摘 要： 旨在獲得弓形蟲包囊，并對包囊傳代保種，將其作為弓形蟲慢性感染相關(guān)試驗研究的感染性材料。本研究用四組不同數(shù)量的PRU株速殖子腹腔接種KM、ICR、BALB/c、C57BL/6四個品系小鼠，感染40 d后檢測存活小鼠血清中抗體，取血清陽性小鼠各組織檢查并分離包囊；以包囊灌胃感染不同品系小鼠，探究包囊傳代劑量及最佳的傳代小鼠品系。結(jié)果成功在感染低劑量的C57BL/6小鼠腦組織內(nèi)分離得到包囊。包囊傳代ICR小鼠死亡率低，且腦內(nèi)成囊數(shù)顯著多于其他品系小鼠（Plt;0.05）。C57BL/6小鼠腹腔接種10～50個弓形蟲速殖子可存活并在腦內(nèi)形成包囊；以20～50個弓形蟲包囊灌胃感染ICR小鼠，可擴增得到大量包囊。

關(guān)鍵詞： PRU株；速殖子；包囊；慢性感染；包囊傳代；小鼠模型

中圖分類號：S852.72

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）10-4620-10

收稿日期：2024-01-02

基金項目：上?？莆椖浚?1N31900700） ；上海自然科學基金（22ZR1476000）;" 上海市科技興農(nóng)項目（2022-02-08-00-12-F01085）

作者簡介：李瑞芳（1997-），女，山西靜樂人，碩士生，主要從事弓形蟲新型分子檢測技術(shù)研究，E-mail：929503606@qq.com

*通信作者： 王 權(quán)，主要從事弓形蟲天然免疫逃避機制研究，E-mail： wangquan@shvri.ac.cn

Experimental Study on the Production of Cysts in Mice Infected with Toxoplasma gondii

Tachyzoites of PRU Strain

LI" Ruifang1， ZHANG" Manyu1， SUN" Qing1， DU" Jingying1， JIANG" Wei1， LI" Zengqiang2， XIA" Luming

2， WANG" Quan1*

（1.Shanghai Veterinary Research Institute， CAAS， Shanghai 200241，" China;

2.Shanghai Animal

Disease Control Center， Shanghai 201103，" China）

Abstract：" This experiment was designed to obtain Toxoplasma cysts， which are often used as infectious materials in experimental studies related to chronic infection of Toxoplasma gondii， and to search for the most suitable mouse model for cysts passage. In this study， mice with KM， ICR， BALB/c and C57BL/6 strains were intraperitoneally inoculated with different numbers of tachyzoites of PRU strains. After 40 days of infection， antibodies in the serum of surviving mice were detected， and cysts were examined and isolated from the tissues of seropositive mice. Different strains of mice were infected by cyst intragastric administration to explore the cysts passage dose and the best passage mouse model. We successfully isolated cysts from the brains of C57BL/6 mice infected with low doses of Toxoplasma tachyzoites. When passing cysts， ICR mice had low mortality and significantly more cysts in the brain than other strains （Plt;0.05）. C57BL/6 mice can survive and form cysts in the brain when 10-50 tachyzoites are intraperitoneally inoculated; A larger number of toxoplasma cysts could be obtained by intragastric infecting ICR mice with 20-50 cysts.

Key words： PRU strain; tachyzoite; cysts; chronic infection; cyst passage; mouse model

*Corresponding author：" WANG Quan， E-mail： wangquan@shvri.ac.cn

剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii）是專性胞內(nèi)寄生原蟲，是最重要的食源性人畜共患病病原體之一，幾乎可以感染包括人類在內(nèi)的所有溫血動物［1］。弓形蟲有三個感染階段，分別是速殖子、包囊及卵囊，三者可相互轉(zhuǎn)化［2，3］。人和動物可通過食入含速殖子、包囊的肉類或被卵囊污染的土壤、水源及食物而感染弓形蟲，引起弓形蟲眼病、肺炎、腦炎等疾病，甚至威脅生命［4］。根據(jù)對小鼠致病力差異將弓形蟲分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型，Ⅰ型蟲株致病力最強，Ⅲ型致病力最低，主要引起小鼠神經(jīng)癥狀，而Ⅱ型蟲株感染宿主，免疫系統(tǒng)耐過后轉(zhuǎn)為慢性感染階段，所有速殖子都轉(zhuǎn)化為緩殖子，在組織內(nèi)形成包囊，代表蟲株是ME-49株和PRU株［5，6］。

