摘要為了解決數(shù)字化核酸分析的通量限制問題，在三原色組合液滴編碼技術(shù)基礎(chǔ)上，本研究發(fā)展了一種基于機器學(xué)習的顏色編碼液滴陣列自動化解碼方法。此方法借助機器學(xué)習賦予計算機程序自動獲取液滴顏色-位置-數(shù)量信息的能力，通過關(guān)聯(lián)核酸擴增前后液滴顏色-位置-數(shù)量信息，快速確定每種檢測靶標對應(yīng)的陽性液滴比例。將這種液滴解碼策略用于多重數(shù)字化核酸分析，實驗結(jié)果表明，本方法快速、準確，其解碼流程可在2 min 內(nèi)完成，液滴識別準確率gt; 99%。基于此液滴解碼方法獲得的核酸定量分析結(jié)果與商品化數(shù)字PCR 儀的定量分析結(jié)果具有良好的相關(guān)性（R2 gt; 0.99）。

關(guān)鍵詞機器學(xué)習；液滴；編碼；解碼；多重數(shù)字化核酸分析

數(shù)字化分析是一種基于大規(guī)模分散體系的絕對定量分析方法，其原理是依據(jù)泊松分布算法，通過統(tǒng)計陽性單元比例推算出檢測靶標的濃度[1-2]。數(shù)字化分析可以實現(xiàn)單分子水平的絕對定量分析，因此可顯著提高檢測的靈敏度和結(jié)果的準確性[3]。由于數(shù)字化分析具有檢測精度高、定量分析準確、重復(fù)性好和檢測范圍寬的優(yōu)勢，因此特別適用于復(fù)雜體系內(nèi)待測物的精準定量檢測[4-5]。數(shù)字化分析主要應(yīng)用于核酸檢測，例如數(shù)字聚合酶鏈式反應(yīng)（Digital polymerase chain reaction，dPCR）已在疾病研究和臨床診斷中得到廣泛應(yīng)用[6-8]。

目前，數(shù)字化核酸分析系統(tǒng)面臨的一個重要限制是測試通量。由于分析裝置尺寸和檢測分辨力的限制，多數(shù)現(xiàn)有的數(shù)字化核酸分析方法每次只能檢測有限數(shù)目的靶標，測試成本和操作便利性都難以令人滿意。為擴展檢測通量，研究者發(fā)展了一系列多重數(shù)字化核酸分析策略，主要包括：（1）利用空間分辨力實現(xiàn)多重檢測，如多個獨立反應(yīng)單元并行檢測[9-10]；（2）利用熒光顏色分辨力實現(xiàn)多重檢測，如多個熒光通道并行檢測[11-12]；（3）利用熔解曲線分辨力實現(xiàn)多重檢測，如多個具有不同熔解溫度的靶標并行檢測[13-14]；（4）調(diào)節(jié)反應(yīng)組分濃度實現(xiàn)多重檢測，如調(diào)節(jié)引物/探針濃度[15-16]或探針混合比例[17-18]以獲得終點熒光強度不同的陽性液滴。上述多重化分析策略的應(yīng)用雖然擴展了數(shù)字化核酸分析的檢測通量，但仍存在一些明顯的不足，如反應(yīng)體系優(yōu)化難度大、檢測靈活度較低、通量擴展性有限以及適用性較差等。因此，發(fā)展簡便、靈活和經(jīng)濟的多重化策略對于拓展數(shù)字化核酸分析的應(yīng)用具有重要意義。

針對多重數(shù)字化核酸分析的通量限制， Cai 等[19]發(fā)展了一種基于微流控芯片的液滴編碼-配對技術(shù)。如圖1 所示，這種液滴編碼-配對策略是利用明場三原色組合編碼引物液滴，每種顏色對應(yīng)一種引物。引物液滴制備后儲存起來，分析時與模板液滴配對-融合構(gòu)成完整的核酸擴增體系。液滴融合前確定引物液滴顏色-位置-數(shù)量信息，核酸擴增后關(guān)聯(lián)對應(yīng)位置引物液滴顏色-數(shù)量信息即可實現(xiàn)多重液滴數(shù)字化環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（Multiplex droplet digital loop-mediated isothermal amplification， mddLAMP）。類似地， Wu等[20]也報道了一種結(jié)合液滴捕獲陣列與液滴編碼的多重數(shù)字化LAMP 方法。概括來講，這類多重數(shù)字化核酸分析方法的優(yōu)勢在于：（1）顏色編碼可以顯著提高數(shù)字化核酸分析的多重化能力；（2）多重數(shù)字化核酸分析體系內(nèi)的每個液滴含有單一反應(yīng)組分，因此無需復(fù)雜的體系優(yōu)化過程；（3）允許根據(jù)檢測需求靈活調(diào)整檢測靶標的性質(zhì)與數(shù)量。實際應(yīng)用中，由于液滴數(shù)量多、顏色復(fù)雜且需要液滴溯源過程，因此需要一種自動化解碼系統(tǒng)。

