摘 要： 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組代表了某一時(shí)刻單個(gè)細(xì)胞內(nèi)所有mRNA總表達(dá)量，其表達(dá)量反映該細(xì)胞的總體特征。通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序（single cell RNA sequencing， scRNA-seq）技術(shù)對單個(gè)細(xì)胞的全部RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增和測序，測序結(jié)果中包含的大量信息有可能重塑對發(fā)育生物學(xué)、基因調(diào)控以及健康和疾病中細(xì)胞異質(zhì)性的理解。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，測序技術(shù)也在不斷進(jìn)步，scRNA-seq全方位、高通量以及高分辨率的特點(diǎn)可構(gòu)建更細(xì)致、全面和精準(zhǔn)的單細(xì)胞圖譜。本文綜述了常用scRNA-seq方法及其數(shù)據(jù)分析主要流程和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)在寄生蟲學(xué)與寄生蟲病領(lǐng)域研究中的應(yīng)用，以期為該領(lǐng)域相關(guān)研究提供參考資料。

關(guān)鍵詞： 單細(xì)胞測序；轉(zhuǎn)錄組；數(shù)據(jù)分析；寄生蟲病

中圖分類號：S855.9;Q522.6

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）10-4290-12

收稿日期：2023-12-25

基金項(xiàng)目：國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2022YFD1800200）；甘肅省科技重大專項(xiàng)（23ZDNA007；22ZD6NA001）；甘肅省在站博士后專項(xiàng)（23JRRA558）；國家肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（CARS-37）；

蘭州大學(xué)中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金（lzujbky-2024-ydyl02）；動(dòng)物疫病防控全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室重大成果培育項(xiàng)目（SKLADCP2023HP05）；

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新工程（CAASTIP-2024-5；CAAS-ASTIP-2021-LVRI）

作者簡介：周蜓蜓（1999-），女，重慶云陽人，碩士生，主要從事棘球蚴病發(fā)育與致病機(jī)制研究，E-mail：1305403647@qq.com

*通信作者：閆鴻斌，主要從事棘球蚴病學(xué)研究，E-mail：yanhongbin@caas.cn；賈萬忠，主要從事動(dòng)物絳蟲（蚴）病研究，E-mail：jiawanzhong@caas.cn

Progress on Single-cell Transcriptomics Technology and Its Applications in Research

on Parasites

ZHOU" Tingting1， LI" Li1， WU" Yantao1， LU" Wenying1， FU" Baoquan1， 2， YIN" Hong1， 2， JIA" Wanzhong

1， 2*， YAN" Hongbin1*

（1.State Key Laboratory for Animal Disease Control and Prevention/College of Veterinary Medicine， Lanzhou University/National Para-reference Laboratory for Animal Echinococcosis/Gansu Province Research Center for Basic Disciplines of Pathogen Biology/Key Laboratory of Veterinary Parasitology of Gansu Province/Key Laboratory of Veterinary Etiological Biology and Key Laboratory of Ruminant Disease Prevention and Control （West）， Ministry of Agricultural and Rural Affairs/Lanzhou Veterinary Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou 730000， China; 2.Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Disease， Yangzhou 225009， China）

Abstract： The single cell transcriptome represents the total expression of all mRNA in a single cell at a certain time， and its expression level reflects the overall characteristics of the cell. The entire RNA of a single cell is reversely transcribed， amplified and sequenced by single cell RNA sequencing （scRNA-seq）. The extensive information contained in the sequencing results has the potential to reshape the understanding of developmental biology， gene regulation and cellular heterogeneity in health and disease. With the continuous development of science and technology， sequencing technologies are also constantly improving. The omni-directional， high-throughput and high-resolution characteristics of scRNA-seq can build a more detailed， comprehensive and accurate single cell map. This paper summarizes the commonly used scRNA-seq methods， the main processes of data analysis， and the application of single cell transcriptome technology in the field of parasitology and parasitic diseases， in order to provide reference materials for related research in this field.

Key words： scRNA-seq; transcriptome; data analysis; parasitic diseases

*Corresponding authors：" YAN Hongbin， E-mail： yanhongbin@caas.cn; JIA Wanzhong， E-mail： jiawanzhong@caas.cn

近40年來，用于分析RNA的技術(shù)逐步改進(jìn)并持續(xù)推動(dòng)著生命科學(xué)的進(jìn)步。在20世紀(jì)80年代，研究人員已經(jīng)能夠通過Northern技術(shù)（RNA印跡）進(jìn)行核酸定量，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction， PCR）及隨后的逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription-PCR， RT-PCR）的發(fā)現(xiàn)，進(jìn)一步推動(dòng)了相關(guān)學(xué)科的發(fā)展［1］，同時(shí)，對mRNA的分析提供了關(guān)于細(xì)胞和組織特異性基因表達(dá)特征的詳細(xì)信息［2］。1992年，Eberwine等［3］首次提出在單細(xì)胞水平上對整個(gè)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序，通過擴(kuò)增特定單細(xì)胞的RNA，構(gòu)建了大鼠海馬中單個(gè)活細(xì)胞的基因表達(dá)譜，并發(fā)現(xiàn)了一些未被描述的mRNA。2009年，Tang等［4］基于下一代測序技術(shù)進(jìn)行了首次單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序分析，發(fā)現(xiàn)在單細(xì)胞分辨率下獲得基因表達(dá)譜是可行的，并描述了早期發(fā)育階段細(xì)胞的特征。這項(xiàng)研究為單細(xì)胞RNA測序的概念和技術(shù)方法帶來了巨大突破，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞測序數(shù)量的擴(kuò)大，使高通量RNA測序更兼容，意味著可以從整個(gè)組織和單個(gè)細(xì)胞中識別和量化RNA轉(zhuǎn)錄本。隨著測序技術(shù)的進(jìn)步，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序（single cell RNA sequencing， scRNA-seq）技術(shù)也在不斷發(fā)展，在單項(xiàng)研究中已經(jīng)能夠達(dá)到百萬細(xì)胞水平的轉(zhuǎn)錄組測序［5］，這對發(fā)現(xiàn)和辨別稀有細(xì)胞類型具有重要意義，使人們能夠在轉(zhuǎn)錄組水平上對細(xì)胞進(jìn)行分類、鑒定、表征和區(qū)分，也能夠在細(xì)胞水平上揭示各類疾病的發(fā)展過程。