包囊可用于研究弓形蟲慢性感染引起的組織病理學變化、包囊的生物學特性、免疫學特征，以及驗證和評估弓形蟲疫苗的有效性［7-12］。由弓形蟲速殖子感染小鼠獲得包囊的過程困難，當速殖子經(jīng)灌胃途徑接種小鼠時，因其抵抗力弱，在經(jīng)過胃部時會被胃蛋白酶及胃酸消化殺滅［13］；經(jīng)腹腔注射途徑感染時，其引起的急性感染會導(dǎo)致較高的死亡率，劉俊燕等［14］用弓形蟲Fukaya株速殖子腹腔感染昆明小鼠，在藥物治療下，小鼠死亡率仍達到30%，且成囊率很低。Christiansen等［15］用肌管細胞體外誘導(dǎo)培養(yǎng)速殖子也獲得了弓形蟲包囊，但該過程需要無菌且精確調(diào)控誘導(dǎo)的培養(yǎng)條件，從細胞內(nèi)接種速殖子到包囊成熟需持續(xù)培養(yǎng)35 d，且所產(chǎn)生的包囊在4 ℃保存7 d活力即有所下降，因此還需探尋更好的用速殖子產(chǎn)生包囊的有效途徑。口服接種包囊感染小鼠更易成功獲得包囊擴增，包囊的兩層囊壁賦予其較強的抵抗力，可保護其內(nèi)含有的成千上萬緩殖子免受胃酸影響，并確保在小腸與膽鹽和胰蛋白酶接觸時緩殖子可以排出，完成感染，通過體液循環(huán)在腦等部位形成包囊，數(shù)量擴增［16］。目前，研究者一般采用包囊接種小鼠實現(xiàn)包囊的保存［17］，但需要每隔一段時間進行轉(zhuǎn)接種和長時間飼養(yǎng)動物，且可能因動物意外死亡而致包囊傳代終結(jié)?；谒僦匙涌审w外培養(yǎng)及液氮冷凍保存的特點，為使獲得包囊的方法更簡便及穩(wěn)定，建立速殖子感染小鼠產(chǎn)生包囊及包囊體內(nèi)傳代擴增的系統(tǒng)性小鼠模型是十分必要的。

為了確定不同數(shù)量速殖子、不同小鼠品系對PRU株速殖子感染小鼠形成包囊的影響，以及實現(xiàn)包囊傳代擴增特開展了本試驗，以求為后續(xù)研究儲備生物材料，奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 蟲株、細胞及實驗動物

弓形蟲PRU株速殖子、非洲綠猴腎細胞（Vero）由本實驗室保存。SPF級6～8周齡雌性KM小鼠、ICR小鼠、BALB/c小鼠、C57BL/6小鼠購自上海杰思捷實驗動物有限公司。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰酶購自賽默飛世爾科技公司；青鏈霉素、谷氨酰胺、希夫試劑（Schiff試劑）、羊抗小鼠IgG-HRP購自北京索萊寶科技有限公司；淋巴細胞分離液購自北京達科為生物技術(shù)有限公司，血液組織細胞DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，DL2000 DNA Marker購自寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，離心機為湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司產(chǎn)品，細胞培養(yǎng)箱、超凈臺、PCR儀為賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品，水浴鍋為上海精宏實驗設(shè)備有限公司產(chǎn)品，顯微鏡為尼康公司產(chǎn)品。

1.3 蟲株復(fù)蘇、培養(yǎng)及計數(shù)