針對上述需求，本研究發(fā)展了一種基于機器學(xué)習的顏色編碼液滴陣列解碼方法。此液滴解碼方法借助機器學(xué)習，賦予計算機程序自動獲取液滴顏色-位置-數(shù)量信息的能力，可通過關(guān)聯(lián)核酸擴增前后液滴顏色-位置-數(shù)量信息快速確定每種檢測靶標對應(yīng)的陽性液滴比例。將此液滴解碼策略用于多重數(shù)字化核酸分析，可顯著提高多重數(shù)字化核酸分析的檢測效率。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

URE-2000/35 深紫外光刻機（中國科學(xué)院成都光電技術(shù)研究所）；Spin Master-51 勻膠機（上海凱美特公司）；BP-2B 烘膠臺（北京創(chuàng)世威納公司）；PDC-M 等離子清洗機（成都銘恒公司）；HH-M4 恒溫水浴鍋（上海赫田公司）；PH-030A 恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒公司）；NanoDrop One 分光光度計（美國ThermoScientific 公司）；RSP01-BD 注射泵（嘉興貝塔公司）；DMi8 熒光倒置顯微鏡，搭載DFC7000T 彩色CCD相機和k5 黑白CCD 相機（德國Leica 公司）；OsciDrop數(shù)字PCR儀（北京達微公司）；iBright FL1000智能成像系統(tǒng)（美國Invitrogen公司）。

聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane， PDMS）套裝（美國Dow Corning 公司）；SU-8 3025 光刻膠及顯影液（美國Microchem 公司）；4 英寸硅片（蘇州銳材公司）；酚紅（北京酷來搏公司）；溴百里酚藍（上海笛博公司）；橙黃G（蘇州美侖公司）；2% EA Surfactant in HFE-75000 （美國RAN Biotechnologies 公司）；牛血清白蛋白（BSA，美國Sigma 公司）；Isothermal amplification buffer、MgSO4、dNTP mix和Bst 2.0 DNA聚合酶（美國NEB 公司）；數(shù)字PCR Supermix和DNA 聚合酶（北京達微公司）；EvaGreen 和SYTO 82 熒光染料（美國Invitrogen 公司）；QIAamp DNA Mini Kit 核酸提取試劑盒（德國Qiagen 公司）。所有引物由上海生工生物工程公司合成，具體核酸序列見表1。

1.2 實驗方法

1.2.1 芯片設(shè)計與制作

設(shè)計加工的微坑陣列芯片由上下兩層組成：上層包含10000 個“葫蘆”形微坑， 其中， 大坑直徑135 μm， 高度110 μm；小坑直徑90 μm， 高度65 μm， 大小坑相交15 μm 形成“葫蘆”形微坑。微坑陣列呈網(wǎng)格狀分布，間距50 μm。微坑陣列芯片的下層包含300 μm 深的通道，用于液滴的流動。微坑陣列芯片采用標準軟光刻技術(shù)制作。

1.2.2 細菌樣品

肺炎鏈球菌ATCC 49619、銅綠假單胞菌ATCC 27853、大腸埃希菌ATCC 25922、金黃色葡萄球菌ATCC 29213、鮑曼不動桿菌ATCC 19606、卡他莫拉菌ATCC 25238、嗜肺軍團菌ATCC 33152 和流感嗜血桿菌ATCC 49247 均由華南理工大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗科微生物室提供。細菌基因組DNA（gDNA）用QIAamp DNA Mini Kit 核酸提取試劑盒提取，采用NanoDrop One 測量核酸濃度后，于–20 ℃低溫保存。

1.2.3 引物液滴顏色編碼

稱取酚紅、溴百里酚藍和橙黃G 粉末，以無酶水配制成終濃度為10 mmol/L的染料溶液。隨后，按表2 中的比例混合形成8 種編碼顏色。

向不同引物溶液中分別添加2 μL 染料，每種顏色對應(yīng)一種引物。分別將不同引物溶液利用具有十字型液滴發(fā)生器的微流控芯片分散形成引物液滴（d=80 μm）， 收集于PCR 管中低溫儲存。分析時，將8 種顏色的引物液滴等比例混合，構(gòu)建引物液滴文庫。

