摘要：［目的］蜂毒（Bee_Venom， BV）是天然的動(dòng)物藥，藥理效應(yīng)廣泛，成分較為復(fù)雜。磷脂酶A2（phospholipaseA2，PLA2）是蜂毒的重要活性成分和主要過(guò)敏原，可與蜂毒肽發(fā)揮協(xié)同作用，誘發(fā)溶血。本研究旨在通過(guò)原核系統(tǒng)表達(dá)并純化出蜂毒磷脂酶A2（BvPLA2）蛋白，并通過(guò)溶血試驗(yàn)對(duì)比蜂毒（bee venom，BV）、蜂毒肽（melittin）以及BvP?LA2 的溶血效果。［方法］將已構(gòu)建好的pET28a-BvPLA2 融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 菌株中并通過(guò)IPTG低溫誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定并純化獲得重組BvPLA2 蛋白。采集小鼠眼球全血與生理鹽水等體積混合配制成2% 的紅細(xì)胞混懸液，加入不同濃度的BvPLA2 蛋白液、蜂毒液及蜂毒肽，通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定溶血率。［結(jié)果］經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)后的表達(dá)產(chǎn)物在約15 kDa 的分子量處呈現(xiàn)清晰的條帶，與理論推算值一致。超聲破碎后在上清及沉淀中均表達(dá)出特異性條帶，且上清中的表達(dá)量與沉淀表達(dá)量基本一致。不同濃度的BvPLA2 蛋白液均具有溶血效果，溶血率均超過(guò)5%，且低濃度BvPLA2 溶血率較高。經(jīng)對(duì)比得出，BvPLA2 溶血率顯著低于蜂毒和蜂毒肽（Plt;0. 05）。［結(jié)論］通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)成功誘導(dǎo)并純化出可溶性目標(biāo)蛋白BvPLA2，且BvPLA2 具有一定的溶血效果，但溶血效果顯著低于蜂毒和蜂毒肽。

關(guān)鍵詞：蜂毒； 磷脂酶A2； 原核表達(dá)； 溶血性

中圖分類號(hào)：Q965.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1671-8151（2024）02-0063-08

蜂毒（Bee_Venom，BV）是一種寶貴的中藥資源，是中醫(yī)蜂療中必不可少的組成部分，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。它是一種味苦、酸性、含有清香氣味的液體，顏色微黃近乎透明，由工蜂毒腺和副毒腺分泌而出，貯存在蜜蜂毒囊里，在蜜蜂抵御天敵時(shí)由尾刺排出［1］。BV 化學(xué)成分豐富，主要含蜂毒肽（melittin）、蜂毒明肽（apamin）等多種活性肽及磷脂酶A2（phospholipase A2，PLA2）、透明質(zhì)酸酶（hyaluronidase，Hya）等多種酶類物質(zhì)［2］。BV 作為一種用途廣泛的天然藥物，藥理特性多樣，包括抗關(guān)節(jié)炎，抗凝血，溶血，放射防護(hù)，抗病毒，抗癌，抗傷害性，抗菌等，可有效治療支氣管哮喘、高血壓、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、血液循環(huán)系統(tǒng)疾病和一些免疫相關(guān)缺陷等多種病癥［3-4］。

