陶鈺婷 吳敏佳

摘要?目的：探究鹽酸多奈哌齊（DPH）對血管性癡呆（VD）小鼠認(rèn)知功能障礙的影響及其作用機(jī)制。方法：75只雄性 C57BL/6小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為5組：假手術(shù)組（Sham組）、VD模型組、DPH組（VD＋DPH組）、DPH＋長鏈非編碼RNA-生長抑制特異性轉(zhuǎn)錄本5（lncRNA GAS5）無關(guān)片段組（VD＋DPH＋lncRNA GAS5 NC組）以及DPH＋lncRNA GAS5過表達(dá)組（VD＋DPH＋lncRNA GAS5 OVE組），每組15只。采用小鼠雙側(cè)頸總動脈縮窄法構(gòu)建VD模型。造模成功后2 d，DPH組小鼠給予DPH 1 mg/（kg·d）灌胃8周。Sham組和VD模型組小鼠給予等量的生理鹽水灌胃處理。VD＋DPH＋lncRNA GAS5 OVE組小鼠腦室注射lncRNA GAS5 （每只1 010 pfu）后構(gòu)建VD模型，2 d后給予DPH 1 mg/（kg·d）灌胃8周。VD＋DPH＋lncRNA GAS5 NC組小鼠腦室注射lncRNA GAS5 NC后構(gòu)建VD模型，2 d后給予DPH 1 mg/（kg·d）灌胃8周。 實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測腦組織中l(wèi)ncRNA GAS5表達(dá)水平；Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測各組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力；分光光度法測定腦組織丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）以及谷光甘肽過氧化物酶（GSH-Px）；酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）檢測血清白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）含量；蘇木素-伊紅（HE）染色觀察各組小鼠腦組織海馬區(qū)域病理學(xué)改變。結(jié)果：與Sham組相比，VD模型組小鼠腦組織lncRNA GAS5水平和MDA含量，血清IL-6、IL-1β和TNF-α含量均明顯升高（P＜0.01），學(xué)習(xí)記憶能力、SOD、GSH-Px含量明顯降低（P＜0.01），且海馬區(qū)域病理損傷明顯。與VD模型組相比，VD＋DPH組小鼠上述指標(biāo)均被明顯逆轉(zhuǎn)，海馬區(qū)域損傷減輕。與VD＋DPH組相比，VD＋DPH＋lncRNA GAS5 OVE組小鼠lncRNA GAS5水平和MDA含量，血清IL-6、IL-1β和TNF-α含量均升高（P＜0.01），學(xué)習(xí)記憶能力、SOD、GSH-Px含量明顯降低（P＜0.01），且海馬區(qū)域病理損傷加重。結(jié)論：DPH能夠改善VD小鼠認(rèn)知功能障礙和炎癥反應(yīng)，其機(jī)制與抑制lncRNA GAS5表達(dá)相關(guān)。

關(guān)鍵詞?血管性癡呆；認(rèn)知功能障礙；鹽酸多奈哌齊；炎癥反應(yīng)；長鏈非編碼RNA-生長抑制特異性轉(zhuǎn)錄本5

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.07.014

血管性癡呆（vascular dementia，VD）是指由多種腦血管疾病引起的腦部功能障礙進(jìn)而產(chǎn)生獲得性神經(jīng)功能損傷的綜合征［1］。研究證實(shí)VD作為老年癡呆的第二大形式，大約占癡呆性疾病的20%～30%［2-3］。伴隨人口老齡化的加劇，VD已經(jīng)逐漸成為我國老年性癡呆的最主要類型［4］。研究表明導(dǎo)致VD的主要因素為腦血管病變，如小血管病變、大動脈病變等。腦血管病變會進(jìn)一步引起控制學(xué)習(xí)、記憶功能的海馬神經(jīng)元缺血，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)元損傷和細(xì)胞凋亡，并最終引起癡呆［5-6］。鹽酸多奈哌齊（donepezil hydrochloride，DPH）是治療癡呆的一線藥物，可以通過增強(qiáng)膽堿能神經(jīng)功能發(fā)揮治療作用［7］。既往研究顯示，DPH能夠改善VD小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力障礙，其機(jī)制與抑制海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)相關(guān)［8］。但目前有關(guān)DPH對VD后認(rèn)知功能障礙以及炎癥反應(yīng)的影響尚不