將凍存的PRU蟲株從液氮罐中取出，迅速置于37 ℃恒溫水浴鍋中融化，離心棄去上清凍存液，沉淀用生理鹽水重懸，顯微鏡下觀察有無活蟲及蟲體活力。重懸液腹腔接種空白KM小鼠，待小鼠出現(xiàn)被毛雜亂、精神沉郁等臨床癥狀時斷頸處死，取腹水于顯微鏡下觀察，傳代3次，收集小鼠腹水并純化速殖子，將純化的速殖子加入預(yù)先培養(yǎng)至80%的Vero細胞中，用含2%胎牛血清的維持培養(yǎng)基進行體外培養(yǎng)。

當在細胞內(nèi)觀察到大量呈菊花樣的速殖子且有部分速殖子逸出細胞時用細胞刮板刮下，經(jīng)1 mL注射器針頭反復(fù)抽吸破碎細胞，使速殖子全部釋放，對速殖子進行計數(shù)。吸取0.1 mL重懸液到96孔細胞培養(yǎng)板（單孔面積S =0.32 cm2）中，靜置30 min待速殖子全部沉降到孔底。于40×物鏡下沿孔的十字中軸線計數(shù)多個視野，取平均值，以平均值乘以細胞培養(yǎng)板單孔面積除以實際視場面積計數(shù)速殖子量，40×物鏡下常用視場數(shù)目鏡的視場面積見表1。

1.4 PRU速殖子感染不同品系小鼠

以不同數(shù)量的PRU株速殖子分別腹腔接種KM小鼠、ICR小鼠、BALB/c小鼠、C57BL/6小鼠，分組如表2。每日觀察，記錄小鼠病癥出現(xiàn)日期、持續(xù)時間及死亡日期，連續(xù)觀察40 d，尾尖采血，用間接ELISA檢測血清中抗體，綜合評價后確定PRU株速殖子感染產(chǎn)生包囊的最佳小鼠品系，間接ELISA步驟如下：以原核表達的弓形蟲表面抗原SAG1與SAG2以1∶2的比例每孔0.8 μg于4℃冰箱過夜包被ELISA板；1×PBST洗滌3次，每次5 min；以1%明膠，每孔200 μL，37℃溫箱封閉2 h；1×PBST洗滌3次，每次5 min；將小鼠血清用含5% FBS的PBST稀釋液1∶200稀釋，每孔100 μL，37℃溫箱孵育1.5 h；1×PBST洗滌3次，每次5 min；將HRP標記的羊抗鼠IgG用稀釋液1∶20 000稀釋后每孔200 μL于37℃孵育1 h；1×PBST洗滌5次，每次5 min；避光條件下每孔加入100 μL顯色液，37℃孵育10～15 min后每孔加入50 μL終止液（20%的H2SO4）終止反應(yīng)，用酶標儀讀取OD450 nm。

1.5 慢性感染小鼠組織弓形蟲包囊檢測

將“1.4”中試驗結(jié)束后存活且弓形蟲血清陽性的小鼠斷頸處死，取出心、肝、脾、肺、腎、腦、胸肌及大腿肌肉，置于2mL離心管中，使用天根細胞、組織、血液DNA提取試劑盒提取DNA，用王權(quán)等［18］建立的巢式PCR方法從DNA中擴增433 bp的弓形蟲ITS1-5.8rDNA-ITS2基因片段，驗證小鼠是否慢性感染成功及確定包囊主要分布的組織。引物序列及反應(yīng)程序見表3、表4。

1.6 腦組織包囊分離純化

對文獻 ［19］中淋巴細胞分離液法稍作改進，將腦組織放入玻璃勻漿器底部，分次加入共5 mL PBS（pH =7.2）反復(fù)充分研磨。將腦勻漿均分加入兩支15 mL離心管中，用5 mL吸管吸取等量淋巴細胞分離液，伸至離心管管底，緩慢加入，使腦勻漿浮于淋巴細胞分離液上層，緩慢取出吸管，3 500 r·min-1離心30 min后保留下層沉淀并稀釋至一定體積，取10 μL于顯微鏡下觀察包囊形態(tài)后用希夫酸染色再次鑒定。