1.2.4 微流控芯片上引物-模板液滴配對與融合

液滴配對是模板液滴和引物液滴順序捕獲的過程，具體操作如下：（1）微坑陣列芯片注滿液滴生成油；（2）向芯片輸入模板液滴（d=130 μm），模板液滴在油相（ρ=1.63 g/cm3， 20 ℃）浮力和拖拽力作用下，依據(jù)液滴-微坑的尺寸特征，被捕獲于“葫蘆”形微坑的大坑；（3）微量注射泵推入液滴生成油沖走多余模板液滴；（4）向芯片輸入引物液滴（d=80 μm）， 依據(jù)相同原理，引物液滴被捕獲于“葫蘆”形微坑的小坑，引物-模板液滴在“葫蘆”形微坑中配對；（5）微量注射泵推入液滴生成油以排出多余引物液滴。完成液滴捕獲-配對后，將打火機點火器的導(dǎo)線與微坑陣列芯片連接，通過觸發(fā)點火器產(chǎn)生電場脈沖，誘導(dǎo)液滴之間連續(xù)相液膜排液，實現(xiàn)模板液滴和引物液滴融合。

1.2.5 液滴環(huán)介導(dǎo)等溫擴增

模板液滴包含以下組分：1× Isothermal amplification 緩沖液， 4.8 mmol/L MgSO4 （1.2×）， 384 U/mL Bst 2.0DNA 聚合酶（1.2×）， 1.68 mmol/L dNTP mix （1.2×）， 0.96 mol/L 甜菜堿（1.2×）， 1.2 mg/mL BSA （1.2×），2.4 μmol/L SYTO 82 （1.2×）和DNA 模板。引物液滴包含以下組分：1× Isothermal amplification緩沖液，2.12 mmol/L （5.3×）三原色組合和引物溶液：5.3× （1.6 μmol/L FIP/BIP， 0.2 μmol/L F3/B3， 0.8 μmol/LLF/LB）。引物-模板液滴融合后，各反應(yīng)組分的終濃度為1×。將微坑陣列芯片置于68 ℃恒溫水浴中加熱60 min 完成LAMP 反應(yīng)。

1.2.6 凝膠電泳

將LAMP 產(chǎn)物進行2.5%瓊脂糖凝膠電泳（1×TAE 緩沖液），電泳條件：100 V， 40 min。采用凝膠成像儀觀察電泳結(jié)果。

1.2.7 數(shù)字PCR

將mddLAMP 的定量分析結(jié)果與商品化數(shù)字PCR 儀的單重定量分析結(jié)果進行比較。數(shù)字PCR 反應(yīng)液（25 μL）包含：12.5 μL 數(shù)字PCR Supermix， 0.6 μL DNA 聚合酶， 2.5 μL 引物溶液（10 mmol/L， 數(shù)字化LAMP 的外引物F3/B3 直接用于數(shù)字PCR）， 1.25 μL EvaGreen， 2 μL 模板溶液和6.15 μL 無酶水。熱循環(huán)步驟：95 ℃， 5 min；95 ℃， 20 s；56 ℃， 1 min。進行45 個熱循環(huán)。

1.2.8 液滴陣列成像

采用熒光倒置顯微鏡對微坑陣列芯片進行系列成像。（1）采用彩色CCD相機對配對后的液滴陣列進行明場拍照，拍照條件：5×物鏡，曝光1 ms，飽和度33，白平衡R 3.1， G 0.0， B 14.8；（2）采用彩色CCD相機和黑白CCD相機分別對LAMP 反應(yīng)后的液滴陣列進行熒光拍照，明場拍照條件同上，熒光拍照條件：5×物鏡，激發(fā)光波長555 nm， 發(fā)射光波長595 nm， 曝光時間500 ms。采用Leica Application Suite Xsoftware 將陣列化拍攝的圖片拼接成完整的芯片圖片，用于液滴解碼分析。