BV 成分復(fù)雜，早前關(guān)于粗BV 的研究居多。近年來(lái)，隨著對(duì)BV 研究和開(kāi)發(fā)的逐步深入，國(guó)內(nèi)外已對(duì)其主要有效成分的分子結(jié)構(gòu)、生物活性及作用機(jī)理開(kāi)展了大量研究，因此BV 有效活性成分的分離純化、作用機(jī)制及其應(yīng)用價(jià)值逐漸成為研究熱點(diǎn)。其中，PLA2 便是重要的研究對(duì)象之一。蜂毒磷脂酶A2（BvPLA2）是BV 中的重要活性組分和主要過(guò)敏原之一，約占BV 干重的10%～12%，分子量約為15～18 kDa［5］。根據(jù)其來(lái)源及生化特性，BvPLA2 屬于胞外分泌型PLA2 堿性糖蛋白，為單一多肽鏈，共含134 個(gè)氨基酸殘基，N-聚糖鏈共價(jià)結(jié)合于其肽鏈的第13 位點(diǎn)天冬酰氨上［6-7］。作為水解天然磷脂的催化酶，BvPLA2 可催化甘油磷脂分子的第2 位酯酰鍵水解，釋放脂肪酸及溶血磷脂，二者皆是對(duì)雙分子膜結(jié)構(gòu)有影響的高強(qiáng)度膜活性因子，在膜區(qū)域非?；钴S，會(huì)導(dǎo)致紅細(xì)胞溶解。當(dāng)細(xì)胞膜裂解后，其它BV 成分就可以進(jìn)入膜內(nèi)發(fā)揮作用，主要是與Melittin 起協(xié)同效應(yīng)，引起強(qiáng)溶血反應(yīng)，故稱BvPLA2 為“ 間接的溶血毒素”［8］，BvPLA2 是目前已知具有很高應(yīng)用價(jià)值的生物活性較強(qiáng)的一類PLA2 酶。沈立榮等［9-10］在成功克隆意大利蜜蜂和中華蜜蜂的PLA2 序列后，在大腸桿菌中表達(dá)AmPLA2 基因，并制作多克隆抗體進(jìn)行Western blot 分析，結(jié)果表明其活性與天然純AmPLA2 相同。另以抗天然純AmPLA2的特異性抗血清為第一抗體，利用桿狀病毒昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)出AmPLA2 基因，Western blot 印跡顯示其融合表達(dá)產(chǎn)物可與AmPLA2 抗血清產(chǎn)生免疫反應(yīng)，表現(xiàn)出很高的免疫活性［11］。

在溶血方面，BV 中起主要作用的為Melittin，由于其具有溶血性，故又稱溶血肽。目前關(guān)于Melittin 溶血作用的研究居多，并且已有研究證明在紅細(xì)胞裂解過(guò)程中，BvPLA2 和Melittin 之間存在協(xié)同作用［2，12］。但關(guān)于BvPLA2 單一成分溶血作用方面的研究還未見(jiàn)報(bào)道，且BvPLA2 作為BV的主要過(guò)敏原，其安全性仍是臨床治療過(guò)程中的一個(gè)強(qiáng)有力的限制性考慮因素。因此，本研究通過(guò)大腸桿菌BL21 原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)并純化Bv?PLA2 來(lái)進(jìn)一步探究其溶血作用，旨在為BV 有效成分的毒理學(xué)研究及安全性評(píng)價(jià)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1. 1 試驗(yàn)材料及動(dòng)物

pET28a 載體由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供［13］（ 載體圖譜如圖1）；pET28a-BvPLA2 重組表達(dá)質(zhì)粒由生工生物工程（上海）有限公司構(gòu)建；蜂毒凍干粉由安徽金蜂蜂毒生物科技開(kāi)發(fā)有限公司；蜂毒肽凍干粉購(gòu)自南京源肽生物科技有限公司提供；大腸桿菌BL21 感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自全式金生物（北京）有限公司。

SPF 級(jí)昆明雄性健康小鼠，購(gòu)自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0010，飼養(yǎng)溫度為18～25 ℃ ，相對(duì)濕度為50%～70%，自然光照，專用飼料，自由飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 意大利蜜蜂PLA2 原核表達(dá)

1. 2. 1. 1 重組表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化

?80 ℃冰箱中取出BL21 感受態(tài)細(xì)胞放入冰盒中消融10 min，吸取50 μL 于1. 5 mL EP 管內(nèi)；

EP 管內(nèi)加入1 μL 的連接產(chǎn)物（pET28a-BvPLA2 重組表達(dá)質(zhì)粒），輕懸EP 管，冰上孵育30 min；

42 ℃水浴熱激90 s，立即移入冰上靜置3 min，此過(guò)程中禁止晃動(dòng)EP管；

將800 μ L LB 培養(yǎng)液加入管內(nèi)，37 ℃ 、200 r·min-1 搖床中培養(yǎng)1 h ；

將EP 管在4000 r·min-1下進(jìn)行3 min 30 s 的離心，去上清，留100 μL 菌液重懸，將其涂在含卡那霉素的平板上，37 ℃倒置培養(yǎng)10～12 h 后得到含重組表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)宿主菌種。