完全清楚。長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類長度大于200 nt的非編碼RNA，可以通過多種方式參與細(xì)胞的生長和發(fā)育。長鏈非編碼RNA-生長抑制特異性轉(zhuǎn)錄本5（lncRNA GAS5）是由小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中分離鑒定出來的［9］。研究表明，lncRNA GAS5是與神經(jīng)功能損傷密切相關(guān)的一類lncRNA。在缺血性腦卒中病人和PC12細(xì)胞缺氧復(fù)氧后lncRNA GAS5表達(dá)顯著升高［10］。另外，研究還發(fā)現(xiàn)，降低腦部lncRNA GAS5表達(dá)可以降低腦梗死體積，改善神經(jīng)功能［11］。以上研究提示lncRNA GAS5的高表達(dá)可能是促進(jìn)神經(jīng)功能損傷的重要調(diào)控因子。但是有關(guān)lncRNA GAS5對VD小鼠神經(jīng)功能障礙和炎癥反應(yīng)的影響尚不完全清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)擬通過構(gòu)建VD小鼠模型，觀察DPH能否通過調(diào)控lncRNA GAS5改善VD小鼠神經(jīng)功能障礙和炎癥反應(yīng)。

1?材料與方法

1.1?實(shí)驗(yàn)動物

雄性C57BL/6小鼠75只，體質(zhì)量20～22 g，6～8周齡，實(shí)驗(yàn)動物由南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物學(xué)部提供［合格證號：SCXK（蘇）2018-0001］，該實(shí)驗(yàn)通過了我院動物實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，動物實(shí)驗(yàn)遵循3R原則。

1.2?藥品與試劑

DPH粉末（SELLECK公司，純度≥99，批號：120011-70-3）；蘇木素-伊紅（HE）染色液（碧云天生物技術(shù)公司生產(chǎn)，批號：C0105S）；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）以及谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）測定試劑盒（南京建成生物工程有限公司生產(chǎn)）；白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測試劑盒（批號：RAB0311）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）ELISA檢測試劑盒（批號：RAB0277）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA檢測試劑盒（批號：RAB0479）購自美國Sigma公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測試劑盒（江蘇Solarbio公司，批號：SR1110）；引物設(shè)計(jì)［生工生物工程（上海）股份有限公司］。

1.3?儀器

高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司生產(chǎn)，型號：G22-W型）；多功能酶標(biāo)儀（Thermo賽默飛世爾科技公司生產(chǎn)，型號：SuPerMax 3000FA型）；細(xì)胞組織渦旋儀（武漢維塞爾生物科技有限公司生產(chǎn)，型號：M371450型）；TC-XDS-500C型熒光倒置顯微鏡（日本/奧林巴斯Olympus）；免疫印跡（Western Blotting）檢測裝置（美國Bio-Rad伯樂公司生產(chǎn)）；GoodLook-1000型成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad伯樂公司生產(chǎn)）。

1.4?方法

1.4.1?動物造模與分組

將75只雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham組）、VD模型組、DPH組（VD＋DPH組）、DPH＋lncRNA GAS5無關(guān)片段組（VD＋DPH＋lncRNA GAS5 NC組）及DPH＋lncRNA GAS5過表達(dá)組（VD＋DPH＋lncRNA GAS5 OVE組），每組15只。采用小鼠雙側(cè)頸總動脈縮窄法構(gòu)建VD模型［12］。造模成功后2 d，DPH組小鼠給予DPH 1 mg/（kg·d）灌胃8周。Sham組和VD模型組小鼠給予等量的生理鹽水灌胃處理。VD＋DPH＋lncRNA GAS5 OVE組小鼠給予病毒液腦室注射lncRNA GAS5（每只1 010 pfu）構(gòu)建VD模型，2 d后給予DPH 1 mg/（kg·d）灌胃8周。VD＋DPH＋lncRNA GAS5 NC組小鼠腦室注射lncRNA GAS5 NC后構(gòu)建VD模型，2d后給予DPH1 mg/（kg·d）灌胃8周。