1.2.9 軟件與算法

采用Python 2.7 開發(fā)基于機器學(xué)習（Machine learning）的液滴解碼方法。該方法利用自適應(yīng)閾值算法（Adaptive threshold algorithm）實現(xiàn)液滴的識別，利用k-均值聚類算法（k-means clustering algorithm）實現(xiàn)液滴分類，采用位置推理和線性擬合算法（Position reasoning and line fitting algorithm）實現(xiàn)液滴定位，采用眨眼檢測算法（Blink-detection algorithm）實現(xiàn)陽性液滴識別，采用openpyxl 模塊實現(xiàn)液滴溯源。具體代碼參見https：//github.com/Duke-Rodriguez-Rudolph/DropletsDetector。

利用泊松分布算法推算樣品中核酸濃度（D）：

D = -ln（1-P）/V （1）

其中， P 為陽性液滴比例， V 為液滴體積。

2 結(jié)果與討論

2.1 液滴三原色編碼實現(xiàn)多重數(shù)字化核酸分析

基于三原色概念（青、黃和品紅）和比色LAMP 技術(shù)（Colorimetric LAMP）篩選出酚紅、橙黃G 和溴百里酚藍3 種染料用于編碼引物液滴。以不同比例混合這3 種染料，隨后篩選出8 種RGB 值差異顯著（RGB 值中任意一個維度差值大于10）的顏色用于編碼引物液滴（表2）。這8 種引物液滴的RGB 值在顏色空間內(nèi)沒有重疊（圖2A），表明這8 種顏色信息能夠準確指示對應(yīng)的引物種類。

將不同顏色的引物溶液分別利用微流控芯片制備成引物液滴，每種顏色對應(yīng)一種檢測靶標，然后等比例混合構(gòu)建引物液滴文庫。分析樣品時，首先利用微流控芯片生成模板液滴并定位捕獲于“葫蘆”形微坑的大坑，繼而輸入引物液滴并捕獲于“葫蘆”形微坑的小坑。利用微坑陣列芯片順序捕獲模板液滴和引物液滴，可以形成兩種液滴的隨機組合（圖2B）。實驗結(jié)果表明，利用此微坑陣列芯片可實現(xiàn)模板液滴和引物液滴的高效捕獲和配對，模板液滴的捕獲率為99.7%，引物液滴的捕獲率為98.7%，引物-模板液滴的配對率為98.0%（圖2D）。在引發(fā)模板-引物液滴融合后，即可形成針對不同靶標的數(shù)字化核酸分析體系（圖2C和圖2D）。

理論上，明場三原色組合可配制出所有顏色，因此這種編碼策略具有極高的編碼容量。對于24 位色彩深度的真彩色圖片，計算機儲存一個像素點的顏色信息需要3 個字節(jié)，每個字節(jié)包含8 個二進制位，所以每個像素點的顏色信息具有224 種組合，這是機器學(xué)習能夠識別的顏色信息上限。液滴配對過程是引物液滴對模板液滴的隨機選擇過程，液滴融合后能夠同步形成全面的檢測組。因此，利用明場三原色液滴編碼可以顯著提高數(shù)字化核酸分析的信息通量。此外，這種基于明場顏色編碼的多重數(shù)字化核酸分析無需復(fù)雜的檢測設(shè)備，并且不會干擾反應(yīng)熒光檢測。

2.2 機器學(xué)習實現(xiàn)顏色編碼液滴陣列的高效解碼

采用計算機程序直接讀取液滴的RGB 值，然后利用機器學(xué)習算法分類顏色編碼液滴?；谶@種液滴解碼方法實現(xiàn)多重數(shù)字化核酸分析包含3 個步驟：（1）核酸擴增前液滴陣列明場圖像解碼；（2）核酸擴增后液滴陣列明場和熒光圖像解碼；（3）結(jié)合擴增前后液滴陣列解碼信息（包括液滴顏色、位置和數(shù)量），實現(xiàn)多重數(shù)字化核酸分析。

2.2.1 核酸擴增前液滴陣列解碼

核酸擴增前液滴陣列明場圖像的解碼流程（圖3）包括：（1）微坑陣列分割導(dǎo)入液滴陣列的明場圖像，計算機程序依次進行自適應(yīng)閾值的二值化和矩形擬合輪廓算法，分割出獨立的“液滴配對”單元（200 行50 列，共10000 個）；（2）定位利用位置推理和線性擬合算法賦予分割得到的每個單元特定的位置信息（M_N），如：微坑陣列左上端起始第1 行第1 列“液滴配對”單元的坐標為1_1，第1 行第2 列“液滴配對”單元的坐標為1_2，以此類推，第200 行第50 列的坐標為200_50；（3）引物液滴分類遍歷分割得到的每個“液滴配對”單元，獲取引物液滴的RGB 值，并以此為依據(jù)利用k-均值聚類算法將“液滴配對”單元分為9 類，其中8 類為不同顏色編碼的引物液滴，還有1 類為無效液滴，包括（i）模板液滴未捕獲、（ii）引物液滴未捕獲和（iii）捕獲多個引物液滴。