1. 2. 1. 2 誘導(dǎo)表達(dá)

挑單菌落接種至內(nèi)有3 mL 培養(yǎng)液（內(nèi)有3 μL 50 mg·mL-1 的卡那霉素）的15 mL 離心管，于37 ℃ 、200 r·min-1 下振搖培養(yǎng)6 h，吸100 μL 小搖菌液至含卡那霉素的100 mL 培養(yǎng)液內(nèi)，然后于37 ℃、200 r·min-1下進(jìn)行10～12 h 的培養(yǎng)；

OD600 到0. 8 時(shí)，在錐形瓶?jī)?nèi)加100 μL 的IPTG 誘導(dǎo)劑（1 mol·L-1），于28 ℃ 、200 r·min-1 下振搖培養(yǎng)6 h；

誘導(dǎo)前后需要保菌，制蛋白樣品；

將錐形瓶溶液分別裝至2 個(gè)50 mL 離心管，于4 ℃、8000 g 進(jìn)行10 min 的離心，棄上清；

加3 mL PBS 重懸沉淀，并將兩管沉淀合為1管，將PBS 補(bǔ)充至30 mL；

超聲破碎1 h 左右，功率300 W ，超聲破碎3 s，間歇3 s，冰上進(jìn)行；

結(jié)束后，于4 ℃、12 000 r·min-1下進(jìn)行15 min 的離心，留上清和沉淀并制蛋白樣；

對(duì)誘導(dǎo)前后，超聲破碎上清及沉淀的蛋白樣進(jìn)行電泳試驗(yàn)。電泳前把樣品放入100 ℃的水浴鍋內(nèi)加熱10 min，加熱結(jié)束后于10 000 r·min-1 離心3 或5 min。

1. 2. 1. 3 SDS-PAGE 凝膠電泳

清洗并烘干玻璃面板后安好制膠模；將制好的12% 分離膠倒入膠板中，后在上層添加無(wú)水乙醇，使凝膠表面趨于平坦，在室溫下凝結(jié)1 h 左右；等分離膠固態(tài)化，倒出上層液體并用濾紙吸收剩余液體；添加制作出的5% 濃縮膠，在適當(dāng)位置將梳子插入，盡量防止出現(xiàn)氣泡，于常溫下等待30 min 左右便可凝固；等濃縮膠固態(tài)化，慢慢抽去梳子。將膠板裝入電泳槽并浸泡于1× 電泳緩沖液內(nèi)。將蛋白Marker 及蛋白樣品點(diǎn)入樣孔內(nèi)，合上蓋子，接通電源?？刂齐妷涸?0 V，約30～40 min，換120 V 電壓，約1 h 后結(jié)束。

1. 2. 1. 4 染色與脫色

完成電泳后，從2 片玻璃板間剝落凝膠，放入盒中并倒入考馬斯亮藍(lán)R-250 蛋白染液，用沸水煮10 min 左右，待染上色后，再加入脫色液洗脫，期間更換脫色液1 到2 次，每次煮15 min 左右，最后將膠放到含有脫色液的搖床上，洗脫至條帶明晰并拍照。

1. 2. 2 BvPLA2 蛋白純化及濃縮

1. 2. 2. 1 層析柱的準(zhǔn)備

添加Ni-Agarose Resin 填充物至層析柱中，靜放10 min，當(dāng)填充物和溶液出現(xiàn)層化，開(kāi)啟底部出液口，使乙醇在重力影響下慢慢滴下；