1.7 包囊傳代

1.7.1 不同品系小鼠傳代包囊能力的研究

包囊計數(shù)，分別取不同數(shù)量（5、10、25、50個）包囊灌胃感染不同品系小鼠（KM小鼠、ICR小鼠、BALB/c小鼠、C57BL/6小鼠），每組3只，每日記錄小鼠狀態(tài)，40 d后尾尖采血，間接ELISA檢測血清中弓形蟲抗體，抗體陽性小鼠斷頸處死后取腦組織檢查并計數(shù)包囊。

1.7.2 體外保存對包囊感染力的影響

將包囊懸液計數(shù)之后4℃保存40 d，以5、10、25、50個灌胃感染KM小鼠，并以新鮮分離包囊為對照，評價體外保存是否會對包囊感染力產(chǎn)生影響。

1.8 C57BL/6小鼠接種速殖子后包囊產(chǎn)生時間的監(jiān)測

新鮮制備的速殖子懸液，以每只小鼠50個速殖子腹腔接種，第12天開始，逐日處死一只，取腦組織觀察有無包囊，監(jiān)測接種速殖子后包囊最早產(chǎn)生時間。

1.9 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理使用Graphpad Prism 8.0軟件，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 PRU速殖子感染不同品系小鼠

因為不同品系小鼠對弓形蟲感染的易感性及抵抗力不同，以不同數(shù)量速殖子感染不同品系小鼠，觀察其臨床癥狀及存活情況，從而確定穩(wěn)定的感染模型的條件。本試驗以四組不同數(shù)量的速殖子腹腔接種四種品系小鼠，結(jié)果顯示：所有感染小鼠均出現(xiàn)被毛松豎、精神沉郁、腹腔凹陷等典型癥狀。且在感染后7～16 d內(nèi)陸續(xù)死亡，以每只10～500個速殖子腹腔接種的KM小鼠、ICR小鼠、BALB/c小鼠均不能存活，高劑量100、500個速殖子·只-1鼠腹腔接種的C57BL/6小鼠也未能存活，但低劑量10、50個速殖子·只-1鼠腹腔接種的C57BL/6小鼠（C3組與C4組）悉數(shù)存活。為了明確低劑量接種鼠存活不是因為未感染上而存活，在感染40 d后，對存活小鼠采血，分離血清，用間接ELISA檢測血清中弓形蟲抗體，結(jié)果見表5，存活小鼠血清弓形蟲抗體均為陽性，證明感染成功。

各試驗組小鼠生存曲線（如圖1）顯示同一品系小鼠隨著接種速殖子數(shù)量增多死亡時間縮短；ICR小鼠死亡進程最快，與KM小鼠無顯著差異，BALB/c小鼠死亡進程稍慢于前兩者，抵抗力較強。C57BL/6小鼠死亡進程顯著慢于其他品系小鼠（見圖2），對速殖子腹腔感染抵抗力最強。

2.2 感染小鼠各組織中弓形蟲包囊PCR檢測

巢式PCR檢測小鼠各組織中的弓形蟲DNA，以確定包囊產(chǎn)生的主要組織，結(jié)果（如圖3）顯示腦及胸肌呈陽性，其余組織呈陰性，且腦組織條帶較亮。表明PRU株弓形蟲慢性感染小鼠，包囊主要形成于腦組織內(nèi)，部分肌肉組織中也有少量包囊生成。