寄生蟲病是全球性公共衛(wèi)生問題之一，不僅威脅全球畜牧業(yè)健康發(fā)展，影響動(dòng)物生長發(fā)育，降低養(yǎng)殖效益，而且有些寄生蟲還可以感染人類，嚴(yán)重威脅人類健康［6］，探究寄生蟲的生長發(fā)育過程及其與宿主的相互作用機(jī)制，可以為寄生蟲病防控提供重要的理論依據(jù)。scRNA-seq具有無偏倚、高通量和高分辨率的特點(diǎn)，能夠?yàn)榧纳x學(xué)相關(guān)研究提供更加細(xì)致嚴(yán)謹(jǐn)?shù)难芯考夹g(shù)。通過scRNA-seq分析單個(gè)細(xì)胞的基因表達(dá)差異，可以在單細(xì)胞水平上探究寄生蟲與宿主細(xì)胞之間的相互作用關(guān)系，揭示不同類型細(xì)胞對寄生蟲生命周期的影響以及寄生蟲引起的宿主免疫應(yīng)答，還可以檢測和鑒定新的寄生蟲物種［7-8］，進(jìn)一步解析寄生蟲的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，并從基因?qū)用嫣骄考纳x的發(fā)育機(jī)制［9］。本文主要綜述scRNA-seq技術(shù)的主要原理和數(shù)據(jù)分析方法，并重點(diǎn)介紹scRNA-seq技術(shù)在寄生蟲研究領(lǐng)域中的應(yīng)用進(jìn)展。

1 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)

scRNA-seq的試驗(yàn)流程通常需要將目的器官或組織分離為單個(gè)細(xì)胞，在此過程中需要最大限度地提高細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞質(zhì)量，同時(shí)盡可能減少消化時(shí)間以降低細(xì)胞的死亡率。目前，已經(jīng)發(fā)展成熟的單細(xì)胞分離技術(shù)包括稀釋法、顯微操作法、激光捕獲顯微切割法、熒光激活細(xì)胞分選（fluorescence activated cell sorting， FACS）和微流控技術(shù)等，其中稀釋法和顯微操作法能夠較好地保留細(xì)胞的完整性，但其具有通量低和耗時(shí)長的特點(diǎn)，因此主要針對于細(xì)胞數(shù)量較少的樣本組織。FACS和微流控技術(shù)是目前最常用的單細(xì)胞捕獲方法，二者的特點(diǎn)是高通量、自動(dòng)化和低成本地進(jìn)行單細(xì)胞分選，其中FACS還具有高特異性的特點(diǎn)［10］。隨后對捕獲的單細(xì)胞進(jìn)行RNA的逆轉(zhuǎn)錄，并對cDNA實(shí)施擴(kuò)增從而進(jìn)行文庫制備，再通過下一代測序生成讀數(shù)，這些讀數(shù)與參考基因組對齊，進(jìn)行處理及質(zhì)量控制后對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析［11］。單個(gè)細(xì)胞不同的分離技術(shù)會導(dǎo)致讀取的mRNA濃度與實(shí)際濃度具有差異，同時(shí)由于擴(kuò)增技術(shù)的不同，測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量也會產(chǎn)生差異［12］，因此，在實(shí)際工作中時(shí)，應(yīng)當(dāng)充分考慮需要捕獲和測序的細(xì)胞數(shù)量，并綜合試驗(yàn)?zāi)康膩碓O(shè)計(jì)和執(zhí)行scRNA-seq技術(shù)，當(dāng)前常用的scRNA-seq技術(shù)對比見表1［13-27］。對于部分技術(shù)不同的擴(kuò)增方式、測序原理的差異及其特點(diǎn)總結(jié)如下。

1.1 基于非液滴技術(shù)的單細(xì)胞測序

線性擴(kuò)增單細(xì)胞測序（cell expression by linear amplification and sequencing， CEL-seq）是通過多重線性擴(kuò)增進(jìn)行scRNA-seq的技術(shù)，Hashimshony等［13］為了應(yīng)對RNA起始量較小這一挑戰(zhàn)，通過條形碼和匯集樣本，使用體外轉(zhuǎn)錄（in vitro transcription， IVT）線性擴(kuò)增mRNA，從而開發(fā)了CEL-seq。該方法將分離的單個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至低滲裂解液中進(jìn)行裂解，獲得含有mRNA的裂解緩沖液，再通過添加含有唯一條形碼、Illumina 5′接頭和T7啟動(dòng)子的oligo dT引物、逆轉(zhuǎn)錄酶和脫氧核糖核苷三磷酸等，對mRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA第一條鏈。隨后對cDNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄獲得用于IVT反應(yīng)的模板材料，由此擴(kuò)增的RNA能夠進(jìn)行雙向的RNA文庫構(gòu)建。具體步驟為將RNA片段化成適合測序的大小，通過連接添加Illumina 3′接頭，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，最終從文庫中篩選出同時(shí)包含Illumina 3′接頭、Illumina 5′接頭和條形碼的大多數(shù)片段。得到的文庫經(jīng)過配對測序，其中第一次讀取恢復(fù)條形碼，第二次識別mRNA轉(zhuǎn)錄本，達(dá)到識別單細(xì)胞RNA的目的。相較于PCR擴(kuò)增方法，IVT線性擴(kuò)增的主要優(yōu)勢在于其重復(fù)性高，錯(cuò)誤率低，但其生成文庫所花費(fèi)時(shí)間更長。2016年，CEL-seq經(jīng)過優(yōu)化發(fā)展為CEL-seq 2［14］，將唯一分子標(biāo)識符（unique molecular identifiers， UMI）加入到CEL-seq引物中，使每個(gè)反轉(zhuǎn)錄的mRNA能夠精確計(jì)數(shù)一次，并將CEL-seq引物從92個(gè)核苷酸縮短到82個(gè)核苷酸用以提高逆轉(zhuǎn)錄（reverse transcription， RT）反應(yīng)的效率，此外還在RT步驟中直接插入Illumina適配器作為5′端，隨機(jī)連接到六聚體，從而省去了以往的連接步驟，提高靈敏度的同時(shí)進(jìn)一步減少了文庫準(zhǔn)備的實(shí)際操作時(shí)間和成本。