將5 個(gè)柱體積的去離子水加到柱上沖凈殘存乙醇，后加8 個(gè)柱體積的平衡緩沖液使層析柱保持平衡。

1. 2. 2. 2 蛋白的純化

向?qū)游鲋屑尤氤暺扑楹笊锨逡?，按照每小時(shí)10 個(gè)柱體積的流量，采集流過(guò)液；

向?qū)游鲋屑尤?5 個(gè)填料體積的10 m·moL-1咪唑洗柱，洗掉掛在柱上的雜蛋白；

按50、100、200、250、300、500 m·moL-1 的順序加咪唑液去洗掉掛柱目的蛋白，收集洗脫峰；

d 洗脫結(jié)束，按順序用5 倍填料體積的10 m·moL-1 咪唑、5 倍填料體積的LE 緩沖液、5 倍填料體積的去離子水沖洗層析柱，然后用3 倍填料體積的20% 乙醇（乙醇要浸透填料）對(duì)層析柱進(jìn)行平衡，封柱后儲(chǔ)存于2～8 ℃；

純化后進(jìn)行蛋白制樣，并進(jìn)行電泳跑膠。

1. 2. 2. 3 蛋白濃縮

將超濾管中的NaOH 倒掉，用蒸餾水洗滌2 到3 次并倒掉，將蛋白液倒入超濾管，4 ℃、4000 g，離心20～40 min。

1. 2. 3 蛋白濃度測(cè)定

牛血清蛋白標(biāo)品，用天平稱取0. 006 g 的BSA ，溶于50 mL 的蒸餾水中，溶液濃度為120 μg·mL-1，用移液槍依次取0、24、48、72、96、120 μL 的BSA 溶液到不同的1. 5 mL EP 管中，再分別加入120、96、72、48、24、0 μL 的蒸餾水，將其混合均勻，獲得1 組為0、24、48、72、96、120 μg·mL-1濃度的BSA。最后加入600 μL 的考馬斯亮藍(lán)G-250 到各管中配成720 μL 的溶液；

將120 μL BvPLA2 液加到EP 管中，再將600 μL 的考馬斯亮藍(lán)G-250 加到管內(nèi)；

將每個(gè)樣品分別加入3 個(gè)重復(fù)的酶標(biāo)孔中，每個(gè)酶標(biāo)孔加200 μL 的樣品。靜放2 min 后，利用酶標(biāo)儀檢測(cè)溶液的吸光度。

1. 2. 4 溶血試驗(yàn)

1. 2. 4. 1 紅細(xì)胞混懸液的制備

將100 μL 抗凝劑EDTA·2K 添入EP 管內(nèi)，取雄小鼠6 只，每只均采集眼球全血約1 mL 加入抗凝劑中，用滅過(guò)菌的牙簽將纖維蛋白去除，使之成為脫纖血液；

將EP 管于1000 r·min-1 離心3 min，吸凈上層血漿；

然后向管中添加1 mL 生理鹽水使其混勻后并進(jìn)行洗滌，于1000 r·min-1 下離心3 min，舍去上清，可去除表面的白細(xì)胞，重復(fù)上述操作3～4 次，待上清呈現(xiàn)無(wú)色透明時(shí)停止操作。最后一次操作結(jié)束時(shí)，棄上清并吸200 μL 的壓積紅細(xì)胞到10mL 的生理鹽水內(nèi)。

1. 2. 4. 2 測(cè)定溶血率

蒸餾水添加紅細(xì)胞混懸液為陽(yáng)性對(duì)照，生理鹽水與其混合為陰性對(duì)照。根據(jù)純化后測(cè)定的BvPLA2 濃度計(jì)算出作為對(duì)比的BV 及Melittin 的濃度，BvPLA2 蛋白液為2 種濃度，0. 46 mg·mL-1及0. 23 mg·mL-1。BV 濃度為3. 8 mg·mL-1 及1. 9 mg·mL-1，Melittin 濃度為2. 0 mg·mL-1 及1. 0 mg·mL-1，然后各取0. 5 mL 與0. 5 mL 的紅細(xì)胞混懸液進(jìn)行混合。輕輕搖動(dòng)使其均勻后，將溶液放入37 ℃水浴中保溫孵育，在孵育后的15、30、45 min 和1、2 及3 h，進(jìn)行肉眼觀察并評(píng)價(jià)其溶血性。3 h 后在10 000 r·min-1 進(jìn)行3 min 的離心，然后分別吸200 μL 上清到酶標(biāo)孔中，用545 nm 的波長(zhǎng)檢測(cè)吸光度（A）。每個(gè)樣品做3 次技術(shù)重復(fù)。