2.3 腦組織包囊分離與純化

未純化腦勻漿在顯微鏡下觀察時包囊呈不透明、深色、圓形，大小略有差異，見圖4。用淋巴細胞分離液法純化后可在顯微鏡下觀察到典型的包囊形態(tài)——大量的緩殖子由一層透亮且堅韌的囊壁包裹，見圖5（左）。經(jīng)希夫酸染色后，包囊內(nèi)緩殖子中的直鏈淀粉被染成紅色，包囊呈紅色團塊，見圖5（右）。慢性感染成功的C57BL/6小鼠腦內(nèi)平均產(chǎn)包囊數(shù)為68個·只-1，數(shù)量較少，仍需要對包囊進行擴增。

2.4 包囊傳代

2.4.1 包囊傳代最佳小鼠品系的確定

不同品系小鼠口服接種包囊后腦組織內(nèi)產(chǎn)包囊能力不同，為確定產(chǎn)生包囊數(shù)最多的小鼠品系及感染量，本試驗以不同數(shù)量包囊感染不同品系小鼠，結(jié)果顯示：存活小鼠血清中抗體檢測均呈陽性，腦組織包囊數(shù)量如圖6。C57BL/6小鼠僅灌胃5個包囊組存活1只；KM小鼠僅灌胃5個包囊組存活；BALB/c小鼠雖全數(shù)存活，但腦內(nèi)包囊數(shù)量少；ICR小鼠存活率高且腦內(nèi)包囊數(shù)極顯著高于其他品系小鼠。

2.4.2 體外保存對包囊感染力的影響

“2.4.1”中顯示KM小鼠對灌胃途徑高劑量新鮮包囊感染敏感，高劑量包囊極易導(dǎo)致KM小鼠死亡，而此試驗中以4 ℃保存40 d的包囊感染KM小鼠后，小鼠全部存活，且接種5個包囊的小鼠抗體均呈陰性，腦內(nèi)也無包囊產(chǎn)生，如表6。由此可見，包囊于4 ℃保存40 d之后部分包囊活力降低甚至失活，造成少量包囊接種時感染失敗的現(xiàn)象。

2.5 C57BL/6小鼠感染速殖子后產(chǎn)生包囊時間的監(jiān)測

基于各小鼠個體差異，處死小鼠取腦之前對所有試驗小鼠采血檢測血清中抗體，確保每次剖殺的都是陽性小鼠，監(jiān)測時間點與結(jié)果見表7，最早于第19天發(fā)現(xiàn)包囊，但包囊體積小，包囊壁模糊、折射率低，部分包囊形態(tài)未發(fā)育完全，如圖7。

3 討 論

有多項研究表明ICR小鼠適用于包囊感染小鼠的研究［20］，但關(guān)于速殖子腹腔感染產(chǎn)生包囊的系統(tǒng)性研究幾乎沒有，本試驗對影響速殖子感染小鼠產(chǎn)生包囊的各因素進行了研究，確定了小鼠品系、接種劑量，成功由PRU株速殖子腹腔接種小鼠得到包囊，發(fā)現(xiàn)包囊主要產(chǎn)生于腦組織，其他組織不易檢出，這與其他研究者的研究是相符合的［6，21］，驗證了包囊傳代的最佳小鼠品系，確定了包囊傳代的感染量。此外還監(jiān)測了包囊最早產(chǎn)生時間，與王林等［22］觀測到的時間接近。

實驗動物遺傳特性與實驗應(yīng)用效果的相關(guān)性早已引起國內(nèi)外學者的重視，不同品系具有不同等位基因，各基因型動物對外來刺激有不同反應(yīng)［23］。本試驗使用的小鼠中，KM小鼠與ICR小鼠是封閉群（遠交系）小鼠，均由瑞士Swiss小鼠選育而成，雜合率高，群體基因頻率基本穩(wěn)定，個體存在差異性，弓形蟲易感并呈急性發(fā)作［23-24］，因此其感染速殖子后癥狀發(fā)生快、死亡時間短；BALB/c小鼠與C57BL/6小鼠是近交系小鼠，對弓形蟲易感性較弱，感染速殖子后死亡進程緩慢，抵抗力較強。與其他品系小鼠相比，腹腔感染速殖子時，C57BL/6小鼠抵抗力最強，且在存活小鼠腦內(nèi)獲得包囊。萬民生等［25］的試驗數(shù)據(jù)顯示弓形蟲速殖子在C57BL/6小鼠腹腔內(nèi)繁殖力低，這也是C57BL/6小鼠可以耐過低劑量速殖子感染產(chǎn)生包囊的原因。而本試驗中在相同飼養(yǎng)環(huán)境中的同為近交系的BALB/c小鼠腹腔接種速殖子后無一存活，因其具有生命后期腫瘤發(fā)生率高，且易患肺炎，對飼養(yǎng)條件更為苛刻等特點，我們認為其接種速殖子后存活并產(chǎn)生包囊的概率小于C57BL/6小鼠。