大規(guī)模平行單細(xì)胞測序（massively parallel single-cell RNA sequencing， MARS-seq）也是一種常用的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組建庫和測序技術(shù)，與CEL-seq通過稀釋法獲得單細(xì)胞不同的是，MARS-seq采用FACS將單個(gè)細(xì)胞分選至384孔板，隨后的技術(shù)原理與CEL-seq相似，通過T7啟動(dòng)子連在oligo dT引物上，cDNA合成后再啟動(dòng)IVT生成帶有條形碼和UMI的擴(kuò)增RNA［15］。為了提高實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性和檢測率，Keren-shaul等［16］發(fā)展的MARS-seq 2對MARS-seq單細(xì)胞處理的各個(gè)步驟進(jìn)行了優(yōu)化改進(jìn)，包括修改RT引物的組成，降低RT引物的濃度，減少RT和裂解緩沖液的體積等，這種文庫制備方法，使生產(chǎn)成本顯著降低，且對于任意數(shù)量的細(xì)胞測序，單個(gè)細(xì)胞的成本都不會受到影響。因此，與其他scRNA-seq技術(shù)相比，在測定細(xì)胞數(shù)量較少的樣本組織時(shí)，MARS-seq2優(yōu)勢在于具有較低的測序成本。此外，由于MARS-seq和CEL-seq在3′端引入標(biāo)記，無法測定全長mRNA序列，所以不可用于可變剪切的分析，更適用于對基因表達(dá)進(jìn)行定量［28］。

1.2 基于液滴技術(shù)的單細(xì)胞測序技術(shù)

在制備大量cDNA文庫過程中，實(shí)驗(yàn)通量往往是scRNA-seq實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中需要考慮的問題，少量細(xì)胞的RNA-seq數(shù)據(jù)通常不足以全面地反映生物樣品的狀態(tài)，因此大部分scRNA-seq將面臨數(shù)以萬計(jì)的細(xì)胞數(shù)量，而液滴微流體能夠以較高的頻率實(shí)現(xiàn)單個(gè)細(xì)胞的快速分隔和封裝，所產(chǎn)生的每個(gè)液滴僅有納升體積以適應(yīng)單細(xì)胞反應(yīng)，其液滴數(shù)量可達(dá)到數(shù)百萬個(gè)［29］?；谝旱尾呗缘膕cRNA-seq系統(tǒng)能夠大幅度提高反應(yīng)通量、降低成本，Macosko等［22］由此設(shè)計(jì)發(fā)展了單細(xì)胞高通量液滴測序（Drop-seq）。Drop-seq用納升大小的液滴包裹單個(gè)細(xì)胞和具有分子條形碼的微珠，細(xì)胞在液滴中裂解后釋放的mRNAs與微珠中的分子條形碼進(jìn)行雜交，將液滴破碎后收集mRNAs雜交物，并對其進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄從而形成mRNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，隨后對該逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行反向轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增和測序，最終使用逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物條形碼來推斷每個(gè)轉(zhuǎn)錄本的細(xì)胞來源。

微滴高通量單細(xì)胞測序（inDrop）是另一種常用的基于液滴的高通量scRNA-seq系統(tǒng)［23］，其構(gòu)建了一種條形碼水凝膠微球（barcoded hydrogel microspheres， BHM），每個(gè)BHM中包含約109個(gè)共價(jià)連接的光釋放引物，并且編碼147 456個(gè)條形碼中的一個(gè)。再使用具有四個(gè)入口的微流控裝置，將裂解緩沖液、BHM、細(xì)胞和油進(jìn)行混合，把細(xì)胞包裹成小滴，細(xì)胞封裝后在小滴中裂解，同時(shí)在合成cDNA的過程中被條形碼編碼，隨后將液滴打破使所有細(xì)胞材料混合在一起，并使用CEL-seq的方法對cDNA文庫進(jìn)行測序［13］。相較于Drop-seq，inDrop采用BHM，可以將引物固定在微珠里面，與細(xì)胞混合后，通過紫外線曝光來釋放引物，而Drop-seq的引物只能固定在微珠表面，不能從微珠中釋放，導(dǎo)致其mRNA捕獲效率較低。盡管如此，面對成千上萬的細(xì)胞數(shù)量時(shí)，Drop-seq和inDrop仍然具有高通量和低成本的優(yōu)勢。

1.3 新型單細(xì)胞測序技術(shù)

目前，大多數(shù)scRNA-seq技術(shù)都需要將細(xì)胞裂解再進(jìn)行測序，這阻礙了對相同細(xì)胞分子特征和生物學(xué)功能的分析，為了克服這一難題，Chen等［25］創(chuàng)建了Live-seq方法，可在保持細(xì)胞存活的同時(shí)對其細(xì)胞質(zhì)中的RNA進(jìn)行提取，使細(xì)胞能夠用于后續(xù)研究。該方法的關(guān)鍵技術(shù)是流體力顯微鏡技術(shù)［30］，該技術(shù)能夠在不裂解細(xì)胞的情況下，對細(xì)胞中部分細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行采集。而Live-seq通過減少提取時(shí)間、降低溫度以及預(yù)加載帶有采樣緩沖液的流體力顯微鏡探針，達(dá)到立即將提取的細(xì)胞質(zhì)液與RNase抑制劑混合的目的，并且能夠最大限度地再將提取液釋放到含有與下游RNA-seq兼容的緩沖液微液滴中，從而實(shí)施基于圖像的細(xì)胞跟蹤以用于順序提取。RNA轉(zhuǎn)錄本5′端的切換機(jī)制測序是測量少量RNA最靈敏的RNA-seq方法之一［31］，Chen的團(tuán)隊(duì)將該方法進(jìn)行優(yōu)化后，最大限度地從提取的mRNA中產(chǎn)生cDNA［32］，最終僅利用1 pg的RNA完成建庫。總之，Live-seq使scRNA-seq不再是細(xì)胞研究的終點(diǎn)，而是成為揭示細(xì)胞分子生物學(xué)特征的有力證據(jù)，為單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)提供了新的工具。