溶血率=（A 樣品? A 陰性）/（A 陽(yáng)性? A 陰性）×100%。數(shù)值超過(guò)5% 即可視為溶血。

1. 3 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2016 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行記錄及整理。計(jì)量資料數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（-x±SE）表示。利用SPSS 26. 0 對(duì)不同處理組間溶血率的比較進(jìn)行單因素方差分析，多重比較用Duncan 氏法，以Plt;0. 05 記為組間有顯著差異。

2 結(jié)果分析

2. 1 BvPLA2 重組蛋白SDS-PAGE 結(jié)果分析

SDS-PAGE 結(jié)果顯示，IPTG 誘導(dǎo)后的表達(dá)產(chǎn)物在約為15 kDa 的分子量下具有清晰的特異性表達(dá)條帶（圖2），與理論推算值14. 7 kDa 基本一致。超聲破碎后在上清及沉淀中均表達(dá)出特異性表達(dá)條帶，且上清的表達(dá)量與沉淀表達(dá)量基本一致（圖2），表明BvPLA2 誘導(dǎo)成功。

2. 2 BvPLA2 純化后SDS-PAGE 結(jié)果分析

超聲破碎后取上清液進(jìn)行純化，從SDSPAGE圖譜看出，目的蛋白用親和層析法成功純化，且在200 m·moL-1 咪唑中洗脫的重組BvPLA2表達(dá)量較其它濃度多（圖3）。

2. 3 蛋白濃度測(cè)定結(jié)果

BSA 法對(duì)純化后BvPLA2 目的蛋白溶液進(jìn)行濃度測(cè)定，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線如下（圖4），得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0. 002 4x+1. 091 2（R2=0. 993 3），該標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算得到吸光度值為2. 199 的BvPLA2蛋白液濃度約為462 μg·mL-1，即0. 46 mg·mL-1。

2. 4 體外溶血現(xiàn)象觀察及溶血率分析

在體外溶血試驗(yàn)中，不同BvPLA2、Melittin、BV 溶液與紅細(xì)胞混懸液的混合液孵育45 min 后進(jìn)行觀察。肉眼觀察到生理鹽水組開(kāi)始出現(xiàn)分層，底部有紅細(xì)胞凝聚，上層溶液未變紅，說(shuō)明生理鹽水無(wú)溶血作用。BvPLA2 組不同濃度皆有少量紅細(xì)胞凝聚現(xiàn)象，且未出現(xiàn)分層，較生理鹽水組溶液顏色偏紅，說(shuō)明BvPLA2 有溶血作用但溶血性不強(qiáng)。BV 組、Melittin 組及蒸餾水組難以觀察到有紅細(xì)胞凝聚，且不同組間顏色有差別，Melittin組顏色較BV 組更接近陽(yáng)性對(duì)照蒸餾水組，表明其溶血性更強(qiáng)。隨時(shí)間推移，BvPLA2 組，BV 組，Melittin 組溶液顏色都逐漸加深，說(shuō)明溶液與紅細(xì)胞作用時(shí)間越長(zhǎng)，溶血越嚴(yán)重。