1.4.2?實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測腦組織lncRNA GAS5表達(dá)水平

按照RNA快速提取試劑盒說明書收集各組小鼠腦組織樣本并提取總RNA，紫外分光光度儀測定RNA溶液OD260 nm/OD280 nm的吸光度值，計(jì)算RNA的純度和濃度，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的步驟將定量的總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用10 μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：RNA sample 5.0 μL，Prime Script RT Enzyme Mix I 0.5 μL，RT Primer 0.5 μL，5×Prime Script Buffer2 2.0 μL，RNase Free dH2O 2.0 μL，37 ℃條件下反應(yīng)15 min，85 ℃條件下反應(yīng)5s，反應(yīng)產(chǎn)物4 ℃條件下保存，接著使用RT-PCR試劑盒進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，所有反應(yīng)均設(shè)立3個復(fù)孔，每孔采用10 μL反應(yīng)體系：2×SYBR Green 5.0 μL，Primer Mix 0.8 μL，DNase-free water 3.7 μL，RT product 0.5 μL。相對表達(dá)量采用2－△△Ct法計(jì)算。lncRNAGAS5正向引物：5′-TCTCACAGGCAGTTCTGTGG-3′，反向引物：5′-ATCCATCCAGTCACCTCTGG-3′；U6正向引物：5′-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3′，反向引物：5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′。上述引物設(shè)計(jì)與合成均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.4.3?Morris水迷宮行為學(xué)實(shí)驗(yàn)

取6只小鼠進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)：將5組小鼠連續(xù)訓(xùn)練3 d，每天4次。訓(xùn)練時，將小鼠從面向池壁的4個入水點(diǎn)放入水中，記錄小鼠從水中到明確找到并站立于水下隱蔽平臺的時間，所需時間為小鼠的逃避潛伏期，每組小鼠從池壁的4個入水點(diǎn)分別訓(xùn)練1次，每次間隔時長30 s?？臻g探索行為實(shí)驗(yàn)：在定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，撤去平臺，小鼠從池壁的同一入水點(diǎn)放入水中，記錄小鼠在60 s內(nèi)穿越原平臺的次數(shù)。

1.4.4?MDA、SOD、GSH-Px含量測定

將各組小鼠斷頭處理后快速去除全腦組織，在冰上分離大腦海馬組織，組織碾磨，二喹啉甲酸（BCA）法測定蛋白濃度并定量，按照試劑盒說明書操作步驟檢測MDA、SOD、GSH-Px。

1.4.5?HE染色觀察海馬組織病理學(xué)形態(tài)

乙醚麻醉各組小鼠后，迅速斷頭取腦，摘取視交叉至漏斗柄的腦片，采用4%的多聚甲醛固定各組小鼠海馬組織，脫水、透明、包埋、石蠟切片，并按照HE染色試劑盒進(jìn)行海馬組織染色，顯微鏡下觀察各組小鼠海馬組織形態(tài)學(xué)變化。

1.4.6?血清炎性因子檢測

各組小鼠麻醉后，取6只小鼠，心臟取血，4 ℃，3 000 r/min，離心10 min，取其上清，按照ELISA檢測試劑盒說明書測定IL-6、IL-1β、TNF-α含量。

1.5?統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way analysis of variance，ANOVA），兩組間比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2?結(jié)?果

2.1?各組小鼠腦組織lncRNA GAS5表達(dá)水平比較

與Sham組相比，VD模型組小鼠腦組織lncRNA GAS5表達(dá)明顯升高（P＜0.05）。與VD模型組相比，VD＋DPH組小鼠腦組織lncRNA GAS5表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。與VD＋DPH組相比，VD＋DPH＋lncRNA GAS5 OVE組小鼠腦組織lncRNA GAS5表達(dá)明顯升高（P＜0.05），VD＋DPH＋lncRNA GAS5 NC組小鼠腦組織lncRNA GAS5表達(dá)無明顯差異。詳見圖1。