2 數(shù)據(jù)分析

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)束后通常會生成FASTQ格式的原始數(shù)據(jù)，在數(shù)據(jù)預(yù)處理過程中，細(xì)胞條形碼和UMI首先作為標(biāo)簽附加到每個(gè)cDNA讀數(shù)的前端中，該步驟常用的工具包括CellRanger［33］和STARsolo［34］等，隨后cDNA需要通過映射工具將讀數(shù)映射到參考基因組或轉(zhuǎn)錄組［35］。Engstrm等［36］系統(tǒng)性地評估了26種RNA-seq序列比對方案，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)方案在低于5個(gè)讀取覆蓋的連接處靈敏度降低，這反映了對齊算法依賴于交叉點(diǎn)覆蓋率來提高精度，然而無論連接覆蓋率的高低，基于注釋的基因組短讀核苷酸比對計(jì)劃方案都實(shí)現(xiàn)了高靈敏度。Dobin等［34］開發(fā)的STAR軟件，在映射速度方面比其他比對工具高出50倍，同時(shí)比對靈敏度和精度均有所提高，在適度的12核服務(wù)器上，每小時(shí)能夠?qū)θ祟惢蚪M進(jìn)行5.5億次2×76 bp的配對端讀取。由于讀數(shù)的映射率是反映測序數(shù)據(jù)質(zhì)量的重要指標(biāo)［37］，因此在測序技術(shù)和試驗(yàn)方案不斷發(fā)展的前提下，必須開發(fā)新的映射策略，同時(shí)比對工具也應(yīng)該提供靈活的框架來應(yīng)對新的比對挑戰(zhàn)。

預(yù)處理后每個(gè)樣本被匯編成基因/條形碼矩陣，隨后可以進(jìn)一步過濾和分析，分析scRNA-seq數(shù)據(jù)的整個(gè)工作流程包括讀取數(shù)據(jù)、去批次效應(yīng)、整合、質(zhì)量控制、基因表達(dá)定量、歸一化、特征選擇、降維、細(xì)胞聚類、擬時(shí)序分析和差異基因分析等［38］。由于scRNA-seq的局限性，包括轉(zhuǎn)錄本覆蓋的偏差、低捕獲效率和測序覆蓋率低等，在數(shù)據(jù)捕獲過程中會從破碎、死亡或與多個(gè)細(xì)胞混合的細(xì)胞中生成一部分低質(zhì)量數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)會阻礙下游的分析，并可能導(dǎo)致對數(shù)據(jù)的誤解［37］，因此，scRNA-seq數(shù)據(jù)的質(zhì)控對于識別和去除低質(zhì)量細(xì)胞至關(guān)重要。隨著單細(xì)胞測序技術(shù)的突飛猛進(jìn)，已經(jīng)開發(fā)了許多統(tǒng)計(jì)方法來處理scRNA-seq分析的不同步驟，常用的工具包包括基于R的Seurat［39］和Monocle 3［40］、基于python的Scanpy［41］等，這些工具包基于不同的算法設(shè)置參數(shù)，在進(jìn)行數(shù)據(jù)分析時(shí)，可以通過更改其中的參數(shù)設(shè)置達(dá)到適用的分析效果。隨著技術(shù)的進(jìn)步，分析軟件也在不斷更新優(yōu)化，在未來有望將單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)和其他組學(xué)相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)多組學(xué)數(shù)據(jù)的綜合分析。

3 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)在寄生蟲病防控技術(shù)研究中的應(yīng)用

3.1 在寄生蟲發(fā)育生物學(xué)研究中的應(yīng)用

寄生蟲通常被定義為寄生關(guān)系中受益的一方，與地球上其他生物相同，寄生蟲也具有生物多樣性［42］。在原蟲研究中，阿米巴滋養(yǎng)體作為單細(xì)胞原生動(dòng)物，常規(guī)的批量轉(zhuǎn)錄組測序無法揭示單個(gè)生物體的潛在變化，F(xiàn)eng等［8］使用scRNA-seq研究了單個(gè)阿米巴原蟲滋養(yǎng)體的RNA轉(zhuǎn)錄圖譜，發(fā)現(xiàn)與中國倉鼠卵巢細(xì)胞體外共孵育后，滋養(yǎng)體差異表達(dá)基因水平明顯升高，認(rèn)為滋養(yǎng)體在與中國倉鼠卵巢細(xì)胞體外共孵育時(shí)處于活躍的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)其上調(diào)基因與半胱氨酸代謝相關(guān)，并且滋養(yǎng)體在半胱氨酸缺乏的條件下吞噬作用和細(xì)胞毒性顯著減弱。該研究發(fā)現(xiàn)隱蔽的滋養(yǎng)體特異性致病性變化，提高了對阿米巴滋養(yǎng)體生物學(xué)特性和毒力變異機(jī)制的理解。

在線蟲研究方面，秀麗隱桿線蟲是研究胚胎發(fā)育、繁殖和衰老的常用模式生物，Tintori等［43］通過scRNA-seq繪制了秀麗隱桿線蟲由胚胎到16-細(xì)胞階段的細(xì)胞圖譜，并提供了交互式數(shù)據(jù)可視化工具。隨后，Lorenzo等［44］基于秀麗隱桿線蟲的scRNA-seq數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)了迭代聚類分析，成功將神經(jīng)細(xì)胞亞型與解剖學(xué)定義的神經(jīng)元類別進(jìn)行匹配，并確定了新的神經(jīng)元特異性啟動(dòng)子。此外，Taylor等［45］制作了秀麗隱桿線蟲整個(gè)神經(jīng)系統(tǒng)中所有神經(jīng)元類型的scRNA-seq圖譜，共70 296個(gè)神經(jīng)元圖譜，包括所有118個(gè)典型神經(jīng)元類別，發(fā)現(xiàn)每個(gè)神經(jīng)元類別都是由神經(jīng)肽編碼基因和神經(jīng)肽受體的不同組合定義的，這表明每種類型的神經(jīng)元在發(fā)送和接收信號方面發(fā)揮著不同的作用，這些研究聚焦于整個(gè)神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能與神經(jīng)元特異性基因表達(dá)的全面聯(lián)系，為解析神經(jīng)元特異性功能提供了理論依據(jù)。利用scRNA-seq技術(shù)，能夠獲得寄生蟲單個(gè)細(xì)胞的靶序列，進(jìn)而從物種多樣性、生殖發(fā)育多樣性和遺傳多樣性等方面了解寄生蟲的生長及發(fā)育機(jī)制。

