蛋白質(zhì)含量增加、細(xì)胞內(nèi)ATP水平急劇下降均說明了CGA增加細(xì)胞內(nèi)膜的通透性，其后用熒光探針PI和cFDA 直接證明了上述結(jié)果。還發(fā)現(xiàn)CGA下調(diào)LPS合成相關(guān)基因LPxB和LPxC的表達(dá)，降低細(xì)胞外膜中LPS含量，可能通過擾亂LPS和磷脂之間的平衡，誘導(dǎo)外膜脫落，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡，這與Sun等[30]研究結(jié)果一致。最新關(guān)于沙門菌的研究進(jìn)一步證實(shí)了CGA損害細(xì)菌的細(xì)胞完整性，細(xì)菌細(xì)胞表現(xiàn)出變形和萎縮，關(guān)于CGA如何損壞細(xì)胞表面，該學(xué)者證明了細(xì)胞膜損傷與ROS無關(guān)，用DPH熒光偏振檢測細(xì)胞膜流動(dòng)性，發(fā)現(xiàn)CGA呈劑量依賴性方式誘導(dǎo)細(xì)胞膜流動(dòng)性顯著增加，表明CGA誘導(dǎo)細(xì)胞表面損傷可能與膜流動(dòng)性增加有關(guān)[31]。膜流動(dòng)性對(duì)細(xì)胞膜滲透作用至關(guān)重要，膜流動(dòng)性的突然變化會(huì)損害細(xì)胞膜的正常功能，而細(xì)胞膜脂質(zhì)雙分子層中磷脂具有物種特異性甚至菌株特異性，CGA對(duì)膜脂質(zhì)組成的影響以及CGA處理后LPS降低與膜流動(dòng)性增強(qiáng)是否存在相關(guān)性可能是一個(gè)值得探究的機(jī)制。

2.3 擾亂細(xì)胞代謝

CGA是一種酚類化合物，是酚類酶催化最適宜的反應(yīng)底物，它能影響相關(guān)代謝酶的活性，降低物質(zhì)和能量代謝水平，使代謝過程受阻，從而抑制細(xì)菌活性。三羧酸循環(huán)是3大營養(yǎng)物質(zhì)（蛋白質(zhì)，糖類，脂質(zhì)）提供和轉(zhuǎn)換能量的最終代謝途徑，其產(chǎn)生的乙酰輔酶A是三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵物質(zhì)。有研究發(fā)現(xiàn)CGA等酚酸類物質(zhì)影響大腸埃希菌的代謝水平，下調(diào)脂肪酸β氧化、苯丙氨酸和賴氨酸代謝途徑中的關(guān)鍵酶，阻礙乙酰輔酶A合成導(dǎo)致三羧酸循環(huán)受抑制，進(jìn)而中斷細(xì)菌的物質(zhì)轉(zhuǎn)化和能量代謝[18]。CGA還抑制蘋果酸脫氫酶和琥珀酸脫氫酶的活性，這是三羧酸循環(huán)和電子傳遞鏈中的2種主要代謝酶，最終因抑制了細(xì)胞存活的能量代謝導(dǎo)致細(xì)胞死亡[30]。在CGA對(duì)枯草芽孢桿菌抗菌活性的研究中，發(fā)現(xiàn)CGA誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ATP含量降低，這可能與CGA影響細(xì)胞代謝有關(guān)，進(jìn)一步代謝組學(xué)研究表明，CGA誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)三羧酸循環(huán)和糖酵解代謝失衡，導(dǎo)致細(xì)菌代謝紊亂，主要表現(xiàn)為CGA顯著降低三羧酸循環(huán)中檸檬酸、異檸檬酸和琥珀酸水平，以及糖酵解途徑中的葡萄糖6-磷酸和果糖1，6-二磷酸[11]。以上研究均表明CGA可以通過擾亂細(xì)胞代謝發(fā)揮抗菌作用。

2.4 調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

有學(xué)者驗(yàn)證了CGA通過上調(diào)lncRNA GAS5/miR-23a/PTEN軸調(diào)節(jié)p38 MAPK通路，促進(jìn)自噬并抑制鼠傷寒沙門菌感染，調(diào)節(jié)腸道炎癥因子平衡和減少腸道損傷[32]。同樣的，CGA通過抑制NLRP3炎癥小體活化，上調(diào)miR-124-3p表達(dá)并滅活p38MAPK途徑來下調(diào)肺炎克雷伯菌感染的炎癥水平，進(jìn)一步說明了CGA對(duì)細(xì)菌感染的保護(hù)作用[33]。此外，與常見的由ROS積累引起細(xì)菌凋亡的機(jī)制相反，由于CGA具有較強(qiáng)的抗氧化活性，可通過消耗細(xì)胞內(nèi)ROS來影響細(xì)胞代謝的信號(hào)通路，誘導(dǎo)細(xì)菌凋亡[34]。適當(dāng)水平的ROS在體內(nèi)穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮重要作用，ROS耗竭或過量積累時(shí)細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡被打破，影響細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙。