2.2?各組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力比較

與Sham組相比，VD模型組小鼠逃避潛伏期明顯延長（P＜0.05），穿臺指數(shù)明顯降低（P＜0.05）。與VD模型組相比，VD＋DPH組小鼠逃避潛伏期明顯縮短（P＜0.05），穿臺指數(shù)明顯增加（P＜0.05）。與VD＋DPH組相比，VD＋DPH＋lncRNA GAS5 OVE組小鼠逃避潛伏期明顯延長（P＜0.05），穿臺指數(shù)明顯降低（P＜0.05），VD＋DPH＋lncRNA GAS5 NC組小鼠逃避潛伏期和穿臺指數(shù)無明顯差異。詳見圖2。2.3?各組小鼠MDA、SOD、GSH-Px含量比較

與Sham組相比，VD模型組小鼠海馬組織MDA含量明顯增加（P＜0.05），GSH-Px和SOD活性均明顯降低（P＜0.05）。與VD模型組相比，VD＋DPH組小鼠海馬組織MDA含量明顯降低（P＜0.05），GSH-Px和SOD活性均明顯升高（P＜0.05）。與VD＋DPH組相比，VD＋DPH＋lncRNA GAS5 OVE組小鼠大腦海馬組織MDA含量明顯增加（P＜0.05），GSH-Px和SOD活性均明顯降低（P＜0.05），VD＋DPH＋lncRNA GAS5 NC組小鼠海馬組織MDA、SOD、GSH-Px含量無明顯差異。詳見表1。

2.4?各組小鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α含量比較

與Sham組相比，VD模型組小鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α含量明顯增加（P＜0.05）。與VD模型組小鼠相比，VD＋DPH組小鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α含量明顯降低（P＜0.05）。與VD＋DPH組相比，VD＋DPH＋lncRNA GAS5 OVE組小鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α含量明顯增加（P＜0.05），VD＋DPH＋lncRNA GAS5 NC組小鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α含量無明顯差異。詳見表2。

2.5?各組小鼠海馬組織形態(tài)學(xué)變化

Sham組小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整、清晰，細(xì)胞呈極性排列。VD模型組小鼠CA1區(qū)海馬神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞大部分皺縮，部分神經(jīng)元細(xì)胞核固縮，染色質(zhì)出現(xiàn)明顯聚集等。VD＋DPH組小鼠CA1區(qū)病理性損傷明顯減輕，神經(jīng)元結(jié)構(gòu)較為完整，細(xì)胞排列相對規(guī)則。與VD＋DPH組相比，VD＋DPH＋lncRNA GAS5 OVE組小鼠CA1區(qū)病理損傷加重，神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量降低，結(jié)構(gòu)紊亂。VD＋DPH＋lncRNA GAS5 NC組小鼠神經(jīng)元結(jié)構(gòu)與VD＋DPH組小鼠相比無明顯改變。詳見圖3。

3?討?論

VD是一種血管性認(rèn)知功能障礙和神經(jīng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為神經(jīng)活動、語言、學(xué)習(xí)以及記憶能力的障礙。腦部血流長期灌流不足會導(dǎo)致中樞膽堿功能障礙、神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷，是學(xué)習(xí)和記憶能力下降的重要原因［3］。因此，本研究通過雙側(cè)頸總動脈縮窄法構(gòu)建VD小鼠模型。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Sham組相比，VD模型組小鼠逃避潛伏期明顯延長，穿臺指數(shù)明顯降低，且海馬CA1區(qū)出現(xiàn)明顯的病理損傷，表明VD小鼠模型構(gòu)建成功。VD的危險因素主要包括腦卒中、動脈粥樣硬化、糖尿病以及短暫性腦缺血發(fā)作等。既往研究顯示，VD會誘發(fā)神經(jīng)元死亡、炎癥反應(yīng)過度激活以及認(rèn)知功能障礙等［13-14］。因此，積極探尋藥物干預(yù)治療VD尤為重要。目前臨床上有關(guān)VD的治療主要有藥物治療和特殊方式治療等。其中藥物包括神經(jīng)保護(hù)劑、腦組織代謝改善劑等，神經(jīng)遞質(zhì)的替代治療是特殊方式治療的關(guān)鍵［15］。DPH是治療VD的一線臨床藥品，能夠有效改善病人認(rèn)知功能障礙、炎癥反應(yīng)以及神經(jīng)元凋亡等。但是目前有關(guān)DPH對VD的具體作用機(jī)制尚不完全清楚。