在扁形動(dòng)物渦蟲研究中，2018年Fincher等［46］利用Drop-seq生成了66 783個(gè)地中海圓頭渦蟲（Schmidtea mediterranea）細(xì)胞的數(shù)據(jù)，共聚類出44個(gè)細(xì)胞亞群，定義了以前未知的渦蟲細(xì)胞類型，并闡明了干細(xì)胞和分化細(xì)胞間的轉(zhuǎn)換狀態(tài)，還發(fā)現(xiàn)肌肉中具有能夠提供位置信息的表達(dá)基因。渦蟲的修復(fù)能力強(qiáng)，是源于蟲體內(nèi)一種稱為neoblast（成體多能干細(xì)胞）的成體干細(xì)胞群。而neoblast也是成體渦蟲體內(nèi)唯一具有增殖和分化潛能的干細(xì)胞，能夠拯救動(dòng)物受致命輻射傷害的neoblast被命名為克隆性成體干細(xì)胞（clonogenic neoblast， cNeoblast），從而與那些無法拯救受傷動(dòng)物的neoblast相區(qū)分。Zeng等［47］針對渦蟲neoblast，利用10×Genomics大規(guī)模scRNA-seq技術(shù)發(fā)現(xiàn)一個(gè)新亞群neoblast 2，該亞群高表達(dá)PIWI-1基因和蛋白，并以保守的細(xì)胞表面蛋白（跨膜四蛋白）編碼基因1（tetraspanin 1， tspan-1）為標(biāo)志，tspan-1的RNA干擾既影響新生細(xì)胞的再集落，又影響新生細(xì)胞的動(dòng)員。重要的是，tspan-1陽性細(xì)胞在亞致死劑量的照射下存活下來，并進(jìn)行克隆性擴(kuò)增，以重新繁殖整個(gè)動(dòng)物，滿足cNeoblast的定義，這為詳細(xì)解析渦蟲體內(nèi)多能性和全身再生的潛在分子以及細(xì)胞機(jī)制打開了大門。此外，Wurtzel等［48］將渦蟲咽后切開后在不同時(shí)間點(diǎn)分離創(chuàng)口，并利用scRNA-seq獲得渦蟲傷口組織的單細(xì)胞圖譜，共619個(gè)渦蟲細(xì)胞，確定了13種不同的細(xì)胞類型，揭示了渦蟲再生的時(shí)間模型：在普通創(chuàng)傷反應(yīng)達(dá)到頂峰后的24 h內(nèi)會出現(xiàn)專門的轉(zhuǎn)錄程序，如果受傷后不需要再生，則創(chuàng)傷反應(yīng)就會下降，否則就會出現(xiàn)特定傷害反應(yīng)的表達(dá)，這些反應(yīng)涉及模式分子和neoblast相關(guān)的特異基因，針對正在再生的組織特性，損傷后約3 d，與功能性新組織相關(guān)的分化組織標(biāo)志物開始表達(dá)。研究渦蟲的再生問題，還能夠?yàn)閷?shí)現(xiàn)人類器官的再生提供數(shù)據(jù)支撐。scRNA-seq技術(shù)為繪制寄生蟲不同生命階段細(xì)胞圖譜提供技術(shù)支撐，為寄生蟲個(gè)體的研究提供強(qiáng)有力的方法，也豐富了人們對寄生蟲生物學(xué)多樣性的理解。

3.2 在寄生蟲病疫苗研發(fā)中的應(yīng)用

世界衛(wèi)生組織的數(shù)據(jù)顯示，全世界有超過3億人患有一種或多種寄生蟲病，并且寄生蟲感染每年導(dǎo)致數(shù)百萬人死亡和殘疾［49］。盡管抗寄生蟲藥物能夠有效治療寄生蟲感染，但大部分藥物并不能完全殺死寄生蟲［50］，因此預(yù)防寄生蟲的感染尤為重要。目前寄生蟲的常規(guī)控制措施包括消滅傳染源、切斷傳播途徑以及保護(hù)易感宿主［51］。利用scRNA-seq技術(shù)能夠從細(xì)胞層面表征寄生蟲的發(fā)育繁殖方式，從而開發(fā)寄生蟲相關(guān)疫苗。

錐蟲屬（Trypanosoma）隸屬于原生動(dòng)物門肉鞭動(dòng)物亞門動(dòng)鞭毛綱動(dòng)體目錐蟲科，本屬動(dòng)物統(tǒng)稱錐蟲［52］。研究顯示，布氏錐蟲（Trypanosoma brucei）必須在采采蠅的唾液腺中發(fā)育成感染哺乳動(dòng)物的后循環(huán)型錐鞭毛體，才能傳播到新的宿主中［53］。Hutchinson等［54］通過inDrop技術(shù)表征了布氏錐蟲在唾液腺中的細(xì)胞異質(zhì)性。Vigneron等［55］利用scRNA-seq技術(shù)從受布氏錐蟲感染的唾液腺中分離出2 045個(gè)不同布氏錐蟲個(gè)體的寄生蟲轉(zhuǎn)錄組，根據(jù)轉(zhuǎn)錄活性和特征以及表面被膜蛋白的表達(dá)，將轉(zhuǎn)錄組聚類為布氏錐蟲不同生長發(fā)育階段的3個(gè)細(xì)胞類群，通過在不同的細(xì)胞類群中尋找編碼表面相關(guān)蛋白的高豐度差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)了存在于后循環(huán)期蟲體細(xì)胞表面的一種顯著的非變異外殼蛋白（SGM1.7），并且抗SGM1.7抗體的研究結(jié)果顯示，該蛋白涉及B細(xì)胞抗體介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，該反應(yīng)可以在哺乳動(dòng)物感染的初始階段干擾寄生蟲的存活或分化，提示該蛋白具有作為亞單位疫苗抗原的潛力。

此外，血吸蟲在入侵宿主過程中，也會經(jīng)歷從自由生活、高度活動(dòng)的尾蚴到成蟲寄生形式的主要生理和形態(tài)轉(zhuǎn)變［56］。Wang等［57］ 利用scRNA-seq技術(shù)分析了從曼氏血吸蟲尾蚴和童蟲階段分離的細(xì)胞，共鑒定了四種干細(xì)胞類型，包括κ細(xì)胞、δ細(xì)胞、φ細(xì)胞和ε細(xì)胞，其中ε細(xì)胞特異性表達(dá)的基因eledh在尾蚴中檢測不到，但在幼蟲干細(xì)胞中是最豐富的轉(zhuǎn)錄本之一。研究表明，eledh是血吸蟲中最早發(fā)現(xiàn)的種系標(biāo)志物，并且生殖細(xì)胞可能來源于發(fā)育早期的ε細(xì)胞，這種早期增殖的細(xì)胞可能有助于寄生蟲生長和成熟所需的組織重塑。這項(xiàng)研究為理解驅(qū)動(dòng)血吸蟲繁殖和長期存活的基本機(jī)制邁出了重要一步，通過表征此處定義的干細(xì)胞群體在血吸蟲傳播、生殖發(fā)育和存活中的作用，有望研發(fā)減少寄生蟲荷蟲量，抑制寄生蟲在宿主體內(nèi)發(fā)育的新型疫苗，從而有效控制血吸蟲的廣泛傳播。