2.5 CGA的其他抗菌機(jī)制

最新研究報(bào)道，CGA可能作為一種活躍的外排泵抑制劑，AcrB是來自大腸埃希菌AcrAB-TolC藥物轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合物的膜蛋白，是評(píng)估外排泵抑制劑特征化合物的優(yōu)秀模型系統(tǒng)，分子對(duì)接技術(shù)結(jié)合分子動(dòng)力學(xué)模擬分析發(fā)現(xiàn)，CGA通過氫鍵與AcrB高親和力結(jié)合，形成穩(wěn)定的復(fù)合物來抑制外排泵表達(dá)，最大限度減少耐藥性；CGA還可能作為一種能量抑制劑，通過瞬時(shí)耗散膜電位抑制外排活動(dòng)，干擾維持外排泵功能所需的能量來抑制細(xì)菌外排泵系統(tǒng)[17]。CGA還可能下調(diào)多重耐藥大腸埃希菌的耐藥相關(guān)蛋白（Tsr、Tar、CheA和CheW）、外膜孔蛋白F（OmpF）和鞭毛蛋白（FliC），誘導(dǎo)細(xì)菌鞭毛脫落[18]，抑制鞭毛合成，減少鞭毛數(shù)量，使細(xì)菌形態(tài)變得更加光滑，降低細(xì)菌群集能力、生物膜穩(wěn)定性和細(xì)胞壁硬度[29]。SrtA是一種“管家”分選酶，介導(dǎo)多達(dá)19種表面蛋白與細(xì)胞壁的共價(jià)附著，對(duì)金黃色葡萄球菌定植和感染非常重要，Wang等[35]通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明了CGA能明顯抑制SrtA的催化活性，CGA通過氫鍵和疏水作用力與SrtA中C184和G192位點(diǎn)結(jié)合，阻止表面蛋白的分選信號(hào)進(jìn)入，有效抑制SrtA轉(zhuǎn)肽，降低細(xì)菌毒力，促進(jìn)細(xì)菌清除，而不會(huì)施加明顯的耐藥選擇性壓力，這表明CGA可作為SrtA抑制劑阻斷其活性來破壞細(xì)胞表面蛋白質(zhì)發(fā)揮抗菌作用。神經(jīng)氨酸酶是肺炎鏈球菌的關(guān)鍵毒力因子之一，可以去除宿主細(xì)胞表面聚糖中的唾液酸，暴露出某些受體，促進(jìn)細(xì)菌黏附和定植，Guan等[36]研究CGA對(duì)肺炎鏈球菌神經(jīng)氨酸酶的抑制作用顯示，CGA通過氫鍵，鹽橋和陽離子-π相互作用與A型神經(jīng)氨酸酶活性位點(diǎn)Arg347強(qiáng)力結(jié)合并形成帽狀結(jié)構(gòu)，抑制其活性，降低細(xì)菌毒力。此外，有研究證明CGA促進(jìn)小鼠肺泡巨噬細(xì)胞從MI型極化為M2型來緩解肺炎克雷伯菌誘導(dǎo)的炎癥，明顯提高小鼠生存率[37]。肺泡巨噬細(xì)胞是構(gòu)成關(guān)鍵的免疫效應(yīng)因子之一，肺炎克雷伯菌小鼠肺炎模型表明，耗竭肺泡巨噬細(xì)胞會(huì)加劇肺部感染[38]，而臨床上細(xì)菌感染的原因很大程度與患者免疫功能低下有關(guān)，因此，CGA可能具有通過調(diào)節(jié)宿主天然免疫功能增強(qiáng)抵抗細(xì)菌感染的潛力，但是關(guān)于CGA對(duì)宿主免疫功能的調(diào)節(jié)與抗菌作用的關(guān)系及具體機(jī)制還有待深入研究。

除了抗細(xì)菌作用，CGA還具有抗真菌活性，Martíne等[39]在2017年報(bào)道了CGA通過抑制真菌孢子的早期透膜化來控制不同植物病原真菌的生長，具有生物殺真菌劑的潛力。近年來學(xué)者更多關(guān)注CGA對(duì)唑類耐藥白念珠菌的抗菌作用及機(jī)制，ALS3是白念珠菌發(fā)病機(jī)制中與黏附和生物膜形成相關(guān)的重要蛋白質(zhì)，CGA與氟康唑耐藥白念珠菌的ALS3活性位點(diǎn)殘基相互作用，抑制其生物活性發(fā)揮抗生物膜作用[22]。CGA可誘導(dǎo)K+流出而促進(jìn)白念珠菌細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能為K+外流導(dǎo)致細(xì)胞體積調(diào)節(jié)功能失調(diào)，不能滿足細(xì)胞周期檢查點(diǎn)要求而誘導(dǎo) G2/M細(xì)胞周期停滯，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[40]。CGA的抗菌作用主要取決于其濃度，CGA抑制白念珠菌的MIC為