口服和腹腔感染激發(fā)免疫反應(yīng)的途徑不同，因此不同感染途徑的小鼠對弓形蟲易感性表現(xiàn)出顯著差異［26］。本研究中，腹腔感染成功獲得包囊的C57BL/6小鼠在口服感染弓形蟲包囊時表現(xiàn)出極高的死亡率，這與其他研究者的試驗結(jié)果一致［24］。包囊經(jīng)口感染導(dǎo)致C57BL/6小鼠回腸絨毛和黏膜細胞大量壞死，最終死于腸炎，因此研究人員常將C57BL/6小鼠作為弓形蟲包囊經(jīng)口感染的腸炎小鼠模型［27］。主要組織相容性（MHC）等位基因是小鼠和人類對早期感染的抵抗力和易感性的重要決定因素，也控制著弓形蟲感染后期囊腫數(shù)和腦炎的發(fā)展［28-29］。本試驗對各試驗組小鼠腦內(nèi)產(chǎn)生的包囊進行計數(shù)，發(fā)現(xiàn)不同品系小鼠產(chǎn)生包囊數(shù)量具有明顯差異。

蟲株、蟲株傳代次數(shù)和蟲體感染階段、蟲體活力、攻蟲量、途徑和攻蟲后時間不同，小鼠的臨床癥狀、病理改變亦有所不同［30］。試驗中發(fā)現(xiàn)包囊感染力隨著保存時間下降，這可能與包囊在保存過程中囊壁破裂，緩殖子逸出有關(guān)［31］。緩殖子失去包囊囊壁的保護，無法抵抗胃蛋白酶及胃酸消化，導(dǎo)致感染失敗，因此包囊分離純化后應(yīng)盡快傳代。另外我們還發(fā)現(xiàn)，不同感染途徑下同一品系小鼠感染包囊的臨床表現(xiàn)也不同，比較了灌胃和腹腔接種包囊，灌胃組小鼠出現(xiàn)癥狀比腹腔注射組早，原因可能與胃酸消化包囊囊壁，使緩殖子更快在腸腔逸出完成感染有關(guān)。但腹腔注射對包囊液要求較高，需保證無菌、純化度高、含組織碎屑少，否則會引起腹膜炎，導(dǎo)致小鼠死亡。有研究還表明不同性別的小鼠對弓形蟲包囊的易感性及感染后的死亡率也不同［26，30］，之后可對此開展進一步研究。

4 結(jié) 論

本試驗以不同數(shù)量速殖子腹腔感染不同品系小鼠，發(fā)現(xiàn)C57BL/6小鼠可以抵抗10～50個速殖子感染并主要在腦內(nèi)產(chǎn)生包囊，且包囊最早產(chǎn)生于感染后第19天，但發(fā)育并不完全。以包囊經(jīng)灌胃途徑感染不同品系小鼠，發(fā)現(xiàn)ICR小鼠存活率高且腦內(nèi)產(chǎn)生包囊數(shù)量高，是包囊傳代的最佳小鼠品系。此外，還發(fā)現(xiàn)體外保存會降低包囊的活力。本試驗系統(tǒng)性地探索了產(chǎn)生及傳代包囊的方法，為研究者獲得感染性材料提供了指導(dǎo)。

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（編輯 白永平）