3.3 在寄生蟲病藥物研究中的應(yīng)用

scRNA-seq技術(shù)在藥物研究中的應(yīng)用包括藥物靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)、高通量藥物的篩選、藥物不良反應(yīng)機(jī)制和耐藥機(jī)制的揭示等［58］。瘧疾是由瘧原蟲引起的一種寄生蟲病，宿主經(jīng)按蚊叮咬或輸入帶瘧原蟲者的血液而感染該病，其中惡性瘧原蟲感染容易引發(fā)膿毒癥［59］。Rawat等［60］對惡性瘧原蟲在高溫（相當(dāng)于發(fā)燒）的生理應(yīng)激條件和對照條件下進(jìn)行了scRNA-seq分析，發(fā)現(xiàn)在不同條件下，雖然寄生蟲在形態(tài)上是同步的，但它們表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄組上的異質(zhì)性，其中3組細(xì)胞類群在應(yīng)激條件的刺激下上調(diào)了許多配子體標(biāo)記和調(diào)節(jié)因子的表達(dá)，它們可能與惡劣條件下瘧原蟲的脅迫適應(yīng)相關(guān)。由于應(yīng)激反應(yīng)是惡性瘧原蟲產(chǎn)生耐藥性的重要決定因素［61］，因此這項(xiàng)研究對了解瘧原蟲耐藥性的產(chǎn)生具有重要意義。青蒿琥酯（artesunate， ART）是一種抗瘧疾藥物，He等［62］利用scRNA-seq技術(shù)，全面描述了小鼠膿毒癥模型中肝臟的生物學(xué)特性，并通過對scRNA-seq數(shù)據(jù)的分析，驗(yàn)證了ART治療膿毒癥后對肝功能恢復(fù)的影響，發(fā)現(xiàn)ART治療后可以顯著降低小鼠血清中內(nèi)毒素的含量、改善肝內(nèi)皮細(xì)胞的損傷、有效抑制巨噬細(xì)胞的募集以及減輕淋巴細(xì)胞免疫功能障礙，提高了96 h內(nèi)小鼠的存活率，從而揭示了ART有效治療膿毒癥小鼠的部分作用機(jī)制。Zheng等［63］通過scRNA-seq技術(shù)發(fā)現(xiàn)，將ART與化療或免疫治療藥物聯(lián)用，能夠干預(yù)乳腺癌中腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞和癌細(xì)胞，獲得更好的治療效果，從而發(fā)現(xiàn)該藥物的不同適應(yīng)癥。

scRNA-seq技術(shù)在藥物篩選方面也具有一定優(yōu)勢，2018年，Ye等［64］結(jié)合scRNA-seq技術(shù)，開發(fā)了數(shù)字核糖核酸與基因突變測序平臺（DRUG-seq），該平臺能夠高通量的篩選藥物，同時(shí)還可以用于分析基因敲除細(xì)胞，以揭示基因和化合物的功能。最近，Xie等［65］基于scRNA-seq技術(shù)報(bào)道了組合擾動(dòng)測序技術(shù)（CP-seq），它可以同時(shí)以高度多重的方式干擾藥物組合的細(xì)胞，并執(zhí)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析，以此來表征組合藥物對單細(xì)胞的基因擾動(dòng)情況，其在尋找新的有效藥物組合方面具有巨大潛力?？傊胹cRNA-seq技術(shù)能夠從細(xì)胞層面進(jìn)一步揭示寄生蟲的耐藥機(jī)制以及抗寄生蟲藥物在治療過程中的作用機(jī)制，用于輔助新型化合物機(jī)制研究的同時(shí)，豐富藥物的臨床適應(yīng)癥范圍。另外，scRNA-seq技術(shù)大規(guī)模、自動(dòng)化、高通量、低成本的特點(diǎn)也為抗寄生蟲藥物篩選提供新的技術(shù)路線，有助于準(zhǔn)確、高效和特異地篩選藥物，加速藥物研發(fā)進(jìn)程，為治療寄生蟲病提供有效的技術(shù)支撐。

3.4 在寄生蟲病治療靶點(diǎn)鑒定中的應(yīng)用

對于具有移行功能或致病性較強(qiáng)的寄生蟲，大部分患者目前無法得到根治，因此開發(fā)新型治療手段具有重要意義。棘球蚴病主要包括囊型棘球蚴病（cystic echinococcosis， CE）和泡型棘球蚴病（alveolar echinococcosis， AE），其中AE是由多房棘球絳蟲引起的一種廣泛傳播的人畜共患病，寄生蟲通過消化道后，主要寄生在肝臟，在易感宿主中，中絳期的幼蟲可在患者體內(nèi)像腫瘤樣生長發(fā)育和浸潤性增殖，因此該病又稱為“蟲癌”［66］。Yarahmadov等［67］利用scRNA-seq技術(shù)評估了多房棘球絳蟲蟲卵經(jīng)口感染小鼠肝臟中免疫細(xì)胞的異質(zhì)性，從感染后3、10、21 d以及對照小鼠肝臟中提取CD3+ T細(xì)胞進(jìn)行scRNA-seq，最終獲得了5種不同類型T細(xì)胞。并發(fā)現(xiàn)自然殺傷T細(xì)胞對多房棘球絳蟲感染反應(yīng)的效應(yīng)機(jī)制主要與IFN-γ、TNF、IL-7和IL-18相關(guān)的信號傳導(dǎo)、細(xì)胞毒性途徑以及表達(dá)顆粒酶b和殺傷細(xì)胞凝集素的受體有關(guān)。而免疫抑制相關(guān)的基因包括免疫檢查點(diǎn)（PD-1/PD-L1）和嘌呤能信號（ENTPD1/ADORA2A），它們在感染過程中也極有可能通過調(diào)節(jié)自然殺傷T細(xì)胞的功能從而將慢性疾病期間的免疫抑制轉(zhuǎn)化為促炎反應(yīng)，抑制寄生蟲生長，這些結(jié)果為AE患者免疫調(diào)節(jié)治療靶標(biāo)的選擇提供了依據(jù)。