80 ?g/mL，雖然兩性霉素B（MIC值為10 ?g/mL）抗白念珠菌活性比CGA強(qiáng)，但兩性霉素 B 有較強(qiáng)的人紅細(xì)胞溶血活性而CGA沒有，并且還證明了40 ?g/mL的CGA能破壞菌絲和假菌絲，從而抑制白念珠菌的生長[41]。

3 CGA開發(fā)及應(yīng)用前景

CGA是許多中藥材、水果和蔬菜的主要活性成分，如杜仲、金銀花、向日葵、咖啡、蘋果、胡蘿卜、大豆和馬鈴薯等含量較高[1]。目前，已報(bào)道的用于CGA提取、分離和定量的制備方法包括水提法、有機(jī)溶劑提取法、酶解法、超臨界流體萃取法、微波輔助提取、紅外輔助提取、超高壓萃取、超聲輔助提取，以及逆流色譜，離心分配色譜，分子印跡聚合物和雙水相系統(tǒng)等。此外，還開發(fā)了NKA-9樹脂、 X-5樹脂和聚酰胺樹脂技術(shù)[42]。CGA的半水合物為白色或黃色針狀結(jié)晶體，在110 ℃狀態(tài)下會(huì)轉(zhuǎn)變成無水物，其在25 ℃水中的溶解度約4% ，易溶于極性溶劑如乙醇、 丙酮和甲醇，微溶于乙酸乙酯，難溶于氯仿、乙醚和苯等親脂性有機(jī)溶劑。CGA為極性有機(jī)酸，不太穩(wěn)定，在提取過程中易發(fā)生異構(gòu)化。隨著CGA的研究深入和制備技術(shù)的更新發(fā)展，極大提高了CGA的提取率和穩(wěn)定性，這將有助于更好地利用各種植物來源的CGA，進(jìn)而提高制藥行業(yè)中的潛在價(jià)值。

目前臨床抗致病菌感染以抗生素治療為主，但是細(xì)菌耐藥情況日益嚴(yán)重。CGA作為一種抗菌活性良好的綠色天然多酚，抗菌譜廣且不易耐藥。目前已有很多研究報(bào)道CGA通過納米復(fù)合技術(shù)、微膠囊化、納米包封和納米乳液優(yōu)化其生物活性和生物利用度，從而提高CGA的穩(wěn)定性和抗菌活性[43]。用CGA代替化學(xué)試劑合成抗菌功能的納米材料，克服了CGA水溶性低，很容易被體內(nèi)的蛋白質(zhì)滅活而影響藥物吸收和利用的局限，還能使CGA以足夠的濃度在細(xì)菌內(nèi)積累，有效發(fā)揮抗菌作用，且細(xì)胞毒性小。將CGA負(fù)載到分散性好、高水溶性和良好生物相容性的納米粒子或纖維上，表現(xiàn)出很強(qiáng)的抑菌作用和有效的生物活性，可以協(xié)同破壞細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜并抑制細(xì)菌生長，可能與CGA被釋放后穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，誘導(dǎo)ROS增加有關(guān)[44-45]。經(jīng)評(píng)估發(fā)現(xiàn)CGA沒有明顯的體內(nèi)毒性，不會(huì)造成內(nèi)臟器官損傷，這種修飾大大提高了CGA的水溶性和穩(wěn)定性，保護(hù)CGA不被蛋白質(zhì)滅活，并且提高其抗菌活性，目前已有應(yīng)用于腫瘤靶向治療的研究[46]。負(fù)載CGA的納米顆粒還可以延長CGA的釋放時(shí)間，減輕小鼠牙周炎的骨質(zhì)流失，并顯示出良好的生物相容性和生物安全性[47]。此外，含CGA的復(fù)合海藻酸鈉水凝膠/杜仲橡膠膜作為新型抗菌傷口敷料已有研究報(bào)道，體外對(duì)大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌具有抵抗作用，且可加速傷口愈合[48]。李肖寒等[49]研究發(fā)現(xiàn)利用水溶性天然高分子材料透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）與CGA形成的水溶性綴合物HA-CGA較CGA單體有較強(qiáng)的抗菌活性，大大提高CGA的水溶性和生物利用度，改善抗菌性能。盡管CGA在人類的利用、代謝和排泄方面存在較大的個(gè)體差異，這可能與劑量、模型、細(xì)胞類型、個(gè)體差異以及腸道微生物群等因素有關(guān)，但是許多基礎(chǔ)研究和臨床研究已證明CGA是一種抗菌活性好的天然化合物。