平行進行3 次液滴解碼，并對解碼結(jié)果進行人工驗證。結(jié)果顯示，此機器學(xué)習算法對引物液滴顏色信息的識別準確率為99.70%， 3 次測試中錯誤歸類的液滴比例均小于1%（圖4A）。此外，識別結(jié)果顯示不同顏色編碼的引物液滴數(shù)量趨近相同，為捕獲液滴數(shù)量與檢測通量的商值（圖4B），這是由于液滴配對過程是引物液滴對模板液滴的隨機選擇過程。依據(jù)大數(shù)定律（Law of large numbers），當隨機事件發(fā)生的次數(shù)足夠多時，發(fā)生的頻率趨近于預(yù)期概率。當各種引物液滴等比例混合時，實現(xiàn)配對的各種引物液滴數(shù)量趨近相同。因此，可以通過擴大微坑陣列規(guī)模增加用于每個靶標檢測的有效液滴數(shù)量，進而提高定量分析精度，并擴展線性動態(tài)范圍。

2.2.2 核酸擴增后液滴陣列解碼

核酸擴增后， LAMP 產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果（圖5A）顯示，實驗所用的引物能夠分別檢測對應(yīng)靶標。本研究發(fā)展了液滴陣列熒光圖像解碼流程（圖3）。（1）微坑分割與定位核酸擴增后，由于熒光圖片背景黑暗，導(dǎo)致陰性液滴不可視（圖5C），因此需要借助其對應(yīng)的明場圖片獲得每個液滴單元的位置信息，再將此信息賦予熒光圖片，以此完成液滴單元分割。具體操作如下：首先利用上一步的分割算法對明場圖片進行微坑分割，并獲取每個“葫蘆”型微坑單元的位置信息和尺寸信息（x， y， w， h）；然后將此信息賦予對應(yīng)熒光圖片，據(jù)此分割熒光圖片中的液滴單元；最后，參照上一步所述內(nèi)容完成液滴單元定位，賦予其位置信息。（2）陽性液滴識別與分類遍歷分割得到的液滴單元，將液滴的RGB 顏色轉(zhuǎn)換為HSB 模式（H-色調(diào)， S-飽和度， B-明度）。針對明度設(shè)定一個閾值，利用Blink 檢測算法獲取液滴明度，明度高于閾值的液滴判定為陽性液滴，明度低于閾值的液滴判定為陰性液滴。

2.2.3 結(jié)合擴增前后液滴陣列解碼實現(xiàn)多重數(shù)字化核酸分析

結(jié)合擴增前后的液滴陣列解碼信息，可以獲得每種顏色引物液滴以及核酸擴增陽性液滴的位置和數(shù)量（圖5D）。相應(yīng)地，利用openpyxl 模型可以獲得每種顏色液滴的陽性比例P，利用泊松分布算法可推算出每個靶標的濃度。

2.3 基于自動化液滴陣列解碼的多重數(shù)字化核酸分析

將此液滴解碼策略用于多重數(shù)字化核酸分析。實驗結(jié)果顯示，此方法具有快速和準確的優(yōu)點，可在2 min 內(nèi)完成解碼流程，液滴識別準確率gt;99%（表3）。利用本方法檢測8 種病原gDNA 混合樣品，并與商品化數(shù)字PCR 儀的檢測結(jié)果進行對比（圖6），結(jié)果表明，兩種方法所得的定量分析結(jié)果具有顯著相關(guān)性（R2gt;0.99），表明本方法具有良好的定量分析準確性，能夠準確鑒定復(fù)雜樣品中的核酸。

3 結(jié)論

建立了一種基于機器學(xué)習程序的顏色編碼液滴陣列自動化解碼方法。此機器學(xué)習程序具有高效的顏色編碼液滴陣列解碼能力，通過處理擴增前液滴陣列的明場圖片以及擴增后液滴陣列的明場/熒光圖片，可以快速獲得每種檢測靶標對應(yīng)的陽性液滴比例。將這種液滴解碼策略用于多重數(shù)字化核酸分析，可顯著提高多重數(shù)字化核酸分析的檢測效率。這種顏色編碼液滴陣列解碼策略可進一步應(yīng)用于多種類型的數(shù)字化分析。

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