由細(xì)粒棘球絳蟲引起的CE呈全球性分布，其在中國西北部、中東、北非和南美洲的牧區(qū)具有高感染率［68］。但大部分CE患者會錯(cuò)過最佳手術(shù)時(shí)期，對于晚期病例，姑息性手術(shù)和抗感染治療均不理想［69］，因此亟待開發(fā)新型治療手段。Yasen等［70］對四名CE患者的外周血、病灶周圍肝組織和鄰近正常肝組織的免疫細(xì)胞進(jìn)行scRNA-seq，共鑒定了23種細(xì)胞類群，發(fā)現(xiàn)固有淋巴細(xì)胞的基因表達(dá)存在顯著差異，其在病灶周圍肝組織中差異調(diào)控的基因主要富集于白細(xì)胞活化、toll樣受體信號通路、NF-κB信號通路和免疫系統(tǒng)過程負(fù)調(diào)控方面。此外，潛在的抑制性免疫檢查點(diǎn)基因NKG2A及其配體HLA-E在病灶中的表達(dá)顯著高于相應(yīng)的鄰近正常肝組織，證明了該免疫檢查點(diǎn)在CE病變微環(huán)境中的重要抑制作用。隨后，Jiang等［71］也利用scRNA-Seq揭示了人體CE病變微環(huán)境中浸潤免疫細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性，首次發(fā)現(xiàn)CE患者后期特異性出現(xiàn)的巨噬細(xì)胞群，并通過高表達(dá)基因?qū)⑵滂b定為SPP1+巨噬細(xì)胞。該細(xì)胞類型高表達(dá)許多免疫抑制和促血管生成基因，與免疫微環(huán)境中的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞群體相似，有助于腫瘤細(xì)胞免疫逃逸并促進(jìn)腫瘤血管生成。這些在CE發(fā)展過程中對免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)具有重要功能的分子，均有望成為CE的潛在治療靶點(diǎn)。

3.5 對寄生蟲病診斷技術(shù)的推進(jìn)

寄生蟲病的診斷需要高度敏感和特異性的檢查方法，其中最可靠的方法是檢測和鑒定到感染的病原體，而寄生蟲的鑒定通常涉及其流行病學(xué)，以及對蟲種和亞種的區(qū)分［72］。臨床醫(yī)學(xué)上，僅僅根據(jù)流行病學(xué)和臨床癥狀很難確診某種寄生蟲病，需要借助一些實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)才能準(zhǔn)確判斷病原，目前臨床上常用的實(shí)驗(yàn)室診斷方法有常規(guī)形態(tài)學(xué)診斷、血清學(xué)診斷和分子生物學(xué)診斷。利用scRNA-seq技術(shù)也能在診斷寄生蟲病方面發(fā)揮作用，一方面，scRNA-seq技術(shù)能夠發(fā)現(xiàn)寄生蟲中特異性表達(dá)的基因以及具有異質(zhì)性的細(xì)胞類型，例如Reid等［73］利用scRNA-seq技術(shù)揭示了瘧原蟲中隱藏的轉(zhuǎn)錄變異，發(fā)現(xiàn)一些細(xì)胞似乎具有在無性細(xì)胞和配子細(xì)胞之間的中間轉(zhuǎn)錄組。Louradour等［74］通過scRNA-seq技術(shù)鑒定了利什曼原蟲在基因轉(zhuǎn)錄上具有獨(dú)特性的前鞭毛體群體，這些群體的數(shù)量在γ輻射后的每個(gè)親本系中顯著增加，并且其特定的減數(shù)分裂基因同源基因被發(fā)現(xiàn)上調(diào)，其中包括祖先配子HAP2。這些研究為寄生蟲免疫學(xué)診斷和核酸診斷提供了潛在靶點(diǎn)。另一方面，Xue等［75］利用scRNA-seq技術(shù)對5 400多個(gè)弓形蟲的速殖子和緩殖子兩個(gè)階段進(jìn)行了研究，構(gòu)建了第一個(gè)全面的弓形蟲無性發(fā)育階段的單細(xì)胞圖譜，揭示了AP2IX-1是一種新的轉(zhuǎn)錄因子，結(jié)合瞬時(shí)表達(dá)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)AP2IX-1在分化過程中參與了表面抗原譜系的重塑，并且可能在控制弓形蟲性別分化中起關(guān)鍵作用。同時(shí)發(fā)現(xiàn)每種弓形蟲的基因組中都存在120多個(gè)與SAG1相關(guān)的基因，它們產(chǎn)生的一整套蛋白質(zhì)可能會“隱藏”這些寄生蟲，使其不被免疫系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)。這些結(jié)果表明寄生蟲在感染宿主期間具有免疫逃避機(jī)制，在大規(guī)模測序中，這些免疫逃避和其他功能相關(guān)分子無法全部檢測和鑒定，但scRNA-seq技術(shù)具有更高的敏感性，能夠捕捉每個(gè)細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄組信息，從而特異的提供寄生蟲細(xì)胞中基因表達(dá)的詳細(xì)信息，預(yù)計(jì)未來宿主細(xì)胞和寄生蟲的單細(xì)胞共轉(zhuǎn)錄測序?qū)⒊蔀檫M(jìn)一步了解并診斷或鑒別寄生蟲亞種的潛在有效方法。

3.6 在寄生蟲親緣關(guān)系分析和進(jìn)化研究中的應(yīng)用

理解寄生蟲親緣關(guān)系對于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和生態(tài)學(xué)等領(lǐng)域都具有重要的意義，有助于認(rèn)識不同寄生蟲之間的演化關(guān)系，從而更好地進(jìn)行分類和建立系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)一步揭示物種之間的演化歷史和彼此之間的親緣關(guān)系。PlanMine提供了當(dāng)前扁形動(dòng)物門可利用的序列庫，Rozanski等［76］為其添加了來自各種其他扁蟲的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，并提供了一個(gè)系統(tǒng)發(fā)育的交互網(wǎng)絡(luò)，為扁蟲生物學(xué)的比較分析提供資源，以期實(shí)現(xiàn)有意義的物種間比較。