試驗(yàn)組和對(duì)照組的混合液在孵育3 h 后結(jié)束觀察，取出后用酶標(biāo)儀分別測(cè)出不同溶液在545 nm下的吸光度值，用公式算出每組的溶血率。從溶血率結(jié)果可以看出（表1），不同濃度的BvPLA2組、BV 組、Melittin 組均有溶血作用，且溶血率均gt;5%；BvPLA2 高劑量組溶血率最低，均顯著低于其它樣品溶液（Plt;0. 05）；BvPLA2 低劑量組溶血率與BV 高劑量組組差異不顯著（Pgt;0. 05）；Melittin 低劑量組溶血率均顯著高于其它樣品組（Plt;0. 05）；BvPLA2 組、BV 組及Melittin 組每組間的溶血率差異均顯著（Plt;0. 05）。BvPLA2 組、BV 組及Melittin 組的溶血率均是低劑量組溶血性較強(qiáng)，且顯著高于高劑量組。

3 討論

蜂毒PLA2 屬于生物活性較強(qiáng)的一種PLA2酶，是意大利蜜蜂毒液的主要成分，由于其潛在的治療應(yīng)用而引起了科研人員的極大關(guān)注，在生化、細(xì)胞、分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、基因工程、農(nóng)業(yè)等方面發(fā)展?jié)摿薮?。從天然的蜜蜂體內(nèi)提取并純化PLA2 工藝較為復(fù)雜，此方法需通過(guò)對(duì)蜜蜂進(jìn)行電擊獲取，不利于生態(tài)環(huán)境的發(fā)展。且提取的成分純度不高、成本大、耗時(shí)長(zhǎng)，使得PLA2 的廣泛應(yīng)用受到限制。目前，利用基因工程技術(shù)在大腸桿菌中獲得大量蛋白產(chǎn)物是現(xiàn)代分子生物學(xué)的成就之一［14-15］。本試驗(yàn)通過(guò)pET28a 構(gòu)建了BvPLA2 基因的表達(dá)重組載體，在大腸桿菌BL21 菌株中通過(guò)IPTG 進(jìn)行低溫誘導(dǎo)，BvPLA2 蛋白表達(dá)的SDSPAGE結(jié)果表明，誘導(dǎo)后的表達(dá)產(chǎn)物在約為15kDa 的分子量下具有清晰的特異性表達(dá)條帶，本結(jié)果與沈立榮等［10］研究結(jié)果相符，說(shuō)明BvPLA2 蛋白表達(dá)成功。超聲破碎蛋白后，在SDS-PAGE 圖譜中觀察到上清及沉淀中均表達(dá)出特異性條帶，且上清的表達(dá)量與沉淀表達(dá)量基本一致，這與沈立榮描述的表達(dá)產(chǎn)物通常以包涵體形式的存在略有不同，推測(cè)可能是由于所選擇的載體pET28a 存在促溶標(biāo)簽，進(jìn)而提高了可溶性蛋白的表達(dá)量。此外，適宜的誘導(dǎo)溫度與時(shí)間也是提高蛋白表達(dá)量的原因之一。本試驗(yàn)中可溶性蛋白與包涵體蛋白的表達(dá)量幾乎相近，后續(xù)可以根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性、基因GC 含量等方式對(duì)BvPLA2 基因序列進(jìn)行改造，進(jìn)一步提高其可溶性蛋白的表達(dá)含量［16-17］。本試驗(yàn)選擇對(duì)破碎后的蛋白上清液進(jìn)行了純化，根據(jù)SDS-PAGE 結(jié)果選擇重組Bv?PLA2 的表達(dá)量較多且雜蛋白較少的蛋白液進(jìn)行純化。本試驗(yàn)通過(guò)原核表達(dá)相關(guān)蛋白，可以為今后批量生產(chǎn)BvPLA2 向著更便捷和程序化的方式進(jìn)行。