CGA可聯(lián)合抗生素發(fā)揮協(xié)同抗菌作用。有研究報(bào)道CGA聯(lián)合左氧氟沙星協(xié)同抑制生物膜形成，其抗菌效果比單獨(dú)使用更為顯著[50]。CGA破壞生物膜基質(zhì)中胞外多糖的結(jié)構(gòu)，使左氧氟沙星滲透到細(xì)菌生物膜的內(nèi)層，影響細(xì)菌生物膜形成的多種途徑和靶點(diǎn)，包括通過靜電干擾細(xì)菌和/或糖萼對(duì)基質(zhì)的黏附；激活或釋放相關(guān)胞外蛋白酶以破壞胞外多糖；抑制細(xì)菌核酸的合成，減少細(xì)胞外DNA的量；以及細(xì)菌生長固定期的殺菌作用[21]。有溴化乙錠積累和棋盤協(xié)同作用的測定結(jié)果表明，CGA聯(lián)合四環(huán)素對(duì)大腸埃希菌具有良好的協(xié)同作用，其FIC指數(shù)為0.25，這種協(xié)同作用直接將抗生素劑量減少了128倍[17]，一般抗生素?zé)o法穿透革蘭陰性菌完整的外膜，但當(dāng)CGA破壞細(xì)菌外膜完整性后，使細(xì)胞膜通透性增加，使足夠濃度的抗生素能夠穿透受損的外膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，發(fā)揮效應(yīng)。同樣地，CGA和唑類抗生素都對(duì)膜滲透性起作用，可協(xié)同抵抗白念珠菌，提高抗菌活性。因此，CGA聯(lián)合抗生素使用可以提高多重耐藥菌對(duì)抗生素的敏感性，使其最大程度殺滅細(xì)菌，減少耐藥性的產(chǎn)生，這表明CGA可能作為一種增強(qiáng)劑聯(lián)合抗生素協(xié)同抗菌。

4 小結(jié)與展望

4.1 小結(jié)

臨床上多重耐藥菌的出現(xiàn)和廣泛傳播是感染患者死亡的主要原因，尋找新型抗菌藥是研究的重點(diǎn)。近年來，越來越多的學(xué)者開始關(guān)注和研究CGA對(duì)臨床菌株和多重耐藥菌株的抗菌作用及機(jī)制，主要包括抑制細(xì)菌生物膜形成、增加細(xì)胞膜通透性和破壞細(xì)胞完整性、擾亂細(xì)胞代謝及調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等，而抗菌效果與CGA及其化合物濃度、處理時(shí)間和細(xì)菌耐藥性等直接相關(guān)。已有大量研究表明CGA聯(lián)合抗生素或者負(fù)載抗菌納米材料可以提高其生物活性和抗生素敏感性，最大限度地減少藥物毒性，限制耐藥性。加之CGA對(duì)細(xì)菌的選擇性壓力小，可以克服抗生素易產(chǎn)生耐藥性的缺點(diǎn)，更加堅(jiān)定了CGA可作為一種安全的抗菌藥物或佐劑治療和控制微生物感染，具有很高的臨床應(yīng)用價(jià)值。

4.2 展望

CGA是一種分布廣泛、抗菌活性好的天然化合物，主要來源于植物。而我國擁有豐富的CGA植物資源如金銀花、杜仲和向日葵等，但對(duì)其利用效率遠(yuǎn)落后于發(fā)達(dá)國家，且CGA的口服生物利用度低，靜脈注射可能產(chǎn)生過敏反應(yīng)。因此，對(duì)CGA的生物利用度、抗菌作用機(jī)制、毒理學(xué)和臨床研究等方面仍有待深入探索和完善。對(duì)于未來的研究應(yīng)主要從以下兩方面入手：一方面，應(yīng)該把握優(yōu)勢，合理利用豐富資源，發(fā)展CGA的提取純化技術(shù)，提高提取物功效，增加其穩(wěn)定性，促進(jìn)藥物的研發(fā)；另一方面，加大CGA對(duì)臨床菌株的抗菌作用研究，開發(fā)體外和體內(nèi)模型系統(tǒng)，對(duì)CGA進(jìn)行更多臨床藥理和安全性評(píng)估，同時(shí)進(jìn)行更多宿主免疫學(xué)研究，以確定CGA在動(dòng)物和人類中的最大有效和安全劑量，深入研究CGA及其代謝產(chǎn)物的抗菌機(jī)制。

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