頂復(fù)門（Apicomplexa）是原生動(dòng)物門中的一門，包括形態(tài)和生態(tài)上不同的原生動(dòng)物，例如隱孢子蟲、球蟲和血孢子蟲等［77］。Janouskovec等［78］利用scRNA-seq研究了十種不同的頂復(fù)門寄生蟲，分析發(fā)現(xiàn)頂復(fù)門寄生蟲沒有近似的共同祖先，因此從進(jìn)化的角度來看，它們不是一個(gè)自然的群體，相反，它們相似的外觀和生活方式至少在三個(gè)獨(dú)立的時(shí)期內(nèi)進(jìn)化。并且在后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)，至少有三個(gè)頂復(fù)門譜系喪失了它們的隱蔽葉綠體，該研究結(jié)果為葉綠體在生命演化中的重要性提供了新的觀點(diǎn)。Mathur等［79］使用單細(xì)胞測序表征了部分研究很少的頂復(fù)門寄生蟲的基因組和轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)先前在頂復(fù)門中分類的兩個(gè)屬（Piridium和Platyproteum），能夠在系統(tǒng)發(fā)育分析中形成單獨(dú)的分支譜系，兩者都保留了具有與頂復(fù)門生物相似的基因組和代謝特征的隱性質(zhì)體，該譜系對光合作用的趨同性喪失和向寄生轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致多個(gè)譜系中出現(xiàn)了表面上相似的動(dòng)物寄生蟲。

隨后，Mathur等［80］對未被充分研究的gregarine譜系進(jìn)行了scRNA-seq，構(gòu)建了一個(gè)包含Apicomplexa、Chrompodellids和Squirmida（ACS分支）可用測序數(shù)據(jù)集的系統(tǒng)發(fā)育樹，利用這些數(shù)據(jù)集，Mathur團(tuán)隊(duì)詳細(xì)檢查了弓形蟲空間蛋白質(zhì)組學(xué)顯示在頂端體中的162種蛋白質(zhì)的進(jìn)化分布，證實(shí)了在光合作用喪失后保留的整體代謝途徑具有趨同趨勢，揭示了特定譜系中質(zhì)體減少程度的差異，同時(shí)發(fā)現(xiàn)質(zhì)體基因組的丟失很常見，并且意外地發(fā)現(xiàn)了許多譜系和物種特異性的質(zhì)體蛋白，這表明進(jìn)化創(chuàng)新和新功能的存在可能賦予這些神秘的細(xì)胞器尚未發(fā)現(xiàn)的新功能和代謝能力。

此外，Lahr等［81］提出了表殼目（Arcellinida）的全面系統(tǒng)發(fā)育重建，通過scRNA-seq從19個(gè)具有代表性的有殼變形蟲分類群中獲得轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，由此生成的進(jìn)化樹得到強(qiáng)有力的支持，首次揭示了該群體最深的譜系。利用數(shù)據(jù)集，Lahr團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了祖先形態(tài)的重建，得到了與現(xiàn)存新元古代瓶形微體化石非常相似的假設(shè)祖先。這些結(jié)果為表殼目創(chuàng)造了一個(gè)堅(jiān)實(shí)的系統(tǒng)發(fā)育骨干，并刺激了對該群體相關(guān)化石記錄的重新解釋，可能闡明真核生物早期進(jìn)化中的關(guān)鍵事件。Kang等［82］利用scRNA-seq技術(shù)對61個(gè)變形蟲類群進(jìn)行采樣，分析顯示出變形蟲存在兩個(gè)主要分支（Discosea和Tevosa），認(rèn)為變形蟲的主要宏觀進(jìn)化模式是由多階段生命周期（包括鞭毛、有性和子實(shí)體）的同源性特征的平行喪失所導(dǎo)致，而不是獨(dú)立獲得的相似特征。總之，寄生蟲親緣關(guān)系的研究為人們提供了深入了解生命演化、生物進(jìn)化以及生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)功能的機(jī)會，為相關(guān)領(lǐng)域的科研和實(shí)踐提供了基礎(chǔ)。

4 小結(jié)與展望

scRNA-seq方法自2009年首次引入以來，為揭示組織細(xì)胞組成、細(xì)胞異質(zhì)性、轉(zhuǎn)錄組動(dòng)力學(xué)和基因之間的調(diào)控關(guān)系等開辟了一條新的途徑，隨著高效和低成本技術(shù)的出現(xiàn)，scRNA-seq技術(shù)的商業(yè)化平臺已經(jīng)足以建立數(shù)千個(gè)細(xì)胞的測序文庫，單細(xì)胞技術(shù)至此已經(jīng)作為標(biāo)準(zhǔn)程序使用，廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、寄生蟲學(xué)和臨床等研究領(lǐng)域。然而，目前單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組技術(shù)仍然面臨若干重大挑戰(zhàn)：首先，大部分測序技術(shù)通過poly（A）尾構(gòu)建文庫，其主要檢測局限于mRNA和部分帶ploy（A）尾的長鏈非編碼RNA，對于大量存在的非ploy（A）尾長鏈非編碼RNA的檢測還存在一定困難；第二，scRNA-seq技術(shù)基于組織解離進(jìn)行，捕獲單個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的同時(shí)會丟失其空間位置信息，而揭示組織細(xì)胞的空間位置分布對于疾病理解具有重要意義，因此亟需發(fā)展單細(xì)胞與空間多組學(xué)聯(lián)合研究方法；第三，單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)通常來自于多次試驗(yàn)，由于樣本、實(shí)驗(yàn)操作和技術(shù)平臺等因素的不同，測序數(shù)據(jù)總是存在差異性。因此在進(jìn)行數(shù)據(jù)分析時(shí)，去批次效應(yīng)具有重要意義，但當(dāng)前常用的評測批次效應(yīng)的定性或者定量算法工具均存在一定局限性。

盡管如此，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)仍是發(fā)現(xiàn)新的診斷或治療靶點(diǎn)強(qiáng)有力的工具，其在寄生蟲研究領(lǐng)域中揭示了部分寄生蟲的生長發(fā)育圖譜、探析了同屬寄生蟲不同的種屬基因組、表征了宿主和寄生蟲如何相互適應(yīng)的基因表達(dá)譜、信號傳導(dǎo)通路和代謝途徑。總而言之，隨著科技及各種單細(xì)胞組學(xué)工具的發(fā)展，scRNA-seq技術(shù)能夠更好地應(yīng)用于寄生蟲學(xué)研究，為理解寄生蟲發(fā)育與致病機(jī)制，防治寄生蟲病提供更好的技術(shù)支撐。

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（編輯 白永平）