多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，lncRNAs與缺血性腦卒中的發(fā)生關(guān)系密切。在缺血性腦卒中病人腦組織和血液中均發(fā)現(xiàn)lncRNAs表達(dá)發(fā)生顯著改變，提示lncRNAs可能是缺血性腦卒中的潛在標(biāo)志物［16］。研究顯示，lncRNA GAS5在缺血性腦卒中病人中高表達(dá)［17］。另外，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)在缺氧復(fù)氧處理的原代神經(jīng)元中l(wèi)ncRNA GAS5表達(dá)明顯升高，神經(jīng)元的存活率降低，抑制lncRNA GAS5表達(dá)能夠降低神經(jīng)元凋亡率［18］。在體動物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)抑制腦缺血再灌注損傷大鼠lncRNA GAS5表達(dá)，能夠降低腦梗死體積，并最終改善神經(jīng)功能［19］。以上研究表明，lncRNA GAS5在神經(jīng)功能損傷中發(fā)揮重要作用，但是有關(guān)lncRNA GAS5對VD神經(jīng)損傷的影響尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過qRT-PCR檢測顯示，與Sham組相比，VD模型組小鼠腦組織lncRNA GAS5表達(dá)明顯升高?；贒PH對VD的治療作用以及l(fā)ncRNA GAS5高表達(dá)與神經(jīng)損傷相關(guān)，本研究推測DPH能否通過抑制lncRNA GAS5表達(dá)，改善VD神經(jīng)損傷。為此，本研究通過給予VD小鼠病毒液腦室注射lncRNA GAS5過表達(dá)質(zhì)粒觀察DPH對VD小鼠神經(jīng)功能障礙的影響，結(jié)果顯示，與VD模型組相比，VD＋DPH組小鼠腦組織lncRNA GAS5表達(dá)明顯降低，且小鼠學(xué)習(xí)記憶能力提高，海馬CA1區(qū)病理損傷減輕；與VD＋DPH組相比，VD＋DPH＋lncRNA GAS5 OVE組小鼠，上述指標(biāo)和現(xiàn)象均被明顯逆轉(zhuǎn)，表明DPH能夠通過抑制lncRNA GAS5表達(dá)，從而改善VD誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)損傷。氧化應(yīng)激性損傷在神經(jīng)退行性病變中發(fā)揮重要作用。腦部血流長期灌流不足會導(dǎo)致MDA含量升高、SOD以及GSH-Px活性降低［20］。另外，血清炎性因子如IL-6、IL-1β、TNF-α等亦是VD損傷的重要檢測指標(biāo)，在VD小鼠模型中血清炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α表達(dá)均明顯升高，通過抑制腦部過度氧化應(yīng)激以及炎癥風(fēng)暴能夠改善VD神經(jīng)損傷［21］。本研究結(jié)果顯示，與VD模型組相比，VD＋DPH組小鼠氧化應(yīng)激水平以及炎性因子釋放均明顯降低；與VD＋DPH組相比，VD＋DPH＋lncRNA GAS5 OVE組小鼠氧化應(yīng)激水平以及炎性因子釋放均明顯升高，表明lncRNA GAS5能夠通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，從而影響VD小鼠神經(jīng)功能障礙。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，DPH能夠通過抑制lncRNA GAS5表達(dá)，降低氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，改善VD小鼠認(rèn)知功能障礙。

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（收稿日期：2022-07-24）

（本文編輯王麗）