BV 的溶血性主要是由Melittin 和PLA2 起作用。Melittin 會(huì)使膜表面產(chǎn)生裂隙和破孔，可以直接使紅細(xì)胞膜破裂，并發(fā)現(xiàn)Melittin 會(huì)造成膜結(jié)構(gòu)的損壞并對(duì)膜上的相關(guān)蛋白或酶類物質(zhì)產(chǎn)生影響，進(jìn)而會(huì)對(duì)有關(guān)聯(lián)的代謝途徑產(chǎn)生影響，產(chǎn)生溶血性。而PLA2 可以水解磷脂脂肪鏈，使卵磷脂能分解為可作用于細(xì)胞膜的溶血卵磷脂，可以破壞紅血球，致使紅細(xì)胞溶解，然而，PLA2 不直接作用于細(xì)胞壁脂類，它需要依賴Melittin，或者與底物復(fù)合之后依靠底物靠近細(xì)胞使之溶解，因此PLA2 具有間接的溶血作用［18-20］。通常BV 在溶血方面的研究主要以Melittin 為主，BvPLA2 在其中總是扮演輔助角色。石偉等［18］研究證實(shí)，Melittin 對(duì)小鼠紅細(xì)胞表現(xiàn)出較高的溶血活性，且在0. 8～4 μmol·L-1范圍內(nèi)呈劑量依賴性，但本研究中低劑量Melittin溶血率顯著大于高劑量Melittin。此外，試驗(yàn)通過(guò)對(duì)比高低劑量組BV 溶血作用，發(fā)現(xiàn)低濃度BV 溶血率較高，這與本課題組前期試驗(yàn)結(jié)果一致，即BV 在一定濃度范圍內(nèi)（0. 1～10 mg?mL-1），其溶血率呈反劑量依賴性（結(jié)果未發(fā)表）。BV 及其主成分具體溶血機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。目前關(guān)于BvPLA2 單一成分溶血方面的研究較少，本試驗(yàn)利用體外觀察法和酶標(biāo)儀對(duì)BvPLA2 溶血性進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)將AmPLA2 與BV、Melittin 的溶血性進(jìn)行了比較。結(jié)果證實(shí)，BvPLA2 具有溶血效果，且低濃度溶血活性較強(qiáng)，另外，BvPLA2 溶血率顯著低于BV 及Melittin，表明BvPLA2 單一成分的溶血效果較低。

近年來(lái)BV 及其有效成分被認(rèn)為是治療許多疾病的合成藥物的首選藥，但由于個(gè)體免疫系統(tǒng)和劑量問(wèn)題，BV 及其有效成分的應(yīng)用有時(shí)會(huì)引起過(guò)敏反應(yīng)，使用不當(dāng)還可能會(huì)對(duì)機(jī)體造成溶血性貧血［3-4］。BvPLA2 與Melittin 諸多藥理作用相似，但因Melittin 的強(qiáng)溶血活性使其在臨床應(yīng)用中受到了很大的局限性［21］。本試驗(yàn)研究表明BvPLA2溶血活性顯著低于Melittin，這一結(jié)果提示也許在臨床應(yīng)用中BvPLA2 可以替代因濃度問(wèn)題造成嚴(yán)重溶血性的Melittin。但BvPLA2 作為BV 主要過(guò)敏原，在使用方面也需多加注意，這些問(wèn)題都值得后續(xù)深入探討。

4 結(jié)論

本研究利用大腸桿菌系統(tǒng)成功表達(dá)并純化出BvPLA2，目標(biāo)蛋白約15 kDa，與預(yù)期蛋白表達(dá)分子量基本一致。目的蛋白破碎后在上清和沉淀中均表達(dá)，在200 m·mol-1 咪唑中洗脫的重組Bv?PLA2 的表達(dá)量較多且雜蛋白較少。利用酶標(biāo)儀測(cè)定數(shù)據(jù)計(jì)算溶血率，并與BV 及Melittin 溶血效果進(jìn)行比較，得出BvPLA2 溶血作用低于BV 及Melittin，且濃度越低，溶血效果越強(qiáng)。

BvPLA2 藥理作用廣泛，但因其為BV 主要過(guò)敏原，臨床治療中的安全性評(píng)價(jià)便更為重要。本研究結(jié)果為BV 單一有效成分的毒理學(xué)研究及安全性評(píng)價(jià)提供了理論依據(jù)，具有一定的實(shí)際意義。

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（編輯：呂俊俐）